匍枝根霉β-葡萄糖苷酶BGLIII關(guān)鍵位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)功能*

李娟，湯斌，李松，孟慶婷

(安徽工程大學(xué)微生物發(fā)酵安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽蕪湖，241000)

纖維素是β-1，4糖苷鍵連接的葡萄糖聚合物，可通過(guò)3種酶水解成葡萄糖:內(nèi)切葡聚糖酶，它可以隨機(jī)分解結(jié)晶纖維素，產(chǎn)生大量的纖維素短鏈;外切葡聚糖酶，作用于纖維素線狀分子末端，切割纖維二糖;β-葡萄糖苷酶，作用于β-1，4糖苷鍵水解纖維二糖為葡萄糖。在酶解過(guò)程中，較低的β-葡萄糖苷酶活力會(huì)引起纖維二糖的積累，從而抑制內(nèi)切葡萄糖苷酶和外切葡聚糖酶酶活［1-2］。

據(jù)碳水化合物活性酶的分類(CAZy)(http://www.cazy.org)［3］，β-葡萄糖苷酶主要分屬于糖苷水解酶第1家族和第3家族［4］。經(jīng)生物信息學(xué)分析，匍枝根霉BGLIII屬于糖苷水解酶第1家族。Wang，Q研究證明GH1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是經(jīng)典的(α/β)8的筒狀結(jié)構(gòu)，催化殘基是162位谷氨酸和358位谷氨酸［5-6］。Ratananikom等對(duì)門(mén)冬黃檀β-葡萄糖鍵氨基酸進(jìn)行分析，對(duì)糖基結(jié)合口袋中的3個(gè)氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變(F196H，S251V和M369E)，提高了門(mén)冬黃檀對(duì)甘露糖的催化能力［7］;PEI等人利用家族改組、定點(diǎn)突變和飽和突變的方法對(duì)嗜熱裂孢菌的β-葡萄糖苷酶進(jìn)行了改造，高通量篩選出3個(gè)氨基酸(L44Y/G447S/A33V)突變的改良菌株，氨基酸的突變使酶活提高94%，熱穩(wěn)定性也有大幅度的提高［8］。

本文從匍枝根霉TP-02的基因組DNA中克隆得到bgl3基因，利用生物信息學(xué)手段對(duì)其進(jìn)行分析，在此基礎(chǔ)上確定酶解過(guò)程中的關(guān)鍵氨基酸基團(tuán)進(jìn)行突變分析，并對(duì)酶與底物的相互作用進(jìn)一步研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基

匍枝根霉菌株，大腸桿菌DH 5α、BL 21(DE 3)，pET-22b(+)載體均保藏于安徽工程大學(xué)可再生資源研究實(shí)驗(yàn)室。

種子培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，pH自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基:2 g玉米秸稈，5%麩皮浸出汁，(NH4)2SO43%，KH2PO41%，MgSO4·7H2O 1%，CaCl22%，Tween 80 0.025%，微量元素液。

LB 培養(yǎng)基:蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g。

篩選LB平板:蛋白胨 10 g，酵母粉 5 g，NaCl 10 g，氨芐青霉素(100 μg/mL)。

1.1.2 主要試劑

Trizol提取試劑盒、mRNA純化試劑盒，pUCm-T載體購(gòu)自上海生工。M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit、T4DNA ligation、Xho I、Hind III、DNA maker、蛋白質(zhì)maker購(gòu)自寶生物(大連)有限公司，基因的測(cè)序由上海生工完成。

1.2 匍枝根霉總RNA及基因組DNA的抽提

匍枝根霉總RNA抽提采用Trizol法，起始菌體量為500 mg，具體步驟參照說(shuō)明書(shū)［9］。

匍枝根霉基因組DNA抽提采用CTAB法［10］。

1.3 bgl3基因擴(kuò)增

根據(jù)GenBank上已經(jīng)公布的β-葡萄糖苷酶基因序列，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(Forward primer:5'-CCCAAGCTTATGATCTGGGACACTTTTTGCAAG-3';Reverse primer:5'-CCGCTCGAGATGGTGATGGTGATGATGCTCCATCAAACTCCACGCCATGTA-3')，并在其上下游引入酶切位點(diǎn)Xho I和Hind III(下劃線部分所示)。

PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)(25 μL體系)10×Taq Buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，上游引物 1.0 μL，下游引物 1.0 μL，模板 1 μL，TaKaRa Taq Enzyme 0.15 μL，ddH2O補(bǔ)至 25 μL。

反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，54℃退火 30 s，72℃延伸2 min，30 個(gè)循環(huán)，最后 72℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物與pUCM-T連接后轉(zhuǎn)化DH5α，基因序列測(cè)定委托上海生工完成。

1.4 bgl3的生物信息學(xué)分析

將獲得的DNA序列，輸入GenBank，用Blast程序與數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比較分析，利用DNAMAN 6.0進(jìn)行開(kāi)放閱讀框分析。根據(jù)PROSITE數(shù)據(jù)庫(kù)(http://cn.expasy.org/prosite/)、PROTRARAM((http://web.expasy.org/protparam/)、CDD數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Stmcture/cdd/wrpsb.cgi)、DNAMAN、DNASTAR 等軟件，完成對(duì)bgl3的生物信息學(xué)分析。在以上的基礎(chǔ)上利用Discovery Stodio 2.5軟件進(jìn)行進(jìn)一步分析。

1.5 bgl3的基因突變

根據(jù)bgl3的生物信息學(xué)分析結(jié)果，確定與酶催化效率相關(guān)的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)。以構(gòu)建好的pUCMT-bgl3為模板，利用重疊PCR完成關(guān)鍵氨基酸的定點(diǎn)突變。重疊PCR引物如表1所示(下劃線表示突變位點(diǎn))。

表1 重疊PCR各引物序列Tabel 1 The sequences of primers for overlapping PCR

1.6 重組大腸桿菌的構(gòu)建

將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物與pET-22b(+)載體經(jīng)Xho I和HindIII雙酶切后16℃過(guò)夜連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-22b(+)-bgl3，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂布篩選LB平板。對(duì)挑選出的陽(yáng)性克隆子進(jìn)行PCR及雙酶切驗(yàn)證。

1.7 重組載體的誘導(dǎo)表達(dá)

從新鮮的LB平板上挑取重組菌菌落，分別接種于20 mL帶有氨芐抗性的 LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)，1%分別接種至30 mL含有氨芐抗性的LB和自誘導(dǎo)培養(yǎng)基，37℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600為0.6～1.0時(shí)，加入終濃度為1 mmol/L的 IPTG，25℃誘導(dǎo)12 h。每2 h取樣。

1.8 酶活測(cè)定

采用DNS法測(cè)定 β-葡萄糖苷酶的活力［11］。酶活定義為:在β-葡萄糖苷酶的催化下，每分鐘水解水楊苷生成1 μmol葡萄糖所需的酶量為1個(gè)酶活力國(guó)際單位IU。

2 結(jié)果與討論

2.1 bgl3基因的克隆及分析

從基因組DNA克隆得到一段1 696 bp的序列，根據(jù)相同引物，以cDNA單鏈為模板，克隆得到一段1 452 bp序列。利用DNAMAN進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，前者比后者多出兩端序列(分別為153 bp和91 bp)，推測(cè)為內(nèi)含子序列。

CDD數(shù)據(jù)庫(kù)的分析結(jié)果顯示，bgl3編碼的蛋白質(zhì)歸屬于糖苷水解酶第1家族(Glycoside Hydrolase Family 1)，包含2個(gè)GH1家族的特征序列。PROTPARAM預(yù)測(cè)其編碼蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果顯示其編碼483個(gè)氨基酸，目的蛋白大小預(yù)計(jì)為54.3 kDa，理論pI值為5.07，酸性氨基酸殘基總數(shù)(Asp+Glu)為67，堿性氨基酸(Arg+Lys)為48，表明其為酸性蛋白質(zhì)。

2.2 BGLIII生物信息學(xué)分析

2.2.1 BGLIII的同源建模及分子對(duì)接

利用DS 2.5進(jìn)行BGLIII的同源建模，模擬其催化活性中心。以纖維二糖作為底物，模擬酶與底物的相互作用，從而進(jìn)一步明確酶作用過(guò)程中的關(guān)鍵氨基酸的作用。

圖1 β-葡萄糖苷酶與纖維二糖對(duì)接結(jié)果及酶與底物相互作用細(xì)節(jié)Fig.1 Docking results of β-glucosidase and cellobiose

