3種低值海參中海參多糖的提取分離及化學(xué)組成研究*

胡艷芳，董書(shū)君，續(xù)曉琪，于龍，常耀光，薛長(zhǎng)湖，王彥超

(中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島，266003)

海參(sea cucumber)是棘皮動(dòng)物門(mén)海參綱動(dòng)物的總稱(chēng)。世界海參資源豐富，全球約有海參1 100余種，其中可食用者40余種［1］。海參自古以來(lái)即被我國(guó)人民視為滋補(bǔ)食品，現(xiàn)已證實(shí)海參體壁中含有海參多糖、磷脂、皂苷、膠原蛋白等多種功效成分［2-3］。除養(yǎng)殖品種仿刺參外，其他品種的海參尤其是一些進(jìn)口海參由于價(jià)格相對(duì)低廉，在我國(guó)市場(chǎng)上也形成了可觀的消費(fèi)量。低值海參口感較差，食用價(jià)值較低，研究并利用其中的功效成分，將是實(shí)現(xiàn)低值海參資源高值化利用的有效途徑。

海參多糖是海參體壁的重要組成物質(zhì)，主要包括海參硫酸軟骨素(sea cucumber chondroitin sulfate，SC-CHS)及海參巖藻聚糖硫酸酯(sea cucumber fucoidan，SC-FUC)2種組分。其中，SC-CHS是具有硫酸軟骨素主鏈結(jié)構(gòu)及巖藻糖支鏈的一種酸性黏多糖，已被證實(shí)具有降血脂［4］、抗腫瘤［5］、抗凝血［6］、增強(qiáng)免疫力［7］、抗血栓形成［8］多種生理調(diào)節(jié)功能;SC-FUC主要由巖藻糖及硫酸根組成，能夠有效預(yù)防酒精性胃潰瘍［9］、保肝［10］、預(yù)防急性酒精中毒［11］以及抵抗破骨細(xì)胞的形成［12］。多糖類(lèi)物質(zhì)的功能與其化學(xué)組成密切相關(guān)。Luo 等［6］對(duì) H olothuria edulis、Apostichopus japonicas及Holothuria nobilis海參多糖組分的抗凝血活性研究表明，由于SC-CHS及SC-FUC的單糖組成及硫酸根含量不同導(dǎo)致其抗凝血活性具有較大差異;張珣等［13］比較研究了海地瓜(Acaudina molpadioidea)與北大西洋瓜參(Cucumaria frondosa)SCFUC的抗腫瘤作用，發(fā)現(xiàn)硫酸化程度較高的北大西洋瓜參SC-FUC的抗腫瘤作用較強(qiáng)。因此，提取海參多糖并明確其化學(xué)組成是對(duì)海參多糖進(jìn)行深入研究與開(kāi)發(fā)的前提基礎(chǔ)。

基于此背景，本研究擬以3種市售價(jià)格均低于1 000元/kg的低值海參為原料，首先通過(guò)分子生物學(xué)手段確證其種屬，在此基礎(chǔ)上提取海參多糖，并利用陰離子交換色譜對(duì)海參多糖進(jìn)行分離純化，進(jìn)而對(duì)海參多糖及其各組分的單糖組成、硫酸根含量及分子質(zhì)量等性質(zhì)進(jìn)行分析。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

商品名為黃玉參、沙參及土耳其參的3種低值海參干品購(gòu)于青島市南山水產(chǎn)市場(chǎng);海洋生物DNA提取試劑盒，天根生化科技有限公司;Taq Mix，俄羅斯Biomed公司;木瓜蛋白酶，廣西南寧龐博生物工程有限公司;氯化十六烷基吡啶(cetylpyridinium chloride，CPC)，上海生工生物工程有限公司;Express-Ion D，美國(guó) GE healthcare公司;1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)，分析純，上?；瘜W(xué)試劑公司;乳糖(Lac)，上?；瘜W(xué)試劑有限公司;D-甘露糖(Man)、D-(+)-氨基半乳糖(GalN)、D-(+)-氨基葡萄糖(GlcN)、D-葡萄糖、D-半乳糖(Gal)、D-葡萄糖醛酸(GlcUA)、L-巖藻糖(Fuc)、右旋糖酐系列標(biāo)準(zhǔn)品(dextran，MW5 000、12 000、50 000、150 000、270 000、410 000、670 000、1 400 000)，Sigma公司;乙腈(色譜純)，美國(guó)Honeywell公司;其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

UV-2550型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司;冷凍干燥機(jī)(Alpha 1-4LD)，德國(guó)Christ公司;1100型高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent公司;ICS-2000型離子色譜儀，美國(guó)Dionex公司;PCR儀，美國(guó)BIORAD公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 海參種屬鑒定

