擬干酪乳桿菌乳酸發(fā)酵培養(yǎng)基氮源優(yōu)化*

李曉飛，田錫煒，王永紅

(華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室，上海，200237)

乳酸的生產(chǎn)方法主要有發(fā)酵法、合成法和酶化法［1］。與化學(xué)合成方法相比，微生物發(fā)酵法以其“綠色”的特點而成為生產(chǎn)貴重產(chǎn)品的一種重要方式［2］。乳酸最具應(yīng)用前景的一個方向就是用于生產(chǎn)生物可降解的聚乳酸(polylactic acid，PLA)。但是，乳酸單體高昂的生產(chǎn)成本限制了其得到廣泛應(yīng)用。

進(jìn)行同型發(fā)酵的乳酸菌在厭氧條件下經(jīng)過EMP途徑，將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸，產(chǎn)生大量的ATP，但是卻不能夠產(chǎn)生重要的前體和中間代謝物，如嘌呤、嘧啶、5-磷酸核糖和芳香族氨基酸。因此，乳酸菌的生長需要特定的生長因子［3］。在實際生產(chǎn)過程中，通過添加氮源等物質(zhì)來滿足其對各種生長因子的需求。在眾多的氮源中，酵母提取物由于含有豐富的含氮化合物、嘌呤和嘧啶堿基以及各種維生素而成為最好的氮源之一。可是，YE的成本占到乳酸生產(chǎn)總成本的38%，所以，降低乳酸發(fā)酵培養(yǎng)基中有機(jī)氮源的成本勢在必行［4］。用廉價的有機(jī)氮源替代培養(yǎng)基中的YE是一個很好的研究方向，但是由于乳酸菌本身對營養(yǎng)成分要求較高，替代后產(chǎn)酸濃度或產(chǎn)酸速率往往低于工業(yè)生產(chǎn)要求。

本文從生產(chǎn)原料成本的角度出發(fā)，在保證乳酸生產(chǎn)效率的前提下，合理增加培養(yǎng)基中的碳氮比，同時采用工業(yè)級有機(jī)氮源對試劑級有機(jī)氮源進(jìn)行替代，有效地降低了乳酸生產(chǎn)的原料成本，為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)乳酸的原料成本控制提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌種

擬干酪乳桿菌Lactobacillus paracasei，由本實驗室篩選獲得，菌種用甘油與水等體積混合液與種子液1∶1混合后于-20℃下保存。

1.1.2 試劑

1水葡萄糖，山東西王糖業(yè)有限公司;胰蛋白胨(Tryptone)Oxoid;酵母提取物，Oxoid;牛肉提取物(Beef Extract)，上海生工生物有限公司;試劑級酵母粉(FM828、FM888)、酵母膏(LM808)，工業(yè)級酵母自溶粉(FM801)、酵母粉(FM802、FM803)、酵母膏(LM800)，酵母蛋白胨 FP101、胰蛋白胨 FP318、牛骨蛋白胨(FP326、FP328)，安琪酵母股份有限公司;其他試劑來源于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 儀器

5 L攪拌式生物反應(yīng)器，上海國強(qiáng)生化工程裝備有限公司;pH和溶氧(DO)電極，梅特勒-托勒多公司;752紫外可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司;SBA-40E生物傳感分析儀，山東省科學(xué)院。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基成分

茄子瓶斜面培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖40，胰蛋白胨10，牛肉提取物 6，酵母提取物10，乙酸鈉4，檸檬酸氫二銨 2，K2HPO42，MgSO40.2，MnSO40.2，NaCl 0.03，F(xiàn)eSO40.01，吐溫 -80 1 mL，CaCO310(培養(yǎng)基用NaOH調(diào)pH為6.0之后加)，瓊脂18，NaOH調(diào)pH至6.0，115℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖40，胰蛋白胨 10，牛肉提取物10，酵母提取物10，乙酸鈉4，檸檬酸氫二銨 2，K2HPO42，MgSO40.2，MnSO40.2，NaCl 0.03，F(xiàn)eSO40.01，吐溫 -80 1 mL，CaCO325。NaOH 調(diào) pH至 6.0，葡萄糖單獨滅菌，條件為 115 ℃，20 min［5］。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 135，胰蛋白胨13.33，酵母提取物 13.33，乙酸鈉 0.67，MgSO40.013 3，MnSO40.013 3，NaCl 0.013 3，F(xiàn)eSO40.013 3，Ca-CO360(發(fā)酵罐實驗中不添加)。用NaOH調(diào)pH至6.0，葡萄糖單獨滅菌，條件為115℃，20 min。

