紫杉醇對(duì)Caski細(xì)胞增殖及APC、DKK-3基因表達(dá)的影響

，

(南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖南 衡陽(yáng) 421001)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

紫杉醇對(duì)Caski細(xì)胞增殖及APC、DKK-3基因表達(dá)的影響

唐群華，孫曉紅*

(南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖南 衡陽(yáng) 421001)

目的研究紫杉醇對(duì)Caski細(xì)胞增殖及APC、DKK-3基因表達(dá)的影響。方法用MTT法、RT-PCR法及甲基化特異性PCR分別檢測(cè)紫杉醇對(duì)人宮頸癌Caski細(xì)胞株增殖的影響、APC與DKK-3 mRNA 表達(dá)水平、APC與DKK-3啟動(dòng)子甲基化水平。結(jié)果≥1 μmol/L紫杉醇能明顯抑制人宮頸癌Caski細(xì)胞株的增殖 (P<0.05)；從5 μmol/L開(kāi)始，隨著紫杉醇給藥劑量的增大，Caski細(xì)胞APC、DKK-3 mRNA表達(dá)水平明顯增加 (P<0.05)，而Caski細(xì)胞APC 、DKK-3啟動(dòng)子甲基化水平顯著降低 (P<0.05)。結(jié)論紫杉醇能呈劑量依賴(lài)性的抑制Caski 細(xì)胞的增殖并上調(diào)APC、DKK-3 mRNA的表達(dá)，這可能與其誘導(dǎo)APC、DKK-3啟動(dòng)子的去甲基化有關(guān)。

宮頸癌； 紫杉醇； 啟動(dòng)子甲基化； APC； DKK-3

轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是導(dǎo)致宮頸癌患者死亡的主要原因,以順鉑為基礎(chǔ)的化療是轉(zhuǎn)移性和復(fù)發(fā)性宮頸癌的治療標(biāo)準(zhǔn)方案，紫杉醇常與順鉑等鉑類(lèi)抗腫瘤藥物聯(lián)合使用并發(fā)揮了重要的作用[1]。但紫杉醇是通過(guò)何種信號(hào)途徑啟動(dòng)抗腫瘤效應(yīng)的，目前還不十分清楚。最近研究發(fā)現(xiàn)，紫杉醇能通過(guò)降低乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞株中PTPRO基因啟動(dòng)子甲基化水平促進(jìn)其表達(dá)，抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖[2]。腫瘤抑制基因 APC 及DKK-3 是wnt/β-catenin信號(hào)通路的關(guān)鍵組成部分，APC 與 β-catenin的交互作用與宮頸鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生相關(guān),肼屈嗪能夠通過(guò) APC 的去甲基化和重表達(dá)而抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖[3]。關(guān)于紫杉醇是否通過(guò)影響APC 及DKK-3基因啟動(dòng)子甲基化及其表達(dá)來(lái)抑制宮頸癌腫瘤細(xì)胞，目前未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)不同濃度的紫杉醇處理人宮頸癌Caski細(xì)胞株后，測(cè)定細(xì)胞增殖活性的改變，同時(shí)檢測(cè)APC、DKK-3基因表達(dá)水平及其啟動(dòng)子甲基化水平的變化，分析表觀遺傳學(xué)修飾在紫杉醇治療宮頸癌的作用機(jī)制，為宮頸癌的防治提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1宮頸癌細(xì)胞株及其培養(yǎng)人宮頸上皮癌Caski細(xì)胞系購(gòu)自武漢大學(xué)細(xì)胞保藏中心，保存于南華大學(xué)腫瘤實(shí)驗(yàn)研究所-80 ℃冰箱。將Caski細(xì)胞復(fù)蘇后置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度環(huán)境的培養(yǎng)箱內(nèi)，用含10% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)該細(xì)胞，每隔24 h換液1次，每隔48～72 h傳代1次，顯微鏡下觀察其生長(zhǎng)情況。

1.2主要試劑紫杉醇粉劑(生物專(zhuān)用)購(gòu)自于三維生物科技有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自于上海博升生物科技有限公司；噻唑藍(lán)購(gòu)自于福州邁新生物制品公司；TRIzol購(gòu)自于美國(guó)Invitrogen公司；PBL DNA購(gòu)自于美國(guó)Promega公司；RNase A 購(gòu)自于美國(guó)Sigma公司；蛋白酶K 購(gòu)自于美國(guó)羅氏診斷；所用引物及探針均由Invitrogen公司合成。

