超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定制藥廢水中10 種抗生素

邱盼子， 郭欣妍， 王 娜* ， 孔祥吉， 何 華

（1. 環(huán)境保護部南京環(huán)境科學研究所，江蘇 南京210042；2. 中國藥科大學理學院，江蘇 南京211198）

隨著我國抗生素產(chǎn)品國際競爭力的不斷增強，抗生素藥物的年產(chǎn)量大大增加，生產(chǎn)過程中所產(chǎn)生的制藥廢水量也逐年增加。實際生產(chǎn)中，制藥廢水的處理多采用以生物處理為主、結合物化處理工藝的常規(guī)廢水處理工藝。然而，現(xiàn)有的廢水處理技術不能將其中殘留的抗生素完全去除，大部分抗生素會經(jīng)不同途徑對土壤和水體造成污染［1，2］。

由于抗生素環(huán)境污染存在隱蔽性與長效性的特點，針對抗生素的環(huán)境管理一直處于盲區(qū)，致使抗生素的環(huán)境污染持續(xù)處于加重的態(tài)勢［3］，嚴重影響了抗生素生產(chǎn)的社會效益與經(jīng)濟利益。制藥廠廢水處理工藝能否有效去除抗生素，對抗生素污染的源頭控制起著重大作用。目前，大環(huán)內(nèi)酯類（MLs）、氨基糖苷類（AGs）及氟喹諾酮類（FQNs）抗生素是我國醫(yī)藥、畜牧和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)應用廣泛的幾類抗生素［4-7］，在我國產(chǎn)量巨大。本研究所選取的10 種抗生素一般作為人用抗生素，環(huán)境暴露少，制藥廢水是環(huán)境中這些抗生素的主要來源之一，對公眾健康和環(huán)境安全構成了嚴重威脅。因此建立制藥廢水中此類物質(zhì)的分析測定方法，可為進一步研究其在制藥廠廢水處理系統(tǒng)中的消解動態(tài)提供技術支持。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是檢測環(huán)境樣品中抗生素含量的一種重要方法，其靈敏度高，特異選擇性好，抗背景干擾能力強，能對含量低的樣品進行很好的定量分析檢測［8，9］。但由于氨基糖苷類抗生素極性大，且為離子型化合物，很難保留在反相色譜柱上。因此多在流動相中添加一定濃度的七氟丁酸（HFBA），通過與被測物形成離子對增強其色譜保留［10，11］。但HFBA 會在質(zhì)譜中積累而污染質(zhì)譜，影響儀器的靈敏度，不利于儀器后續(xù)的穩(wěn)定使用。本研究以甲酸代替七氟丁酸，使氨基糖苷類抗生素獲得了較好的峰形和較高的響應，并利用固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（SPE-UPLC-MS／MS）技術，建立了制藥廢水中10 種目標抗生素的高靈敏檢測方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（LC 為Agilent Technologies 的1290 Infinity，MS 為美國AB 公司的SCIEX QTRAP 4500）；Agilent C18 色譜柱（75 mm×2.1 mm，2.7 μm）（美國Agilent 公司）；真空冷凍干燥機（Benchtop K，Virtis，美國）；高速冷凍離心機（CR22GII，Sigma，德國）；Milli-Q 超純水器（Millipore，美國）；AG-285 電子天平（Mettler，瑞士）；MG-2200 氮吹儀（EYELA，日本）；12 通道固相萃取裝置（Waters，美國）；Waters Oasis HLB 固相萃取柱（200 mg，6 mL，粒徑為30 μm，親水親脂平衡的水可浸潤性的反相吸附）；Waters Oasis WCX 固相萃取柱（150 mg，6 mL，粒徑為30 μm，混合型弱陽離子交換反相吸附劑）；Waters Oasis MCX 固相萃取柱（60 mg，3 mL，粒徑為30 μm，混合型陽離子交換反相吸附劑）；Waters Oasis WAX固相萃取柱（60 mg，3 mL，粒徑為30 μm，混合型弱陰離子交換反相吸附劑）（Waters，美國）。