利用分子生物學(xué)手段，通過(guò)擴(kuò)增、比對(duì)16S rDNA基因序列鑒定各海參的種屬。將3種干海參清凈、烘干、磨粉后，以海洋生物DNA提取試劑盒分別提取其基因組DNA。參照Kerr［14］報(bào)道中的引物(16Sar:5'-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3'，16Sbr:5'-CTCCGGTTTGAACTCAGATCA-3')，以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)體系為:DNA模板10～100ng、引物(10 μmol/L)各 2.5 μL、Taq Mix 25 μL，雙蒸水補(bǔ)充至50 μL。PCR反應(yīng)條件為:95℃反應(yīng)30 s變性;95℃反應(yīng)30 s，50℃ 30s退火，72℃ 1 min，40 個(gè)循環(huán);72℃ 4min。PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序。利用NCBI的BLAST程序，將測(cè)得序列與Gene Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)，找到一致度最高的基因序列從而確認(rèn)各海參的拉丁文名。

2.2 海參多糖的提取

取50g海參體壁干粉加入1.5 L乙酸鈉緩沖溶液(0.1 mol/L，pH 6.0，含 5 mmol/L EDTA 及 5 mmol/L半胱氨酸鹽酸鹽)及5.0 g木瓜蛋白酶，60℃水浴反應(yīng)12 h。酶解液離心(4 500 r/min，10 min)，取上清液并加入80 mL CPC溶液(0.1 g/mL)，于室溫下放置12h后將沉淀溶解于750 mL V(4 mol/L NaCl)∶V(乙醇)=100∶15溶液中。加入1.5L體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液，4℃下靜置12 h后離心，沉淀以蒸餾水復(fù)溶，以截留分子質(zhì)量為8 000～14 000 Da的透析袋進(jìn)行透析，截留液凍干后得到海參多糖。測(cè)定各海參多糖的單糖組成及硫酸根含量。

2.3 海參多糖的分離純化

利用Express-Ion D陰離子交換填料(3.8 cm×25 cm)對(duì)海參多糖進(jìn)行分離純化。取各海參多糖1.0 g溶于30 mL 25 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4(pH 6.3)緩沖液中，以0～2 mol/L NaCl進(jìn)行線性梯度洗脫，流速5 mL/min，利用分部收集器收集餾分，以改良苯酚-硫酸法［15］檢測(cè)各管中多糖含量。對(duì)測(cè)定曲線上的峰尖各管進(jìn)行收集，并以截留分子質(zhì)量為8 000～14 000 Da的透析袋透析，凍干后得到海參多糖的各組分，分別測(cè)定各組分的單糖組成、硫酸根含量及分子質(zhì)量。

2.4 單糖組成測(cè)定

采用PMP柱前衍生-HPLC法測(cè)定單糖組成［16-17］。稱(chēng)取各樣品2.0 mg置于安瓿瓶中，加入1 mL 2 mol/L TFA，充氮?dú)夥夤埽?10℃下水解8 h，冷卻至室溫，揮干，并以超純水復(fù)溶，以0.3 mol/L NaOH溶液調(diào)至中性，定容至1 mL。取400 μL加入50 μL 2 mmol/L 的 Lac，加入 450 μL PMP 及 450 μL 0.3 mol/L NaOH，70℃水浴反應(yīng) 30 min，冷卻后以450 μL 0.3 mol/L HCl中和，后以1 mL三氯甲烷萃取，取上層水相進(jìn)行色譜分析。色譜條件:色譜柱，Zorbax E-clipse XDB-C18分離柱(4.6 mm ×150 mm);柱溫，25℃;流動(dòng)相，流動(dòng)相A，體積分?jǐn)?shù)10%乙腈+0.1 mol/L CH3COONH4-CH3COOH緩沖液(pH 5.5)，流動(dòng)相B，體積分?jǐn)?shù)25%乙腈+0.1 mol/L CH3COONH4-CH3COOH緩沖液(pH 5.5);時(shí)間梯度為0～40 min，體積梯度為45% ～100%B;流速，1.0 mL/min;進(jìn)樣體積，10 μL。利用各單糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定量。

2.5 硫酸根含量測(cè)定

硫酸根含量測(cè)定采用離子色譜法［18］。取各樣品2.0 mg于安瓿瓶中，加1 mL 2mol/L TFA，充氮?dú)夥夤埽?10℃下水解10h，后揮干TFA，以超純水溶解并定容至25mL，進(jìn)行上機(jī)測(cè)定。色譜條件:色譜儀:ICS-2000離子色譜儀;色譜柱:Ionpac AS11-HC(4 mm×250 mm);抑制器:ASRS ULTRA II陰離子抑制器，抑制電流:90 mA;柱溫:30℃;淋洗液:20 mmol/L KOH;流速:1.2 mL/min;進(jìn)樣體積:25 μL;定量標(biāo)準(zhǔn)品:Na2SO4。