對照組發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖135，胰蛋白胨6，酵母提取物 6，乙酸鈉 0.67，MgSO40.013 3，MnSO40.013 3，NaCl 0.013 3，F(xiàn)eSO40.013 3，CaCO360(發(fā)酵罐實驗中不添加)。用NaOH調(diào)pH至6.0，葡萄糖單獨滅菌，條件為115℃，20 min。

替代發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 135，酵母粉FM802 6，酵母蛋白胨 FP101 6，乙酸鈉 0.67，MgSO40.013 3，MnSO40.013 3，NaCl 0.013 3，F(xiàn)eSO40.013 3，CaCO360(發(fā)酵罐實驗中不添加)。用NaOH調(diào)pH至6.0，葡萄糖單獨滅菌，條件為115℃，0 min。

1.2.2 培養(yǎng)條件

斜面培養(yǎng):取150 μL保藏菌種(見1.1)接種于一級茄子瓶，37℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h后接種至二級茄子瓶，37℃恒溫培養(yǎng)24 h后得到二級茄子瓶，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

種子培養(yǎng):取培養(yǎng)好的二級茄子瓶，用50 mL無菌去離子水懸浮斜面上的菌體，取15 mL菌液接種于半合成種子培養(yǎng)基中(100 mL/250 mL錐形瓶)，在37℃、轉(zhuǎn)速110 r/min的搖床中培養(yǎng)12 h得到種子培養(yǎng)液。

搖瓶發(fā)酵:將種子液以20%的接種量接種于發(fā)酵搖瓶(100 mL/250 mL錐形瓶)中，在37℃、轉(zhuǎn)速110 r/min的搖床中培養(yǎng)，24 h、48 h取樣。

5 L罐發(fā)酵:工作體積為4 L，發(fā)酵控制條件為37℃、150 r/min、通氣0.025 vvm、用氨水做中和劑調(diào)控發(fā)酵液pH值在6.0左右。

上述所有實驗均進(jìn)行3次平行。

1.2.3 細(xì)胞生物量測定

用1 mol/L的HCl將發(fā)酵液稀釋，在752型紫外可見分光光度計620 nm條件下測定其吸光值。HCl的作用是溶解發(fā)酵液中的CaCO3，防止其對A620造成干擾。細(xì)胞生物量用細(xì)胞干重(DCW)來表示，1 OD620相當(dāng)于0.41 g/L DCW。

1.2.4 發(fā)酵液中L-乳酸和葡萄糖測定

取10 mL發(fā)酵液4 000 r/min，離心10 min，取上清液稀釋至合適濃度范圍內(nèi)，利用SBA-40E生物傳感分析儀測定L-乳酸和葡萄糖濃度。

1.2.5 單因素替換實驗

由于各種蛋白胨或酵母粉(膏)中的氮含量相近，因此按等量替換的原則用試劑級酵母浸出汁、酵母粉(FM828、FM888)、酵母膏(LM808 以干重計)、工業(yè)級酵母自溶粉(FM801)、酵母粉(FM802、FM803)、酵母膏(LM800以干重計)分別對發(fā)酵培養(yǎng)基中的酵母提取物(Oxoid)進(jìn)行替換;完成第一步替代之后，進(jìn)一步將發(fā)酵培養(yǎng)基中的胰蛋白胨(Oxoid)分別替換為蛋白胨(國藥)、魚粉蛋白胨、酵母蛋白胨FP101、胰蛋白胨 FP318、牛骨蛋白胨(FP326、FP328)。

表1 試劑代碼表Table 1 Codes table of reagents

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基碳氮比優(yōu)化

保持葡萄糖質(zhì)量濃度在135 g/L，通過等比例改變發(fā)酵培養(yǎng)基中胰蛋白胨和酵母提取物的含量來改變碳氮比，優(yōu)化的目標(biāo)是在不顯著影響菌體產(chǎn)酸的條件下，使發(fā)酵培養(yǎng)基的碳氮比達(dá)到最大值。

初糖質(zhì)量濃度為135 g/L，發(fā)酵24 h時，將胰蛋白胨和酵母提取物的質(zhì)量濃度等比例從原來的13.33 g/L減少至6 g/L時，擬干酪乳桿菌的干重值會顯著下降，產(chǎn)酸量也會有所下降，但是單位細(xì)胞干重的產(chǎn)酸量達(dá)到最大值，見圖1。此時培養(yǎng)基中的C/N(質(zhì)量比)為28.97，而樂曉潔等優(yōu)化得到干酪乳桿菌適宜的 C/N(質(zhì)量比)為 12∶1 ～13∶1［6］，比本實驗所得數(shù)值高出1倍以上。