乙腈、甲醇和甲酸為色譜純（Merck，德國）；試驗用水為經(jīng)Milli-Q 凈化系統(tǒng)（0.22 μm 孔徑過濾膜）處理的超純水。

1.2 供試藥品

標準品：巴龍霉素（paromomycin，PAR，純度99.0%），核 糖 霉 素（ribostamycin，RI，純 度99.0%），依替米星（etimicin，ET，純度99.0%），奈替米星（netilmicin，NE，純度99.0%），西索霉素（sisomicin，SI，純度99.0%），小諾霉素（micronomicin，MI，純度99.0%），巴洛沙星（balofloxacin，BA，純度99.0%），帕珠沙星（pazufloxacin，PA，純度99.0%），螺旋霉素（spiramycin，SP，純度99.0%），氟羅沙星（fleroxacin，F(xiàn)L，純度99.0%）?？股貥藴势肪徲诘聡鳧r. Ehrenstorfer 公司。10 種目標抗生素的化學結構見圖1。

3 種氟喹諾酮類抗生素和螺旋霉素用甲醇配制成為1000 mg／L 的標準儲備液，6 種氨基糖苷類藥物因難溶于有機試劑而使用20% （v／v）的乙腈水溶液配制成為1000 mg／L 的標準儲備液，儲存于4 ℃的冰箱中。用甲醇配制上述10 種抗生素的混合標準溶液，質(zhì)量濃度為10 mg／L。

1.3 采樣方法

圖1 10 種抗生素的化學結構式Fig.1 Chemical structures of the ten antibiotics

廢水水樣取自江蘇省某藥廠污水處理系統(tǒng)。采樣在2014 年11 月3、12、20、29 日進行，每天采樣3次，每8 h 采樣1 次，每次從各采樣點取樣1 L。所采集的廢水為混合水樣，包括原水、調(diào)節(jié)池水、厭氧塔水、水解池水、好氧池水、二沉池水、混凝池水、最終出水，全部水樣盛裝于潔凈的棕色玻璃采樣瓶內(nèi)，防止樣品發(fā)生光解作用導致測定結果不準。盡快運回實驗室并保存于4 ℃的冰箱內(nèi)，保持樣品的原始狀態(tài)。48 h 內(nèi)完成廢水中殘留抗生素的分析測定。

1.4 樣品處理

準確量取經(jīng)0.45 μm 玻璃纖維濾膜過濾的水樣250 mL，用甲酸調(diào)節(jié)pH 為3.0 ～4.0，使目標抗生素完全離子化，利于其被固相吸附劑完全吸附保留。預先依次用6 mL 甲醇、6 mL 超純水淋洗活化WCX 固相萃取柱。樣品溶液上柱時控制流速為3～5 mL／min。過柱完成后，用6 mL 超純水沖洗WCX 柱，最大程度除去柱內(nèi)殘留干擾物。抽真空30 min，盡量去除柱中殘留水分。最后以10 mL 含5% （v／v）甲酸的甲醇溶液分3 次洗脫，收集洗脫液并在室溫下用N2吹至近干，用乙腈-0.2% （v／v）甲酸水溶液（1 ∶9，v／v）定容至1 mL，渦旋振蕩2 ～3 min，10 000 r／min 下離心10 min，取上清液待分析。

1.5 UPLC-MS／MS 測定

1.5.1 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子（ESI）源正電離模式、多反應監(jiān)測（MRM）掃描。氣簾氣（curtain gas，CUR）壓力為206 851.8 Pa，噴霧氣（ion source gas 1，GS1）壓力為241 327.1 Pa，輔助加熱氣（ion source gas 2，GS2）壓力為275 802.4 Pa，源溫度（temperature，TEM）為450 ℃，離子化電壓（ion spray voltage，IS）為5 500 V，碰撞氣（collision gas，CAD）壓力為41 370.36 Pa。其他參數(shù)見表1。

表1 目標抗生素主要的MRM MS 參數(shù)Table 1 MRM MS parameters for the target antibiotics

1.5.2 色譜條件

柱溫：35 ℃；流動相：（A）0.2% （v／v）甲酸水溶液和（B）乙腈，流速0.2 mL／min；進樣量：5 μL；流動相梯度：0.01 ～7.00 min，90% A ～60% A；7.01～8.00 min，90% A。