1.3 MTT比色法檢測(cè)不同濃度紫杉醇對(duì)人宮頸癌Caski細(xì)胞抑制率的影響細(xì)胞用不同濃度的紫杉醇 (0、1、5、10、20、40、80、160、 320 μmol/L ) 連續(xù)處理72 h，每個(gè)處理劑量設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，每隔24 h 換1次液。分別在0 h、24 h、48 h和72 h加入MTT，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀 570 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值 (OD)。按下面的公式計(jì)算：細(xì)胞抑制率 (%) =[(A570對(duì)照組-A570實(shí)驗(yàn)組)/A570對(duì)照組] × 100%。

1.4 RT-PCR法測(cè)定APC、DKK-3 mRNA表達(dá)水平選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caski細(xì)胞，按每10 cm2培養(yǎng)面積加1 mL TRIzol裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞RNA，用OD260/OD280 比值來(lái)衡量 RNA的純度。引物如下：APC-上游:5′-GAG ACA GAA TGG AGG TGC TGC-3′;APC-下游:5′-GTA AGA TGA TTG GAA TTA TCT TCT-3′;DKK-3-上游:5′-GTA AGT TTC CCC TCT GGC TTG-3′;DKK-3-下游:5′-AAG CAC CAG ACT GTG AAG CCT-3′;GAPDH-上游:5′-AAC GGA TTT GGT CGT ATT GGG-3′;GAPDH-下游:5′-TTG ATT TTG GAG GGA TCT CGC-3′。APC反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，35個(gè)PCR循環(huán) (95 ℃ 30 s、56 ℃ 60 s、72 ℃ 60 s)，72 ℃延伸 7 min；DKK-3反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，35個(gè)PCR循環(huán) (94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s)，72 ℃延伸 7 min。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，進(jìn)行成像分析，計(jì)算目的基因mRNA 與內(nèi)參 GAPDH mRNA 的光密度比值。

1.5 APC、DKK-3啟動(dòng)子甲基化分析收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caski細(xì)胞，加入2 mL 預(yù)熱的裂解緩沖液，用等體積的酚/氯仿/異戊醇 (1∶1∶0.04) 提取基因組DNA。50 ℃ 處理 16 h 后，DNA與5.5 μL 3 mol/L NaOH 在37 ℃ 一起孵育10 min，隨后加入 30 μL新鮮配制的 10 mmol/L對(duì)苯二酚和 520 μL 新鮮配制的3.6 mol/L 的亞硫酸氫鈉 (pH 5.0)。脫鹽等處理后應(yīng)用 MethyLight quantitative PCR進(jìn)行擴(kuò)增并用7500/7500 快速實(shí)時(shí) PCR 系統(tǒng)進(jìn)行熒光定量檢測(cè)。引物如下[4-6]：

APC-sense：5′- GAA CCA AAA CGC TCC CCAT -3′；APC -antisense： 5′- TTA TAT GTC GGT TAC GTG CGT TTA TAT -3′；probe:5′- CCC GTC GAA AAC CCG CCG ATT A -3′；Dkk-3-sense：5′- GTA AGT TTC CCC TCT GGC TTG-3′；Dkk-3-antisense：5′- AAG CAC CAG ACT GTG AAG CCT-3′；probe:5′- AGG TGT TGT GCA TTT GTT C AG CTC CC -3′；ALU-C4-sense：5′-GGT TAG GTA TAG TGG TTT ATA TTT GTA ATT TTA GTA -3′；ALU-C4 -antisense： 5′- ATT AAC TAA ACT AAT CTT AAA CTC CTA ACC TCA -3；probe:5′- CCT ACC TTA ACC TCC C -3′。經(jīng)過(guò)初始變性 (95 ℃,10 min)、45 個(gè)變性循環(huán) (95 ℃,10 min) 以及最后的退火/延伸循環(huán) (60 ℃,1 min)。甲基化比率通過(guò)絕對(duì)化的 qPCR 定量來(lái)測(cè)定。在待測(cè)樣本中靶基因的擴(kuò)增量被用 Alu-C4 進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，經(jīng)M.SssI 處理的 DNA 作為甲基化的參考。在特殊位點(diǎn)的甲基化 DNA 的量或甲基化參考比例 (PMR)是通過(guò)劃分基因來(lái)計(jì)算的：Alu-C4 的比例為M.SssI 處理的人類(lèi)基因組 DNA 的Alu-C4 的比例 (假定完全甲基化) 乘以100，即(樣本基因/樣本Alu-C4)/(SssI處理的樣本基因 / SssI處理的樣本Alu-C4)×100。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度紫杉醇對(duì)宮頸癌Caski細(xì)胞株活性的影響分別檢測(cè)紫杉醇作用24 h、48 h及72 h后對(duì)Caski細(xì)胞的抑制率，如表1所示，用1 μmol/L的紫杉醇作用時(shí)，24 h、48 h及72 h時(shí)點(diǎn)Caski細(xì)胞抑制率沒(méi)有明顯的變化 (P>0.05)；從5 μmol/L開(kāi)始，隨著紫杉醇給藥劑量的增大及紫杉醇處理時(shí)間的延長(zhǎng)，Caski細(xì)胞的抑制率顯著增大 (P<0.05)；各個(gè)劑量組均在72 h處顯示對(duì)Caski細(xì)胞的最大抑制率，其中320 μmol/L紫杉醇在72 h時(shí)對(duì)Caski細(xì)胞的抑制率達(dá)到最大(P<0.05)。

