超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定生活飲用水中49 種藥物及5 種代謝物

王 碩， 張向明， 張 晶， 邵 兵， 李書明*

（1. 朝陽(yáng)區(qū)疾病預(yù)防控制中心，北京100021；2. 北京市疾病預(yù)防控制中心，食物中毒診斷溯源技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100013）

近年來(lái)，藥品和個(gè)人護(hù)理品（PPCPs）作為環(huán)境新型污染物受到了廣泛關(guān)注。據(jù)統(tǒng)計(jì)，現(xiàn)有超過(guò)3 000 種藥物用于人類醫(yī)療和畜牧養(yǎng)殖［1］。我國(guó)是藥品生產(chǎn)和使用大國(guó)，尤其是抗生素類藥物，據(jù)報(bào)道2003 年抗生素的產(chǎn)量突破了2 萬(wàn)噸［2］。這些藥物使用后，經(jīng)動(dòng)物排泄、廢水處理等不同途徑進(jìn)入環(huán)境［3］，可能會(huì)引發(fā)致癌、致畸等一系列問(wèn)題。目前在飲用水［4］、生活污水［5］、市政用水［6］和地表水［7，8］等多種水環(huán)境中均檢出了多種PPCPs 化合物。Lindberg 等［9］研究表明，污水中含有多種抗生素類藥物且污水處理廠對(duì)這些藥物的去除率較低，大部分藥物親水性較強(qiáng)，易通過(guò)地表徑流與滲濾污染地下水與人類的飲用水水源，因此，這些藥物在生活飲用水中的檢出頻率較高，給人類健康和生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重危害［3，7，10，11］。此外，磺胺類藥物在生物體內(nèi)主要代謝為乙酰類化合物，隨著生物體排泄進(jìn)入到環(huán)境中。有研究表明，雖然這些代謝產(chǎn)物的抗菌活性在進(jìn)入環(huán)境后減弱，但當(dāng)環(huán)境中有細(xì)菌存在時(shí)，乙?；x物仍可轉(zhuǎn)變回原形存在于環(huán)境中，從而引發(fā)細(xì)菌耐藥性等一系列環(huán)境問(wèn)題［3，12］。國(guó)外對(duì)環(huán)境水體中磺胺代謝物的存在水平已有一些研究，在地表水［13-15］、地下水［13］、瓶裝水［13］及污水［15，16］中均檢出殘留，且乙?；x物在水體中的檢出濃度高于其原形藥物［14］，含量為50 ～2 200 ng／L［13］。

我國(guó)對(duì)生活飲用水系統(tǒng)中PPCPs 的存在水平報(bào)道 較 少［4，17］，多 集 中 在 地 表 水 和 污 水 的 研究［7，8，10，18］。Yi 等［4］調(diào)查了廣州和澳門地區(qū)的市政末梢水，均檢出了環(huán)丙沙星、諾氟沙星、洛美沙星和恩諾沙星，其中環(huán)丙沙星的質(zhì)量濃度為679.7 ng／L，且檢出率達(dá)77.5% 以上。喻崢嶸等［17］分別在水源水、凈水廠原水和小區(qū)管網(wǎng)水中檢出11、12和5 種PPCPs，質(zhì)量濃度最高為12.35 ng／L。因此，為了解北京飲用水中藥物的存在水平和污染現(xiàn)狀，建立一種方法可以同時(shí)測(cè)定生活飲用水中多種類藥物及其代謝產(chǎn)物是有必要的。

本文參考文獻(xiàn)［5，7，8］，根據(jù)目前在我國(guó)環(huán)境中PPCPs 暴露的濃度水平，選取了7 類49 種藥物及5種磺胺代謝物為研究對(duì)象，利用Oasis HLB 固相萃取柱富集凈化，UPLC-MS／MS 檢測(cè)，建立了生活飲用水中多種PPCPs 快速、準(zhǔn)確的定量方法，并對(duì)北京市部分生活飲用水中多種藥物及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行了檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

ACQUITYTM超高效液相色譜儀（Waters 公司）、3200Q-Trap 質(zhì)譜儀（AB SCIEX 公司），Oasis HLB 固相萃取柱（6 mL，200 mg）、Oasis MCX 固相萃取柱（6 mL，150 mg）、Oasis MAX 固相萃取柱（6 mL，150 mg）、C18固相萃取柱（6 mL，500 mg）（Waters 公司）。

甲醇、乙腈（色譜純，F(xiàn)isher Scientific 公司），甲酸（純度為99%，Acros Organics 公司），氨水、鹽酸（優(yōu)級(jí)純，北京化學(xué)試劑公司），實(shí)驗(yàn)室用水均為超純水，電阻率為18.2 MΩ·cm （Millipore 超純水機(jī)制備）。

