應(yīng)用PCR技術(shù)分析釀酒微生物群落的研究展望*

徐瑾，廖永紅，徐嘉良，謝丹，朱博文，錢(qián)沖

(北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京，100048)

白酒釀造過(guò)程中微生物群落復(fù)雜多樣，隨著發(fā)酵的進(jìn)行環(huán)境體系中的微生物構(gòu)成會(huì)發(fā)生變化，而分離培養(yǎng)會(huì)改變?cè)季旱奈⑸鷳B(tài)構(gòu)成，無(wú)法分析微生物之間以及微生物與環(huán)境之間的相互關(guān)系。隨著近代分子生物學(xué)的發(fā)展，對(duì)于白酒微生物的研究已經(jīng)從傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)，轉(zhuǎn)向分子生態(tài)學(xué)，使用分子生態(tài)學(xué)手段研究白酒釀造微生物群落的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)傳統(tǒng)研究方法。筆者結(jié)合操作難易程度、成本、準(zhǔn)確性、試驗(yàn)時(shí)間以及在白酒中的應(yīng)用可行性等因素，對(duì)變性梯度凝膠電泳技術(shù)(PCR-DGGE)、腸道細(xì)菌基因間重復(fù)序列技術(shù)(ERIC-PCR)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性擴(kuò)增技術(shù)(SSCP)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)(PCR-RFLP)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(real-time PCR)的操作原理、操作方法、應(yīng)用領(lǐng)域以及在白酒領(lǐng)域中的應(yīng)用前景進(jìn)行了討論。

1 變性凝膠電泳技術(shù)(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)

DGGE是根據(jù)DNA在不同濃度的變性劑中解鏈行為的不同而導(dǎo)致電泳遷移率發(fā)生變化，從而將片段大小相同而堿基組成不同的DNA片段分開(kāi)的電泳技術(shù)。它是由Fischer和Lerman于1979年最先提出，用于檢測(cè)DNA突變的技術(shù)［4］，如今已經(jīng)發(fā)展成為研究微生物群落組成及親緣關(guān)系的主要手段之一［5］。其基本原理是［6］:DNA分子中4種堿基的組成和排列差異，使不同序列的雙鏈DNA分子具有不同的解鏈溫度。當(dāng)雙鏈 DNA分子在含梯度變性劑(尿素、甲酰胺)聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳時(shí)，不同序列的DNA片段在凝膠的不同位置滯留，電泳結(jié)束時(shí)，形成相互分開(kāi)的帶譜。操作步驟為:樣品的前處理→DNA的提取→PCR擴(kuò)增→瓊脂糖凝膠電泳→GC引物擴(kuò)增→DGGE凝膠電泳→條帶割膠→洗脫DNA→無(wú)GC引物擴(kuò)增→克隆載體→克隆子→質(zhì)粒提取→測(cè)序。

DGGE技術(shù)具有以下特點(diǎn)［6］:(1)分辨率高。能夠100%檢出只存在單個(gè)堿基差異的突變個(gè)體;(2)對(duì)樣品量要求小，1～5 ng的DNA或RNA上樣量即可達(dá)到清晰的電泳分離效果;(3)重復(fù)性好。電泳條件如溫度、時(shí)間等易于控制，可保證電泳的重現(xiàn)性和結(jié)果的重復(fù)性。局限性:(1)操作較為復(fù)雜;(2)實(shí)驗(yàn)成本較高;(3)需采用專業(yè)設(shè)備。

DGGE技術(shù)由于其快速準(zhǔn)確等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于環(huán)境、食品等領(lǐng)域中。國(guó)外將DGGE技術(shù)應(yīng)用于污水處理和生物反應(yīng)器中［7-8］，不僅能成功鑒定菌種，還可以反映整個(gè)微生物群落結(jié)構(gòu)。Santegoeds等結(jié)合微傳感器和PCR-DGGE技術(shù)監(jiān)測(cè)了生長(zhǎng)的細(xì)菌生物膜中群落的變化、硫酸還原菌的開(kāi)始、缺氧區(qū)的變化。DGGE結(jié)果顯示:伴隨著生物膜的生長(zhǎng)，觀察到的DGGE條帶數(shù)增多，表明細(xì)菌種類增多。國(guó)內(nèi)已經(jīng)將DGGE成功用于活性污泥處理系統(tǒng)、特種反應(yīng)器［9-10］、污水處理［11］和自然環(huán)境［12-13］下的微生物結(jié)構(gòu)中。DGGE技術(shù)應(yīng)用廣泛，不僅可以反映環(huán)境中微生物群落特征，更可以鑒定微生物種類，為微生物生長(zhǎng)環(huán)境特征提供參考。