表1不同濃度紫杉醇(μmol/L)對(duì)宮頸癌Caski細(xì)胞作用不同時(shí)間的抑制率(%)

紫杉醇濃度24h48h72h000017.32±2.44a7.41±3.05a8.01±2.78ab530.78±2.34a32.13±2.34ab35.48±2.89ab1032.15±3.02a35.78±3.14ab40.18±2.73ab2033.51±2.73a37.55±2.71ab43.43±2.85ab4034.83±2.08a41.43±2.66ab47.68±2.74ab8036.46±2.71a48.61±2.59ab51.68±2.99ab16038.02±3.00a49.27±2.77ab55.34±2.17ab32040.68±2.80a56.85±2.61ab62.27±3.15ab

a：與同時(shí)點(diǎn)的前一個(gè)劑量組比較，P<0.05；b：與同一劑量組的前一個(gè)時(shí)點(diǎn)比較，P<0.05

2.2紫杉醇對(duì)Caski細(xì)胞APC、DKK-3 mRNA表達(dá)的影響檢測(cè)紫杉醇作用72 h后APC、DKK-3 mRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)用1 μmol/L的紫杉醇作用時(shí)，Caski細(xì)胞APC、DKK-3 mRNA表達(dá)水平?jīng)]有明顯的變化 (P>0.05)；從5 μmol/L開(kāi)始，隨著紫杉醇給藥劑量的增大，Caski細(xì)胞APC、DKK-3 mRNA表達(dá)水平明顯增加 (P<0.05)，其中，320 μmol/L紫杉醇處理組APC、DKK-3 mRNA水平最高(圖1)。

圖1 RT-PCR檢測(cè)紫杉醇對(duì)Caski細(xì)胞APC、DKK-3 mRNA表達(dá)水平的影響. 1～9分別為0、1、5、10、20、40、80、160、320 μmol/L紫杉醇處理組. 與前一個(gè)劑量組比較，*：P<0.05

2.3紫杉醇對(duì)Caski細(xì)胞APC、DKK-3啟動(dòng)子甲基化水平的影響分別檢測(cè)紫杉醇作用24 h、48 h及72 h后對(duì)Caski細(xì)胞APC 、DKK-3啟動(dòng)子甲基化水平的影響，如表2所示，用1 μmol/L的紫杉醇作用時(shí)，24 h、48 h及72 h時(shí)點(diǎn)Caski細(xì)胞APC啟動(dòng)子甲基化水平?jīng)]有明顯的變化 (P>0.05)，而48 h和72 h時(shí)點(diǎn)DKK-3啟動(dòng)子甲基化水平明顯低于24 h時(shí)點(diǎn)的DKK-3啟動(dòng)子甲基化水平 (P<0.05)，48 h和72 h時(shí)點(diǎn)間沒(méi)有明顯的差異 (P>0.05)；從5 μmol/L開(kāi)始，隨著紫杉醇給藥劑量的增大及紫杉醇處理時(shí)間的延長(zhǎng)，Caski細(xì)胞APC、DKK-3啟動(dòng)子甲基化水平顯著降低 (P<0.05)；各個(gè)劑量組Caski細(xì)胞APC、DKK-3啟動(dòng)子甲基化水平均在72 h處顯示最低 (P<0.05)。