1.6 分析方法的質(zhì)量控制

采用全程空白和平行樣對分析過程進行質(zhì)量控制，確保結果的可靠性。處理數(shù)據(jù)時，采用標準添加法對各目標抗生素在制藥廢水基質(zhì)中存在的不可忽略的基質(zhì)效應進行校正。環(huán)境樣品中可能存在復雜或未知組分的基質(zhì)影響，標準添加法是降低基質(zhì)效應影響的有效措施。將1.4 節(jié)處理的水樣平均分成兩份。其中一份直接進樣分析，記錄待測樣品的峰面積；另一份根據(jù)第一份的檢出情況，精密加入適量各目標化合物標準混合工作液，然后進樣分析，記錄待測樣品的峰面積。依據(jù)標準添加法校正公式C ＝S×Rx／（Rs-Rx）計算樣品濃度。其中C 為校正后的待測物濃度；S 為標準添加量；Rx和Rs分別為標準溶液添加前、后測得的待測樣品峰面積。

2 結果與討論

2.1 色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜條件的優(yōu)化

氨基糖苷類抗生素（AGs）分子結構中含有多個伯氨和仲氨基團，呈堿性，極性強。為提高AGs 在反相色譜柱上的保留能力，多使用包括戊基、庚基或己基磺酸鹽的離子對試劑［11，12］。由于磺酸鹽難揮發(fā)，不適合質(zhì)譜分析，因此一般采用易揮發(fā)的七氟丁酸作為離子對試劑［13，14］。但七氟丁酸陰離子容易和溶液中的陽離子形成緊密的中性離子對，不能被質(zhì)譜檢出，且會在質(zhì)譜中累積，污染質(zhì)譜，抑制電噴霧質(zhì)譜信號而影響檢測的靈敏度。本文以甲酸代替七氟丁酸，使AGs 獲得了較高的響應和較好的峰形。此外，考慮到螺旋霉素在強酸性條件下容易水解，故水相選擇0.2% （v／v）的甲酸水溶液。目標抗生素的色譜圖如圖2 所示。

2.1.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

Agilent 1290 超高效液相色譜和AB SCIEX QTRAP 4500 聯(lián)用能夠提供MRM 模式，提高儀器靈敏度。將所研究的10 種目標抗生素分別配制成100 ～1 000 μg／L 的標準溶液，直接注入質(zhì)譜儀，進樣速度為7 μL／min，根據(jù)目標抗生素的分子結構特征，在正離子模式下對目標抗生素實行半自動進樣，采用一級質(zhì)譜對目標物進行母離子全掃描，分析得到［M＋H］＋分子離子峰，然后二級質(zhì)譜以分子離子為母離子，優(yōu)化CE、DP、EP、CXP 等4 個參數(shù)，對各目標抗生素的子離子進行全掃描，選信噪比較高的兩個子離子與分子離子組成定性和定量離子對，信噪比最高的離子對往往為定量提供了高靈敏度，而其他離子對則可提供輔助定性信息。在進行MRM監(jiān)測時選擇信噪比最高的離子對進行檢測，以提高質(zhì)譜確證的準確性。

圖2 目標抗生素的色譜圖Fig.2 Chromatograms of the target antibiotics

2.2 質(zhì)譜分離

本方法中6 種氨基糖苷類抗生素的保留時間幾乎相同，帕珠沙星和氟羅沙星的保留時間亦較為接近，但鑒于質(zhì)譜檢測器具有強大的質(zhì)量鑒別能力，對于非同分異構的化合物，無需達到色譜分離，也可通過不同的質(zhì)量通道進行質(zhì)譜分離，從而實現(xiàn)目標化合物的專屬測定。