之后的替代實驗選取初步優(yōu)化的配方作為對照組，即對照組的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為(g/L):葡萄糖135，胰蛋白胨6，酵母提取物 6，乙酸鈉 0.67，MgSO40.013 3，MnSO40.013 3，NaCl 0.013 3，F(xiàn)eSO40.013 3，CaCO360(發(fā)酵罐實驗中不添加)。

2.2 單因素替代實驗結(jié)果與分析

圖1 發(fā)酵培養(yǎng)基氮源濃度優(yōu)化Fig.1 Optimization of nitrogen concentration in the fermentation medium

2.2.1 搖瓶生長曲線的繪制

為了解擬干酪乳桿菌在搖瓶中的生長情況，使用對照組的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶實驗，結(jié)果見圖2。

圖2 搖瓶生長、產(chǎn)酸及耗糖曲線Fig.2 Growth，acid production and sugar consumption curve of L.paracasei

在搖瓶發(fā)酵過程中，僅依靠CaCO3來調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH，由于CaCO3的調(diào)節(jié)能力有限，隨著乳酸的生成，發(fā)酵液的pH值持續(xù)降低，并不能將其維持在最適pH6.0左右。由菌體在搖瓶中生長、產(chǎn)酸及耗糖曲線可以看到，在0～56 h，乳酸在持續(xù)生成，pH值并不會完全抑制乳酸的生成。因此將取樣點定在24 h和48 h，用來表征替換效果。

2.2.2 酵母粉(膏)替代

按等量(6 g/L)替換的原則用試劑級或工業(yè)級酵母粉(膏)分別對發(fā)酵培養(yǎng)基中的酵母提取物進(jìn)行替換。從圖3看到，對發(fā)酵培養(yǎng)基中的酵母提取物進(jìn)行替代后，表現(xiàn)較為出色的為工業(yè)級酵母粉FM802(E)。雖然發(fā)酵至48 h時其乳酸產(chǎn)量與對照組有15 g/L的差距，但也取得較高的乳酸濃度，同其他試劑級酵母粉達(dá)到相似或更高的產(chǎn)酸水平。因此，選擇以酵母粉FM802替代酵母提取物進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.2.3 蛋白胨替代

圖3 不同酵母膏對L-乳酸產(chǎn)量和菌體生長的影響Fig.3 Effect of different yeast exract on the production of L-lactic acid and the cell growth

在該部分實驗中，發(fā)酵配方中的酵母粉選取FM802，對發(fā)酵培養(yǎng)基中的胰蛋白胨進(jìn)行單因素替代比較，實驗結(jié)果見圖4。

圖4 不同蛋白胨對L-乳酸產(chǎn)量和菌體生長的影響Fig.4 Effect of different peptone on the production of L-lactic acid and the cell growth

通過比較T和K兩組實驗結(jié)果，可以清晰地看到，工業(yè)級蛋白胨FP101可以很好地替代發(fā)酵配方中的胰蛋白胨，替代之后產(chǎn)酸量和菌體干重值較替代之前均有顯著提高，說明與胰蛋白胨相比，F(xiàn)P101更加適合擬干酪乳桿菌的生長和產(chǎn)酸。而且，在所選取的國產(chǎn)蛋白胨中，F(xiàn)P101表現(xiàn)最為出色，在發(fā)酵48 h時，其產(chǎn)酸量明顯高于其他幾種蛋白胨。通過與對照組比較，可以看到，用FM802和FP101對發(fā)酵培養(yǎng)基中的酵母提取物和胰蛋白胨替換之后，產(chǎn)酸量比僅用FM802對發(fā)酵培養(yǎng)基中的酵母提取物進(jìn)行替換有了顯著地提高，但是發(fā)酵至48 h時，同對照組的產(chǎn)酸量仍然有7 g/L的差距。

2.2.4 比例優(yōu)化

用酵母粉FM802和蛋白胨FP101作為最優(yōu)組合，保持兩者的總量(12 g/L)不變，通過調(diào)節(jié)兩者在發(fā)酵培養(yǎng)基中的比例來探究兩者在菌體生長和產(chǎn)酸過程中所起的作用，與此同時，確定發(fā)酵培養(yǎng)基中兩者合適的比例。在以下實驗中各比值均表示酵母粉FM802與蛋白胨FP101的濃度之比。

由圖5可以看出，當(dāng)酵母粉FM802與蛋白胨FP101的比例由0∶12增加到10∶2時，細(xì)胞干重值基本呈線性增加，當(dāng)其繼續(xù)增加到12∶0時，細(xì)胞干重值基本保持不變。由此可見，與蛋白胨FP101相比，酵母粉FM802能極大促進(jìn)菌體生長。Nancib等將此歸結(jié)于酵母粉中含有豐富的B族維生素［7］。