2.6 分子質(zhì)量測(cè)定

利用高效凝膠排阻色譜法(HPSEC)法測(cè)定分子量。色譜條件如下:色譜柱:TSK-gel G4000 PWxl(30.0 cm×7.8 mm i.d.);柱溫:40℃;檢測(cè)器:示差檢測(cè)器(RID);流動(dòng)相:0.2 mol/L NaCl;流速:0.5 mL/min。以各分子質(zhì)量的dextran為標(biāo)準(zhǔn)品，利用Aglient GPC計(jì)算樣品的分子質(zhì)量。

2.7 統(tǒng)計(jì)分析

樣品重復(fù)測(cè)定3次，取其平均值。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用SPSS16.0分析軟件，顯著性差異分析采用LSD檢測(cè)。以P＜0.05為統(tǒng)計(jì)檢測(cè)顯著性差異。

3 結(jié)果與討論

3.1 種屬鑒定

對(duì)市售3種低值干海參的種屬進(jìn)行鑒定，結(jié)果列于表1。

表1 海參種屬鑒定結(jié)果Table 1 Species identification of sea cucumbers

目前市售海參的商品名稱(chēng)仍較為混亂，大多使用俗名，一種多名、重名的現(xiàn)象普遍，多種進(jìn)口海參品種亦缺乏對(duì)應(yīng)的中文學(xué)名，一般按照形態(tài)、產(chǎn)地等信息命名貼標(biāo)。鑒于此情況，有必要首先對(duì)海參的種屬進(jìn)行鑒定，以保證研究結(jié)論的準(zhǔn)確性。由于鮮活海參不易于儲(chǔ)藏運(yùn)輸，海參一般以干制品的形式出售，而加工過(guò)程中原料的形態(tài)學(xué)特征往往遭到破壞，因此擬通過(guò)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法準(zhǔn)確鑒別干海參的種類(lèi)其難度較大。分子生物學(xué)方法為海參的種屬鑒定提供了可靠手段。線粒體DNA結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，包含蛋白質(zhì)、rRNA、tRNA等編碼基因及非編碼控制區(qū)，有一定的遺傳自主性，這些功能區(qū)段常作為開(kāi)展遺傳進(jìn)化研究的重要標(biāo)記［19-20］，費(fèi)來(lái)華等［21］擴(kuò)增了 10 個(gè)海參種的 16S rDNA序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)16S rDNA序列在不同科屬間存在明顯差異，是鑒定海參種屬的適宜序列。

對(duì)商品名為“黃玉參”、“沙參”及“土耳其參”3種海參的16S rDNA序列進(jìn)行 PCR擴(kuò)增、測(cè)序及BLAST分析，在Gene Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)了與其一致度高達(dá)99%的已知16S rDNA序列，分別來(lái)源于Stichopus naso、Holothuria floridana及 Holothuria tubulosa，從而確定了3種海參的種屬信息。其中，黃玉參屬于楣手目刺參科，沙參、土耳其參屬于楯手目海參科。

3.2 海參多糖的提取與分析

以蛋白酶酶解結(jié)合CPC沉淀提取得到海參多糖，其得率及其化學(xué)組成如表2所示。

表2 各海參多糖的得率、單糖組成及硫酸根含量Table 2 Yield and chemical characteristics of polysaccharides from various sea cucumbers

得率數(shù)據(jù)表明，3種海參體壁中均含有豐富的海參多糖，是海參多糖提取的良好原料。3種海參多糖均由多種單糖組成，包括中性糖、氨基糖及糖醛酸，雖種類(lèi)一致，但3種海參多糖的單糖組成比例之間存在差異。3種海參多糖均含有豐富的硫酸根，三者硫酸根含量之間無(wú)顯著性差異。

3.3 海參多糖的分離純化

利用Express-Ion D填料純化海參多糖的分離圖譜如圖1所示。

由于3種海參多糖均具有較高含量的硫酸根，屬于陰離子多糖，因此可通過(guò)陰離子交換色譜法對(duì)其進(jìn)行分離純化。Express-Ion D是一種新型的弱陰離子交換纖維素，具有快速吸附和解吸附的動(dòng)力學(xué)性能。本研究采用該填料對(duì)海參多糖進(jìn)行分離純化，各種海參多糖經(jīng)NaCl線性梯度洗脫后，其分離圖譜均呈現(xiàn)出2個(gè)洗脫峰:第1個(gè)峰的洗脫鹽濃度約為0.9 mol/L，第2個(gè)峰洗脫的鹽濃度約為1.2 mol/L，2個(gè)峰的分離度較好。將2個(gè)組分分別命名為F1及F2，其得率及單糖組成的分析結(jié)果列于表3。單糖組成的測(cè)定結(jié)果表明，各海參多糖的F1組分中均含有GlcUA、GalN及 GlcN，符合 SC-CHS的單糖組成特征［22-23］，確認(rèn)為 SC-CHS;F2組分的組成單糖僅有Fuc一種，確認(rèn)為SC-FUC。后續(xù)HPSEC實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)收集得到的各SC-CHS及SC-FUC組分均具有良好的純度。