2.3 方法學驗證

2.3.1 標準工作曲線與檢出限

采用無檢出抗生素的空白基質(zhì)，按照1.4 節(jié)所述方法處理后加入目標抗生素混合標準溶液，配制成質(zhì)量濃度范圍為0.1 ～1 000 μg／L 的系列標準工作溶液，在優(yōu)化的液相色譜和質(zhì)譜條件下進行分析。10 種目標抗生素均以峰面積（y）為縱坐標，質(zhì)量濃度（x，mg／L）為橫坐標做定量工作曲線，得到的線性回歸方程的相關系數(shù)r2在0.995 6 ～0.999 8 之間，表明各目標抗生素在相應的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關系。

根據(jù)SPE-UPLC／MS／MS 的定量限（LOQ）公式［15］計算本方法定量限：

其中：IQL 為儀器的定量限（μg／L），即色譜峰信噪比等于10 時對應的目標物濃度（見表2）；R 為固相萃取回收率（%），是高、中、低3 個加標水平的回收率的平均值；C 為樣品富集倍數(shù)。準確量取待測水樣250 mL，過柱富集并濃縮后，用初始流動相定容至1 mL 進樣分析，故C 為250。以色譜峰信噪比等于3 確定樣品的檢出限。本文方法的定量限為0.22 ～14.55 ng／L，檢出限為0.07 ～4.37 ng／L（見表2）。

2.3.2 方法的回收率

采用在空白基質(zhì)中添加標準溶液的方法進行添加回收率測定。分別添加氨基糖苷類抗生素低（0.02 μg／L）、中（1.0 μg／L）、高（40 μg／L）3 個水平，氟喹諾酮類抗生素和螺旋霉素低（0.002 μg／L）、中（0.10 μg／L）、高（4.0 μg／L）3 個水平，每個水平取3 份樣品進行平行實驗，按1.4 節(jié)方法處理后進行UPLC-MS／MS 測定，采用外標法定量。計算各待測化合物在空白基質(zhì)中的加標回收率（見表3）。6 種AGs 的回收率差異較大，這是因為6 種AGs 雖然有著相似的化學結構，但其與陽離子交換劑作用的能力差別較大［16］。巴龍霉素、核糖霉素和依替米星的回收率較高（84.1% ～114.1%），可能是由于這3 種AGs 結構中含3 個或3 個以上的伯氨基，與陽離子交換劑的作用位點多；西索霉素、奈替米星和小諾霉素的結構中也含有多個伯氨基，但回收率卻不及前3 種AGs，這可能是由于其pKb值較高，與陽離子交換劑作用力較弱，被保留在陽離子交換柱上的組分較少。氟羅沙星回收率低于其他兩種FQNs，可能是因為氟羅沙星結構中含有多個吸電子基（F 原子），酸性較強，故減弱了與陽離子交換劑的親和力。雖然后3 種AGs 和氟羅沙星的回收率偏低（50.4% ～70.6%），但是RSD 均較低（1.10%～9.64%），表明該方法比較穩(wěn)定。

表2 10 種抗生素的線性方程、相關系數(shù)、儀器定量限、檢出限和定量限Table 2 Linear equations，correlation coefficients，instrument quantitative limits （IQL），limits of detection and limits of quantification of the ten antibiotics

表3 水樣中10 種抗生素的加標回收率及RSD（n＝3）Table 3 Recoveries and RSDs of the ten antibiotics in water samples （n＝3）

2.3.3 固相萃取柱的選擇

固相萃取技術是目前測定抗生素最常用的前處理方法，可選擇不同的固相萃取柱對水樣中的多種目標化合物進行萃取和凈化。本實驗分別考察了弱陰離子交換柱（WAX）、混合型強陽離子（MCX）、親水親油平衡柱（HLB）及弱陽離子（WCX）固相萃取柱對目標抗生素的萃取回收效果（見圖3）。結果表明：采用WAX 柱時，10 種目標抗生素的回收率幾乎都為0，這是由于WAX 柱是弱陰離子交換柱，10 種目標抗生素在酸性（pH 3.0 ～4.0）條件下帶正電荷，很難與陰離子交換劑進行離子交換，故被吸附在WAX 柱上的目標組分很少；采用MCX 交換柱時6種AGs 的回收率很低，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)MCX 交換柱對AGs 等堿性化合物具有高度的選擇性和靈敏度，故AGs 與MCX 交換柱結合較牢固，難以被洗脫；采用HLB 柱對3 種FQNs 抗生素的萃取回收率優(yōu)于其他固相萃取柱，但是HLB 柱對6 種AGs 抗生素的回收效果差。故綜合考慮后選用WCX 柱進行富集凈化。比較了500 和150 mg 的WCX 柱，發(fā)現(xiàn)150 mg WCX 柱對10 種抗生素具有較好的回收率和選擇性。