49 種藥物（見(jiàn)表1）購(gòu)自Dr. Ehrenstorfer 公司（Augsburg，Germany），5 種磺胺的代謝物購(gòu)自Toronto Research Chemicals Inc. （Toronto，Canada），純度均高于97%。

表1 54 種藥物的質(zhì)譜采集參數(shù)Table 1 MS parameters of the 54 compounds

表1 （續(xù)）Table 1 （Continued）

表1 （續(xù)）Table 1 （Continued）

以甲醇為溶劑分別配制質(zhì)量濃度為1 000 mg／L 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18 ℃保存。臨用時(shí)配制成不同濃度的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2 儀器條件

1.2.1 色譜條件

Waters ACQUITY UPLCTMBEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm；Waters，USA）；流動(dòng)相A：0.1% 甲酸水溶液；B：甲醇；流速：0.3 mL／min；梯度洗脫條件：0 ～3 min，5% B ～20% B；3 ～8 min，20% B ～30% B；8 ～12 min，30% B ～35% B；12 ～15 min，35% B ～70% B；15 ～16.5 min，70% B ～95% B；16.5 ～17 min，95% B ～5% B；17 ～20 min，5% B。柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧電離正離子模式（ESI（＋））。噴霧電壓5 500 V；霧化溫度500 ℃；霧化氣壓力3.74×103Pa；碰撞氣（CAD）：Medium；54 種藥物的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）參數(shù)見(jiàn)表1。

1.3 樣品前處理

環(huán)境水樣經(jīng)0.45 μm 濾膜過(guò)濾后，量取400 mL，加入10 mg 抗壞血酸鈉，加入0.5 g Na2EDTA超聲至完全溶解，用鹽酸調(diào)節(jié)pH 值至3，水樣以大約10 mL／min 的速度過(guò)HLB 柱（分別用5 mL 甲醇，5 mL 0.1% Na2EDTA 水溶液（pH 3）活化）。水樣過(guò)柱后，用5 mL 超純水淋洗，最后用5 mL 甲醇洗脫；洗脫液用氮?dú)獯抵两?，?.4 mL 0.1% 甲酸水溶液定容，渦旋混勻1 min，轉(zhuǎn)移至2 mL 樣品瓶中，用LC-ESI MS／MS 測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 水樣保存條件的優(yōu)化

有研究表明，在使用大量氯消毒的市政末梢水中，抗生素可與游離余氯發(fā)生氯化反應(yīng)，為了準(zhǔn)確測(cè)定生活飲用水中多種藥物的含量，須使用掩蔽劑去除游離余氯對(duì)抗生素類藥物的影響［19］。通常，在生活飲用水（余氯含量為1 mg／L）中加入過(guò)量抗壞血酸鈉（25 mg／L）或亞硫酸鈉（20 mg／L）可去除游離余氯對(duì)抗生素測(cè)定的干擾。本研究采集的水樣（自備井水和市政末梢水）經(jīng)測(cè)定余氯含量為0.7 ～1.0 mg／L，比較了抗壞血酸鈉的加入對(duì)生活飲用水中抗生素類藥物含量的影響。取兩份100 mL 水樣，加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使水樣中抗生素類藥物的質(zhì)量濃度為10 μg／L，其中1 份加入過(guò)量抗壞血酸鈉（25 mg／L）。將兩份水樣連續(xù)測(cè)定7 天。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加入抗壞血酸鈉后，抗生素類藥物的測(cè)定值7 天內(nèi)穩(wěn)定且明顯高于未加入抗壞血酸鈉的水樣。因此，在采集水樣時(shí)，應(yīng)及時(shí)加入過(guò)量抗壞血酸鈉（25 mg／L），水樣可保存7 天。

2.2 SPE 條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)采用固相萃取技術(shù)對(duì)水樣中的目標(biāo)化合物進(jìn)行富集和凈化，由于這些藥物多為兩性化合物，pKa范圍在5 ～8 之間，且同一化合物在酸性、中性和堿性條件下的存在狀態(tài)不同。因此，通過(guò)不同pH值的上樣液（pH 值為3、5、7 和9）比較了不同性質(zhì)的SPE 柱：HLB 柱、C18柱、MAX 柱和MCX 柱。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)上樣液pH 值為5、7 和9 時(shí)，4 種SPE 柱上的提取效率在50% ～120% 之間的藥物數(shù)量只有20% ～80%。當(dāng)上樣液pH 值為3 時(shí)，藥物經(jīng)過(guò)HLB 柱后的絕對(duì)回收率均高于50%，分別為：磺胺及其代謝物68.0% ～97.3%，喹諾酮類61.3%～105.0%，大環(huán)內(nèi)酯類50.9% ～89.3%，四環(huán)素類95.9% ～120.0%，β-受體阻斷劑54.5% ～109.4%，β-受體激動(dòng)劑50.6% ～111.8%，利尿劑113.0%。而使用C18柱，磺胺及其代謝物和喹諾酮類藥物的回收率均低于50%；使用MAX 柱和MCX 柱分別只有21 種和41 種藥物的回收率大于50%。這可能是由于藥物在酸性條件下保持非解離狀態(tài)，可以在HLB 柱上得到較好的保留，與文獻(xiàn)研究結(jié)果［13］一致。因此，本研究選用上樣液的pH 值為3，采用HLB 柱進(jìn)行富集凈化。