表2不同濃度紫杉醇(μmol/L)對(duì)宮頸癌Caski細(xì)胞APC、DKK-3啟動(dòng)子甲基化的影響

紫杉醇濃度APC啟動(dòng)子甲基化水平24h48h72hDKK-3啟動(dòng)子甲基化水平24h48h72h0125±3.2128±6.8127±7.1159±2.6155±5.1157±6.61120±2.8a119±8.0a121±8.7a147±8.2a127±2.5ac125±6.6ac590±8.6a80±7.2ab60±7.5ab129±5.7a128±8.0114±8.7ab1080±6.8a60±5.6ab40±4.4ab110±5.8a105±7.3a95±5.4ab2070±7.9a55±8.8ab35±5.4ab87±8.2a95±7.1a75±7.7ab4060±8.9a45±9.2ab30±4.0ab70±5.7a65±4.9ab50±3.9ab8050±6.7a40±6.6ab25±4.2ab51±6.7a47±9.0a40±7.1ab16040±8.2a30±9.1ab20±8.8ab43±4.2a36±4.6ab38±7.132035±6.3a20±7.8ab10±5.5ab35±4.9a21±3.7ab15±4.5ab

與同時(shí)點(diǎn)的前一個(gè)劑量組比較，a：P< 0.05；與同一劑量組的前一個(gè)時(shí)點(diǎn)比較，b：P<0.05；與24 h比較，c：P<0.05

3 討 論

全球每年有50多萬(wàn)女性罹患宮頸癌，國(guó)內(nèi)宮頸癌每年有13.2萬(wàn)新發(fā)病例，占世界總數(shù)28%[7]。對(duì)于宮頸癌患者，目前臨床化療方案以鉑類(lèi)為主，但鉑類(lèi)藥物對(duì)患者的毒性作用，尤其是腎毒性以及腫瘤細(xì)胞的耐藥性日益突出。因此，尋找新的毒性及耐藥性弱的化療藥物，對(duì)于宮頸癌患者的治療具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。紫杉醇是一線的抗腫瘤藥物。紫杉醇對(duì)卵巢癌和乳腺癌細(xì)胞有明顯的殺傷作用[8-9]，在體外有明顯的放射增敏作用[10]。紫杉醇可在肺癌細(xì)胞中通過(guò)下調(diào)let-7f的水平而上調(diào)血小板反應(yīng)蛋白-1(TSP-1)的水平，從而達(dá)到抗腫瘤效應(yīng)[11]。Wen等[12]研究發(fā)現(xiàn)，紫杉醇脈沖式的治療有助于克服乳腺癌細(xì)胞對(duì)于紫杉醇的賴(lài)藥性，其主要的機(jī)制可能與降低腫瘤細(xì)胞對(duì)已經(jīng)破壞的線粒體的修復(fù)作用有關(guān)[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)下調(diào)wnt信號(hào)通路的LEF1/磷酸化β-catenin的表達(dá)，能改善紫杉醇對(duì)腎細(xì)胞癌的治療效果。近年來(lái)，將紫杉醇與鉑類(lèi)藥物聯(lián)合用于宮頸癌的治療，取得了較好的效果。但紫杉醇抑制宮頸癌細(xì)胞的具體機(jī)制還不是十分清楚。

藥物對(duì)細(xì)胞活性的影響是藥效學(xué)評(píng)價(jià)最常用的手段。MTT法是測(cè)定細(xì)胞活性的最經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)之一?；罴?xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)并沉積在細(xì)胞中，細(xì)胞沉積的甲瓚越多，則表示細(xì)胞的活力就越強(qiáng)。因此甲瓚生成的多少代表細(xì)胞活力的強(qiáng)弱。在本研究中，用1 μmol/L的紫杉醇作用時(shí)，24 h、48 h及72 h時(shí)點(diǎn)Caski細(xì)胞抑制率沒(méi)有明顯的變化；從5 μmol/L開(kāi)始，隨著紫杉醇給藥劑量的增大及紫杉醇處理時(shí)間的延長(zhǎng)，Caski細(xì)胞的抑制率顯著增大；各個(gè)劑量組均在72 h處顯示對(duì)Caski細(xì)胞的抑制率大于處理24 h、48 h的抑制率，其中320 μmol/L紫杉醇在72 h時(shí)點(diǎn)對(duì)Caski細(xì)胞的抑制率達(dá)到最大，表明紫杉醇能夠?qū)θ藢m頸癌Caski細(xì)胞產(chǎn)生明顯的劑量依賴(lài)和時(shí)間依賴(lài)的抑制效應(yīng)，這種現(xiàn)象在其它抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)中也被觀察到[3]。