圖3 固相萃取柱對10 種抗生素回收率的影響（n＝3）Fig.3 Effect of SPE columns on the recoveries of the ten antibiotics （n＝3）

2.3.4 洗脫液的優(yōu)化

處理后的水樣經(jīng)過WCX 柱后，分別用2% （v／v）甲酸甲醇溶液、5% （v／v）甲酸甲醇溶液和10% 甲酸甲醇溶液洗脫，結果如圖4 所示。之所以選擇酸性洗脫劑，是因為WCX 柱的主要分離模式是陽離子交換作用，上樣時，AGs 陽離子與WCX 柱中的H＋交換而使AGs 保留在柱上，用酸性洗脫劑洗脫，使其H＋與保留在柱上的AGs 陽離子進行交換從而將結合在離子交換劑上的AGs 洗脫下來。用2% （v／v）甲酸甲醇溶液洗脫時，10 種目標抗生素的回收率在19.0% ～79.0% 之間，隨著甲酸體積分數(shù)增加至5% 時，10 種目標抗生素的回收率達到最大，為50.4% ～114.1%；繼續(xù)增加甲酸體積分數(shù)至10% 時，10 種目標抗生素的洗脫回收率為41.7% ～109.2%。最終選擇5% （v／v）甲酸甲醇溶液作為洗脫液。

圖4 洗脫液對10 種抗生素回收率的影響（n＝3）Fig.4 Effect of eluents on the recoveries of the ten antibiotics （n＝3）

2.4 實際樣品的測定

利用本文建立的測定方法分析了制藥廢水中抗生素的殘留濃度。由表4 可知該制藥廢水中檢出的抗生素主要為巴龍霉素、核糖霉素和螺旋霉素，這3種抗生素在出口水中的質(zhì)量濃度范圍為0.95 ～125.20 μg／L；巴龍霉素與核糖霉素最終去除率分別為95.77%、99.48%。巴龍霉素和核糖霉素在水相中的去除效果好主要是因為分子結構中都帶有多個-NH2和-OH，這些基團可以與鈣、鎂等金屬離子發(fā)生配位反應，或形成氫鍵，極易與固體介質(zhì)顆粒發(fā)生吸附而從水相中去除。

由于螺旋霉素于采樣前2 天就已停產(chǎn)，導致其在后續(xù)處理單元殘留濃度高，原水中螺旋霉素的濃度遠低于出口水的濃度。

由于物理和化學性質(zhì)的區(qū)別，各廢水處理環(huán)節(jié)對不同種類的抗生素的去除效果也會有所不同?；瘜W處理-水解酸化池產(chǎn)生的大量發(fā)酵細菌和產(chǎn)乙酸菌，它們通過微生物降解作用對巴龍霉素有明顯的去除作用，去除率達66.07%。好氧池的活性污泥含有豐富的好氧細菌，能對核糖霉素進行氧化分解，致使核糖霉素在該環(huán)節(jié)的去除率達99.06%。

表4 制藥廢水中10 種目標抗生素的測定（n＝3）Table 4 Determination of the ten antibiotics in the water samples from pharmaceutical manufacturer wastewater treatment plants （n＝3）

3 結論

建立了固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時分析制藥廢水中10 種典型抗生素的方法，定量檢測了這些抗生素在制藥廢水處理系統(tǒng)中的濃度分布。后續(xù)工作中還將補充這些抗生素在不同制藥廠廢水中的殘留濃度數(shù)據(jù)，通過質(zhì)量平衡分析掌握抗生素在不同制藥廢水處理系統(tǒng)中的消除機制，探究抗生素的主要去除方法，為今后的處理工藝改造、優(yōu)化提供理論依據(jù)和技術支持。

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