2.3 Na2EDTA 加入量的優(yōu)化

由于喹諾酮類和四環(huán)素類藥物可與水中的二價(jià)金屬離子配合，從而影響這兩類藥物的提取效果。在上樣液中加入適量Na2EDTA 可以明顯改善提取效果［20］。根據(jù)EDTA 的酸效應(yīng)曲線，當(dāng)使用pH 值較高的上樣液時(shí)，Na2EDTA 不能配合大部分金屬離子，只有Mg 和Sr 在pH 值為10 的溶液中可以被配合。當(dāng)上樣液pH 值為3 時(shí)，Na2EDTA 可以配合溶液中的大部分金屬離子，因此，在確定固相萃取柱后，對(duì)上樣液的Na2EDTA 加入量進(jìn)行了考察。在上樣液中 分別 加 入0、0.1、0.2、0.5 和1.0 g Na2EDTA 進(jìn)行測(cè)試。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：Na2EDTA 加入量由0 g 增加到0.5 g 時(shí)，四環(huán)素類藥物的提取效率明顯提高了20%，而其他藥物的提取效率沒(méi)有明顯改變。因此，本研究選擇加入0.5 g Na2EDTA 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.4 線性范圍和檢出限

54 種藥物使用外標(biāo)法定量，分別配制自備井水、市政末梢水和地表水基質(zhì)匹配系列標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。3種基質(zhì)的混合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的質(zhì)量濃度為0.5 ～500 ng／L，在相應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，其線性相關(guān)系數(shù)均大于0.99。自備井水、市政末梢水和地表水水樣的基質(zhì)效應(yīng)分別為60.9% ～138.1%，69.5% ～110.2% 和65.3% ～110.6% （見(jiàn)表2）。基質(zhì)效應(yīng)的計(jì)算公式為：基質(zhì)效應(yīng)＝樣品基質(zhì)中添加相同含量目標(biāo)化合物的響應(yīng)值／純?nèi)軇┲心繕?biāo)化合物的響應(yīng)值×100%。以能產(chǎn)生峰對(duì)峰S／N ＝3 和S／N ＝10 對(duì)應(yīng)的藥物濃度分別定義為方法檢出限（MDL）與方法定量限（MQL）；對(duì)于水樣中未檢出的藥物，以基質(zhì)加標(biāo)的方法，通過(guò)低濃度加標(biāo)水平的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行計(jì)算。分別獲得自備井水、市政末梢水和地表水樣中目標(biāo)化合物的MQL 為0.002 ～5.000 ng／L，0.003 ～5.000 ng／L，0.003 ～5.000 ng／L（見(jiàn)表2），MDL 為0.000 7 ～1.670 0 ng／L，0.001 0 ～1.670 0 ng／L，0.001 0 ～1.670 0 ng／L，與已有的文獻(xiàn)相比，本方法的檢出限處于較低或相當(dāng)?shù)乃剑?，7，13］。

表2 自備井水、市政末梢水和地表水中54 種藥物的加標(biāo)回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差、定量限和基質(zhì)效應(yīng)（n＝6）Table 2 Recoveries，relative standard deviations （RSDs），method quantification limits （MQLs）and matrix effects of the target compounds in ground water，tap water and surface water at three spiked concentrations （n＝6）

表2 （續(xù)）Table 2 （Continued）

表2 （續(xù)）Table 2 （Continued）

表2 （續(xù)）Table 2 （Continued）

2.5 方法的準(zhǔn)確度與精密度

分別用自備井水、市政末梢水和地表水樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)，設(shè)低、中、高3 個(gè)加標(biāo)濃度，每個(gè)濃度設(shè)6 個(gè)平行。濃度水平及結(jié)果見(jiàn)表2。自備井水、市政末梢水和地表水中54 種目標(biāo)化合物的平均回收率分別為58.7% ～104.4%、53.1% ～109.5%、50.7% ～118.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.3% ～12.8%、1.0% ～15.5%、0.4% ～19.3%，說(shuō)明該方法具有較好的準(zhǔn)確度和精密度。