圖5 發(fā)酵培養(yǎng)基中FM802和FP101比例優(yōu)化Fig.5 Proportion optimization of FM802 and FP101 in the fermentation medium

但是，酵母粉FM802對菌體產(chǎn)酸的影響與其對菌體生長的影響有明顯的不同之處。發(fā)酵至24 h時，當(dāng)酵母粉FM802與蛋白胨FP101的比例由0∶12增加到6∶6時，產(chǎn)酸量逐漸增加，當(dāng)兩者比例進(jìn)一步增加時，產(chǎn)酸量趨于平穩(wěn)，但略有增加。發(fā)酵至48 h時，當(dāng)酵母粉FM802與蛋白胨FP101的比例由0∶12增加到6∶6時，產(chǎn)酸量逐漸增加，但是增加幅度卻越來越緩慢，當(dāng)兩者比例繼續(xù)由6∶6增加到12∶0時，產(chǎn)酸量基本維持不變。因此，選擇分別用6 g/L的FM802和FP101對原始發(fā)酵培養(yǎng)基中的酵母提取物和胰蛋白胨進(jìn)行替代。

同時，由圖5也可以看出，氮源成分的改變對擬干酪乳桿菌的生長和產(chǎn)酸產(chǎn)生了不同的影響，即氮源的成分影響了菌體生長和產(chǎn)酸的偶聯(lián)性。在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中菌體的生長和產(chǎn)酸相偶聯(lián)，而在較貧瘠的培養(yǎng)基中大多數(shù)乳酸的生成并不是同生長相偶聯(lián)的，但是這一偶聯(lián)關(guān)系也會受到pH的影響［8-9］。

2.3 5 L罐分批發(fā)酵實驗

用優(yōu)化得到的替代發(fā)酵培養(yǎng)基在5L發(fā)酵罐上進(jìn)行驗證，實驗結(jié)果見圖6及表2。替代后，L-乳酸濃度和最大產(chǎn)酸速率均同對照組達(dá)到了相同的水平，發(fā)酵結(jié)束時間僅比對照組滯后1 h，所以可以由工業(yè)級酵母粉FM802和工業(yè)級蛋白胨FP101很好地對原始發(fā)酵培養(yǎng)基中的酵母提取物和胰蛋白胨進(jìn)行替代。優(yōu)化替代完成后，發(fā)酵培養(yǎng)基中的有機(jī)氮源質(zhì)量濃度僅為12 g/L，這大大降低了有機(jī)氮源的消耗量。Coelho等用44.25 g/L的酵母自溶粉進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實驗，最終產(chǎn)酸濃度僅有60.2 g/L［10］;丁海梅等以28.5 g/L有機(jī)氮源進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，最優(yōu)產(chǎn)酸量為29.8 g/L［11］;李市場等用37.5 g/L的有機(jī)氮源發(fā)酵96 h，產(chǎn)酸量為 97.03 g/L［12］。

圖6 替代前后5L罐分批發(fā)酵結(jié)果對比Fig.6 Comparison of the parameters of 5 L batch fermentation before and after the replacement

表2 5 L罐批發(fā)酵參數(shù)對比Table 2 Parameters of 5 L batch fermentation with control and optimized culture

表3為不同乳酸生產(chǎn)菌有機(jī)氮源需求量和搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酸量對比?？梢钥闯?，在有機(jī)氮源消耗量，產(chǎn)酸量和發(fā)酵時間等方面，本研究均具有很大的優(yōu)勢。

表3 不同乳酸生產(chǎn)菌有機(jī)氮源需求量的比較Table 3 Comparison of the demand for organic nitrogen of different lactic acid production strains

3 結(jié)論

本研究通過對培養(yǎng)基中的碳氮比進(jìn)行優(yōu)化，確定最適有機(jī)氮源質(zhì)量濃度為12 g/L，對應(yīng)的碳氮比(質(zhì)量比)為28.97。在此基礎(chǔ)上，通過單因素替代實驗對多種有機(jī)氮源進(jìn)行比較，最終確定用等量的工業(yè)級酵母粉FM802和工業(yè)級蛋白胨FP101可以完全替代原始發(fā)酵培養(yǎng)基中的酵母提取物和胰蛋白胨。通過5L罐發(fā)酵驗證，F(xiàn)M802和FP101可以很好替代原始發(fā)酵培養(yǎng)基中的酵母提取物和胰蛋白胨，成功的實現(xiàn)了以國產(chǎn)原料代替進(jìn)口原料，替代后，有機(jī)氮源成本降低為原來的1/3，這也為該菌株今后用于工業(yè)生產(chǎn)做出了成功而又有效的探索。

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