甲基化是研究最為廣泛的表觀遺傳學(xué)形式，基于Taqman探針的甲基化特異性PCR是較敏感的甲基化檢測(cè)方法。APC是一種廣泛表達(dá)的多功能蛋白，能夠與細(xì)胞內(nèi)多種蛋白相互作用，研究最徹底的是其能誘導(dǎo)β-catenin的降解，后者為鈣粘合蛋白復(fù)合體的亞基及wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵效應(yīng)器。當(dāng)綁定到β-catenin后，APC促進(jìn)了高保守的絲氨酸和蘇氨酸殘基的磷酸化而激活蛋白酶體系統(tǒng)來(lái)降解β-catenin[13-14]。DKK-3是新近發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，參與細(xì)胞周期的調(diào)控，與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)歸有密切的關(guān)系[15]。DKK-3在肝癌、宮頸癌、急性淋巴細(xì)胞白血病、胰腺癌和髓母細(xì)胞瘤等惡性腫瘤中表達(dá)減少[16]，而且這種減少與DKK-3的高甲基化狀態(tài)有關(guān)[15]。

腫瘤細(xì)胞總體基因組水平的超甲基化能夠影響腫瘤細(xì)胞對(duì)紫杉醇治療的敏感性[17]。研究顯示，APC啟動(dòng)子區(qū)域CpG位點(diǎn)的甲基化改變與細(xì)胞異常及惡化有關(guān)[18-19]。DKK-3基因啟動(dòng)子甲基化及基因表達(dá)下降已經(jīng)在膀胱癌、肺癌等多種腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)[20-21]。APC和DKK-3基因均與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖顯著相關(guān)，主要是因?yàn)锳PC和DKK-3基因啟動(dòng)子的超甲基化導(dǎo)致APC和DKK-3基因表達(dá)缺失引起[22-23]。在宮頸癌中還未發(fā)現(xiàn)APC、DKK-3基因啟動(dòng)子甲基化的相關(guān)報(bào)道。

在本研究中，用1 μmol/L紫杉醇作用時(shí)，24 h、48 h及72 h時(shí)點(diǎn)Caski細(xì)胞APC啟動(dòng)子甲基化水平?jīng)]有明顯的變化；而48 h和72 h時(shí)點(diǎn)Caski細(xì)胞DKK-3啟動(dòng)子甲基化水平明顯低于24 h時(shí)點(diǎn)的DKK-3啟動(dòng)子甲基化水平，48 h和72 h時(shí)點(diǎn)間沒(méi)有明顯的差異。從5 μmol/L開(kāi)始，隨著紫杉醇給藥劑量的增大及紫杉醇處理時(shí)間的延長(zhǎng)，Caski細(xì)胞APC、DKK-3啟動(dòng)子甲基化水平顯著降低而隨著紫杉醇給藥劑量的增高，APC、DKK-3 mRNA表達(dá)水平顯著升高；各個(gè)劑量組Caski細(xì)胞APC、DKK-3啟動(dòng)子甲基化水平均在72 h處低于處理24 h、48 h的水平，其中320 μmol/L紫杉醇組處理Caski細(xì)胞72 h時(shí)APC、DKK-3啟動(dòng)子的甲基化水平最低，而APC、DKK-3 mRNA表達(dá)水平最高，表明紫杉醇能夠促進(jìn)APC、DKK-3基因的表達(dá)，這種現(xiàn)象可能與其能夠呈劑量依賴(lài)性的降低宮頸癌Caski細(xì)胞APC、DKK-3基因啟動(dòng)子的甲基化水平有關(guān)，但其具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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EffectsofPaclitaxelonCellProliferationandExpressionofAPCandDKK-3inHumanCervicalCancerCaskiCells

TANG Qunhua,SUN Xiaohong

(ObstetricsandGynecologyDepartment,theAffiliatedNanhuaHospital,UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001，China)

ObjectiveTo study the effect of paclitaxel on the proliferation of Caski cells and the expression of APC,DKK-3 gene.MethodsMTT colorimetric method,RT-PCR method and methylation specific PCR were used to detect the proliferation effects,the mRNA expression level of APC and DKK-3,APC and DKK-3 promoter methylation level induced by paclitaxel on human cervical carcinoma Caski cell line,respectively.ResultsPaclitaxel significantly inhibited the proliferation of Caski cervical cancer cell line when the concentration of Paclitaxel was more than 1 μmol/L (P<0.05);Starting from concentration of 5 μmol/L,with increasing of paclitaxel dosage,APC and DKK-3 mRNA expression level increased significantly (P<0.05),while APC and DKK-3 promoter methylation level significantly decreased (P<0.05).ConclutionPaclitaxel could dose-dependently inhibit the proliferation of Caski cells through increasing APC and DKK-3 mRNA expression,which may be related with the inhibition of APC and DKK-3 promoter methylation.

cervical cancer; paclitaxel; promoter methylation; APC; DKK-3

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.03.005

2015-03-01；

2015-04-06

*通訊作者，E-mail：402447821@qq.com.

R737.33

A

(此文編輯：朱雯霞)