2.6 實(shí)際水樣分析

應(yīng)用本方法采集北京部分自備井水45 份、市政末梢水20 份和地表水5 份進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1 和表3。在自備井水中共有26 種藥物檢出，其中包括11 種磺胺及其代謝物、3 種大環(huán)內(nèi)酯、9 種喹諾酮和3 種β-受體阻斷劑。檢出頻率大于40% 的藥物共有5 種，2 種大環(huán)內(nèi)酯（CLA 和ROX）和3 種喹諾酮（GAT、OFX 和FLE）。其中CLA 和ROX 在自備井水中為100% 檢出，最高質(zhì)量濃度分別為3.210 ng／L 和2.930 ng／L。GAT、OFX 和FLE 的最大質(zhì)量濃度分別為2.930、5.980 ng／L 和49.890 ng／L，F(xiàn)LE 的濃度水平遠(yuǎn)高于北京河道的濃度水平（2.69 ng／L）［7］。對(duì)于磺胺類藥物，本研究檢出的種類與Díaz-Cruz 等［13］的研究結(jié)果有明顯不同，Díaz-Cruz等在研究地下水時(shí)只檢出了2 種磺胺類藥物（SDM：0.2 ng／L；SMX：9.9 ng／L），而本研究共檢出11 種，最高質(zhì)量濃度3.990 ng／L （SDZ），SDZ的檢測(cè)結(jié)果與北京河道中檢出的磺胺結(jié)果一致，但濃度水平低于河道的檢測(cè)結(jié)果（SDZ：715 ng／L）［7］。對(duì)于地表水和市政末梢水，所有目標(biāo)化合物的濃度均小于最低檢出限，優(yōu)于廣州的地表水的檢測(cè)結(jié)果（CIP：6 ～679.7 ng／L，ENR：0 ～8.3 ng／L）和澳門市政末梢水的檢測(cè)結(jié)果（CIP：2 ～8.2 ng／L，ENR：2.8 ～5.2 ng／L）［4］。而Ye 等［19］在北卡羅來(lái)納州的3 個(gè)飲用水廠的出水調(diào)查中檢出了低濃度的磺胺類（SMX：3.0 ～3.4 ng／L）、大環(huán)內(nèi)酯類（ROX、TYL、ERY：1.4 ～4.9 ng／L）和喹諾酮類（OXO、FLUM：1.2 ～4.0 ng／L）抗生素。

1999-2000 年間，美國(guó)地質(zhì)調(diào)查局對(duì)美國(guó)139條河流中包括PPCPs 在內(nèi)的95 種水體有機(jī)污染物進(jìn)行了調(diào)查，檢出6 種抗生素，檢出頻率在40% ～50% 且最大濃度達(dá)到μg／L 級(jí)［21，22］，而本研究在自備井水中所檢出藥物的濃度水平略低，但檢出的種類多，且檢出頻率（TMP、SMA、AZI 和CIP）遠(yuǎn)高于美國(guó)，這可能與不同地區(qū)藥物使用的差異性有關(guān)，也可能意味著部分自備井水普遍受到藥物的污染。

圖1 （a）藥物標(biāo)準(zhǔn)品和（b）自備井水樣品的總離子流圖（TIC）Fig.1 TIC chromatograms of （a）the drug standard solution and （b）a groundwater sample

總而言之，在這幾類藥物中，喹諾酮類藥物檢出的濃度水平最高，其次是大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類和β-受體阻斷劑類藥物（見(jiàn)表3）。除β-受體阻斷劑類外，其他3 類藥物的檢出頻率大于50%，同時(shí)也在超過(guò)50% 的水樣中檢出。這4 類藥物的質(zhì)量濃度（中值）分別為0.950、1.010、0.100 和0.013 ng／L，最高質(zhì)量濃度達(dá)到348.440 ng／L，雖然飲用水中檢出的藥物種類多，但是要判定其風(fēng)險(xiǎn)并進(jìn)行評(píng)估，還需了解更多飲用水中PPCPs 化合物的濃度水平及人群的消費(fèi)量。因此，未來(lái)在藥物與個(gè)人護(hù)理品的環(huán)境污染領(lǐng)域中可以關(guān)注對(duì)人群的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。

表3 自備井水樣品中藥物的檢測(cè)結(jié)果Table 3 Results of the drugs in groundwater samples

3 結(jié)論

本研究建立了生活飲用水中49 種藥物和5 種磺胺代謝物殘留的超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法。使用HLB 固相萃取柱對(duì)環(huán)境水樣進(jìn)行富集凈化。該方法具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確性。將其應(yīng)用于自備井水、市政末梢水和地表水中藥物殘留分析，檢出多種藥物，其中環(huán)丙沙星含量最高。

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