3種海參的海參多糖均由SC-CHS及SC-FUC 2個(gè)組分組成，這與目前大部分關(guān)于海參多糖的研究報(bào)道相吻合。Mourao等人［15］報(bào)道在 Ludwigothurea grisea中還存在一種由Fuc和少量氨基糖組成的多糖組分，Luo等［6］在 Holothuria nobilis中發(fā)現(xiàn)了一種不含硫酸根的中性葡聚糖，VarshaKale等［24］報(bào)道在北大西洋瓜參中存在含有乙酰神經(jīng)氨酸的多糖，上述組分在本研究的3種海參中都沒(méi)有被發(fā)現(xiàn)，提示不同來(lái)源的海參多糖之間存在著種間差異性。

圖1 各海參多糖Express-Ion D分離圖譜Fig.1 Express-Ion D separating curves of crude polysaccharides from various sea cucucmbers

3.4 海參多糖組分的化學(xué)組成分析

各海參多糖組分的化學(xué)組成分析結(jié)果列于表3。黃玉參、沙參及土耳其參SC-CHS所含單糖的種類(lèi)相同，但各單糖比例之間存在明顯差異，提示上述3種海參的 SC-CHS具有不同的一級(jí)結(jié)構(gòu)。Kariya等人［12］對(duì)日本刺參(Stichopus japonicus)SC-CHS 的研究發(fā)現(xiàn)，其組成單糖僅為GlcUA、GalN及Fuc，樊繪曾等人［23］對(duì)玉足海參 SC-CHS的研究指出，其組成單糖也僅含有GlcUA、GalN及Fuc 3種單糖。黃玉參、沙參及土耳其參SC-CHS中除含有GlcUA、GalN及Fuc外，還含有GalN、Gal及Man等單糖，提示3種海參SC-CHS可能具有新穎結(jié)構(gòu)。3種海參SC-CHS的分子質(zhì)量相對(duì)集中，均在100 kDa左右。

3種海參的SC-FUC均僅由Fuc一種單糖組成。于龍等人［25］研究發(fā)現(xiàn)，北大西洋瓜參SC-FUC中含有較高含量的 Gal，Zhang等人［26］從日本刺參體壁中提取得到的SC-FUC除含有大量Fuc外也含有少量Gal，但在梅花參(Thelenota ananas)、海地瓜及美國(guó)肉參(Isostichopus badionotus)的SC-FUC中均沒(méi)有發(fā)現(xiàn) Gal的存在［27-29］。3種 SC-FUC的分子量巨大，彼此之間亦存在差異，且均高于相同海參來(lái)源SC-CHS的分子質(zhì)量，這與宿瑋等人［30］的研究結(jié)果類(lèi)似。

表3 各海參多糖組分的得率、單糖組成、分子量及硫酸根含量Table 3 Yield，molecular mass，monosaccharide composition and sulfate content of Ion D separated fractions

3種海參SC-FUC及SC-CHS的硫酸根含量豐富，均大于20%。比較發(fā)現(xiàn)，SC-FUC的硫酸根含量顯著高于同種海參來(lái)源SC-CHS的硫酸根含量(P＜0.05);黃玉參SC-FUC及SC-CHS的硫酸根含量均顯著高于沙參及土耳其參中同種多糖組分的硫酸根含量(P＜0.05)。3種海參中，黃玉參屬于刺參科，廣泛分布于印度洋及太平洋海域;而沙參及土耳其參屬于海參科，前者主要分布于墨西哥灣及加勒比海地區(qū)，后者主要分布于地中海。不同海參多糖之間的差異可能與海參的種屬及生長(zhǎng)海域等因素有關(guān)。

4 結(jié)論

黃玉參、沙參及土耳其參3種低值海參中的海參多糖由SC-CHS及SC-FUC 2個(gè)組分組成。對(duì)各樣品的單糖組成、硫酸根含量及分子質(zhì)量的分析結(jié)果表明，3種海參多糖及其組分的化學(xué)組成隨海參來(lái)源的不同而存在差異。本文是對(duì)上述3種海參中多糖的首次研究，結(jié)果可為其開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)，并為進(jìn)一步研究各海參多糖組分的精細(xì)結(jié)構(gòu)與功能奠定了基礎(chǔ)。

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