對(duì)接結(jié)果中，纖維二糖構(gòu)象都處于β-桶裝折疊上方，且具有較強(qiáng)的親和力。纖維二糖和β-葡萄糖苷酶的結(jié)合口袋具有很好的幾何互補(bǔ)性，圖1表明，參與相互作用的氨基酸有 Gln23，His126，Trp127，Asn172，Glu173，Tyr315，Trp356，Glu384，Trp443 等。它們?cè)跊Q定酶的催化過(guò)程中起著重要作用。Tyr315和Glu173與底物形成氫鍵共同作用，使第1個(gè)進(jìn)入活性中心的葡萄糖基翻轉(zhuǎn)90°，Cys176更有效地作用于2個(gè)葡萄糖基連接的O(8)，Trp356與底物形成氫鍵作用于第二個(gè)葡萄糖基，從而斷裂β-1，4糖苷鍵。

側(cè)鏈基團(tuán)的大小與位阻成正比，通過(guò)對(duì)參加反應(yīng)的物質(zhì)進(jìn)入酶催化中心造成位阻效應(yīng)，從而影響酶的催化活性［12］。Trp127位于第2β-片層(Ile118-Asp128)，推測(cè)此殘基與酶的催化活性有關(guān)，故將Trp127突變?yōu)楹煌瑐?cè)鏈的氨基酸(Ala，Leu，Phe)。

表面靜電勢(shì)的改變對(duì)于BGLIII與纖維二糖間的相互作用、分子間的反應(yīng)部位以及分子識(shí)別等方面具有非常獨(dú)到的作用。圖2中顯示出突變前后分子表面靜電勢(shì)的變化，關(guān)鍵位點(diǎn)127位分子表面在突變后帶負(fù)電。此外，分子的表面靜電勢(shì)與疏水性之間存在著非常明顯的相關(guān)關(guān)系［13］。Leu和Ala側(cè)鏈的親水指標(biāo)為零，Phe側(cè)鏈的親水指標(biāo)也非常小(HPhe=-0.119 5)［14］。突變后蛋白質(zhì)疏水性的改變對(duì)于酶活性中心的三維結(jié)構(gòu)有很大的影響。

圖2 突變前后蛋白表面靜電勢(shì)的變化Fig.2 The change of surface electrostatic potential

2.2.2 BGLIII分子動(dòng)力學(xué)分析

分子動(dòng)力學(xué)能夠動(dòng)態(tài)的描述分子的運(yùn)動(dòng)狀況。可以更有助于酶催化反應(yīng)機(jī)理的研究。利用軟件對(duì)突變前后的BGLIII進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬分析，并計(jì)算蛋白-配體之間的相互作用能。

由圖3可知，與突變前相比，W127A和W127F范德華相互作用能略有降低(分別降低9.7%和6.6%)，酶與底物相互作用能和靜電相互作用能變化較大(W127A降低17.9%，W127F提高15.2%)，而W127L的范德華相互作用能及靜電相互作用都有較大變化(分別提高了9.0%和18.4%)。酶與底物相互作用過(guò)程中每一步能量的變化顯示出突變后酶活性中心與底物結(jié)合過(guò)程中作用力的變化。W127L相互作用能的改變預(yù)示了合理的結(jié)合構(gòu)象。

圖3 突變前后相互作用能曲線示意圖Fig.3 The change of interaction energy

圖4 突變前后β-葡萄糖苷酶與纖維二糖相互作用細(xì)節(jié)Fig.4 The change of hydrogen bonds between β-glucosidase and cellobiose

Trp含有苯環(huán)，將其突變成不含苯環(huán)的Leu，參與酶與底物結(jié)合的氫鍵增多，作用增強(qiáng)。將其突變?yōu)橥瑯雍斜江h(huán)的Phe，則無(wú)太多變化。氫鍵的形成可能會(huì)影響到分子間的緊密排布。推測(cè)127位氨基酸空間構(gòu)象上，苯環(huán)或是長(zhǎng)鏈對(duì)酶與底物作用過(guò)程中都起著重要的作用。

2.3 bgl3的定點(diǎn)突變及誘導(dǎo)表達(dá)

利用重疊PCR對(duì)bgl3進(jìn)行127位Trp進(jìn)行定點(diǎn)突變，將127位色氨酸的TGG基因變?yōu)镃TG、GCA和TTT。

測(cè)序正確后，分別將bgl3和bgl3-mut以及pET-22b(+)進(jìn)行Xho I和HindIII雙酶切，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，在含有氨芐青霉素的LB平板上獲得重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子。通過(guò)菌液PCR和雙酶切驗(yàn)證。

將構(gòu)建好的各重組菌及突變株接種于新鮮的含有氨芐青霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)。對(duì)誘導(dǎo)前后上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析，目的蛋白分子質(zhì)量約54 kDa，結(jié)果如圖5所示。酶活測(cè)定結(jié)果顯示(圖6):W127的最高酶活為0.813IU/mL，而 W127A的最高酶活為0.644 IU/mL，W127F的最高酶活為 0.881 IU/mL，較 W127提高了8.46%，W127L的最高酶活為1.090 IU/mL，較W127提高了34.07%。

2.4 討論

圖5 SDS-PAGE分析表達(dá)蛋白Fig.5 Results of SDS-PAGE

圖6 重組菌與各突變株的發(fā)酵酶活Fig.6 Fermentation characteristics of different recombinant E.coli BL21

實(shí)驗(yàn)成功克隆了匍枝根霉的β-葡萄糖苷酶bgl3基因，并對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)功能分析。該基因編碼蛋白BGLIII的結(jié)構(gòu)與GH1家族蛋白質(zhì)(α/β)8-TIM桶結(jié)構(gòu)類似，每個(gè)折疊包含有槽狀的活性位點(diǎn)裂口和多個(gè)外部開(kāi)口，活性位點(diǎn)包含2個(gè)關(guān)鍵的谷氨酸殘基。其中，位于特征序列TFNEP中的Glu173作為催化酸/堿基團(tuán)，位于第4 β-片層的末端;而位于特征序列VTENG中的Glu384作為催化親核試劑，位于第7 β-片層的末端。對(duì)接結(jié)果顯示，底物構(gòu)象都處在酶活性中心的上方，并且具有較強(qiáng)的親和力(-16.763 4 kJ/mol)［15］。

本文選擇127位色氨酸進(jìn)行進(jìn)一步研究。Trp位于活性中心一側(cè)，且在活性中心與底物結(jié)合過(guò)程中扮演重要的角色。Trp對(duì)隸屬于GH1家族的酶具有有效緩解葡萄糖抑制的作用。在酶與底物作用過(guò)程中，Gln23、His126、Tyr315和Glu443起到底物識(shí)別的作用，Trp127在空間構(gòu)象上與 Asn172、His126、Cys176、Glu173接近，同時(shí)參與糖苷結(jié)合過(guò)程。色氨酸帶有苯環(huán)，其苯環(huán)側(cè)鏈可以穩(wěn)定催化中心構(gòu)象，從而使糖苷結(jié)合到催化中心。當(dāng)突變?yōu)椴粠?cè)鏈的Ala時(shí)，與Glu173空間由2.523?增大到3.143?，空間位阻發(fā)生變化，不能維持糖苷結(jié)合位點(diǎn)原有構(gòu)象，導(dǎo)致酶活大幅度降低。而當(dāng)突變?yōu)榫哂邢嗤江h(huán)側(cè)鏈的Phe時(shí)，與His126、His126和Tyr315等其他殘基氫鍵及疏水作用力變化不大，則進(jìn)一步證明了，氨基酸空間構(gòu)象對(duì)底物活性中心的重要性。當(dāng)突變?yōu)榫哂袔в蟹潜江h(huán)長(zhǎng)鏈的Leu時(shí)，酶活較大提高，可能是由于Leu的長(zhǎng)鏈在維持原有構(gòu)象的基礎(chǔ)上，Tyr315與底物空間距離縮短18.52%，氫鍵能量增加19.71%，Glu384與底物空間距離縮短10.12%，氫鍵能量增加28.91%，使得水解β-，1，4糖苷鍵作用力增強(qiáng)，同時(shí)葡萄糖的疏水作用的增強(qiáng)，進(jìn)一步提高葡萄糖耐受性。而突變后的親和力的變化(W127A、W127F、W127L的底物親和力分別為 -14.285 kJ/mol、-17.449 9 kJ/mol、-18.176 3 kJ/mol)也進(jìn)一步證明了上述推測(cè)。

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