DGGE技術(shù)應(yīng)用于發(fā)酵食品，如奶酪［14］、韓國(guó)泡菜［15］、葡萄酒［16］、普洱茶［17］，米醋等［18］，在鑒定微生物種類、表征群落特征等方面發(fā)揮作用。如:Cocolin等用PCR-DGGE技術(shù)監(jiān)控酵母菌群，并且在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的葡萄酒發(fā)酵中對(duì)這種方法進(jìn)行驗(yàn)證，可以檢測(cè)到103CFU/mL的量和 4種不同的酵母種類［19］。Randazzo等鑒定了奶酪生產(chǎn)中總的微生物菌群，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行DGGE擴(kuò)增片段的克隆和測(cè)序表明，在原料奶中嗜溫細(xì)菌在發(fā)酵過(guò)程中占優(yōu)勢(shì)地位［20］。

自2007年開(kāi)始，國(guó)內(nèi)一些學(xué)者將其用于白酒大曲、酒醅、窖泥的檢測(cè)中。近幾年，該技術(shù)開(kāi)始在白酒釀造微生物領(lǐng)域嶄露頭角。張文學(xué)［21］首先將該技術(shù)引入白酒研究中。應(yīng)用DGGE研究了瀘州老窖發(fā)酵過(guò)程中酒醅細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)變化規(guī)律。Lactobacillus acetotolerans在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中處于優(yōu)勢(shì)地位。真菌多樣性隨著發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)行而不斷降低。此后王海燕［22］等采用PCR-DGGE對(duì)比研究了江蘇地區(qū)濃香型和芝麻香型白酒窖池酒醅微生物群落差異。由于2種香型白酒前期生產(chǎn)工藝的差異，導(dǎo)致發(fā)酵起始和發(fā)酵中期的微生物群落結(jié)構(gòu)差異很大。張春暉等［23］報(bào)道了應(yīng)用PCR-DGGE分析高溫制曲中細(xì)菌群落變化的研究，發(fā)現(xiàn)在制曲前期優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群落變化較為突出，菌群結(jié)構(gòu)更新頻繁;高亦豹等采用PCRDGGE研究中國(guó)白酒大曲中微生物群落結(jié)構(gòu)。分別基于細(xì)菌的16S rRNA V3基因、酵母的26S rRNA D1基因和真菌的18S rRNA基因?qū)Υ笄械募?xì)菌、酵母和真菌的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，檢測(cè)到了傳統(tǒng)方法未能分離鑒定的Staphylococcus xylom和Klebsiella oxytoca［24］。

以上綜述了近幾年來(lái)國(guó)內(nèi)外釀酒科技工作者利用PCR-DGGE技術(shù)研究我國(guó)白酒釀造微生物的概況。從釀酒功能微生物的分離及分子鑒定到基于rRNA水平的群落結(jié)構(gòu)分析，對(duì)大曲微生物均有了新的認(rèn)識(shí)。在實(shí)驗(yàn)內(nèi)容設(shè)計(jì)方面，對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行總結(jié)后發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)研究針對(duì)細(xì)菌，缺乏對(duì)真菌微生物的研究;此外缺乏對(duì)研究對(duì)象動(dòng)態(tài)發(fā)酵過(guò)程的研究和認(rèn)識(shí)，而且大多研究集中對(duì)單一樣品的分析，缺少對(duì)中國(guó)白酒大曲、窖泥、酒醅的橫向?qū)Ρ确治?。從群落角度出發(fā)的研究，大多數(shù)集中在種群變化趨勢(shì)的研究上，缺乏對(duì)種群宏基因組信息的研究。在具體操作層面，酒醅和大曲宏基因組的獲取、PCR反應(yīng)的非特異性、引物的偏好性、分析結(jié)果的重現(xiàn)性、各種方法之間的差異性等方面依然存在不少問(wèn)題。

2 腸道細(xì)菌基因間重復(fù)序列擴(kuò)增技術(shù)(enterobacterial repetitive intergenic consensus，ERIC-PCR)

ERIC是指腸桿菌基因間重復(fù)序列，ERIC-PCR是在隨機(jī)引物PCR(RAPD)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的對(duì)細(xì)菌DNA進(jìn)行指紋圖譜分析的一種方法。根據(jù)ERIC的核心序列設(shè)計(jì)了一對(duì)反向引物(ERIC1:5'-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3'，ERIC2:5'-A AGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3')［25］，由于不同的細(xì)菌基因組上的ERIC重復(fù)序列的數(shù)目和分布不同，從而得到由一系列不同大小片段組成的 DNA指紋圖譜，ERIC-PCR技術(shù)被廣泛用于細(xì)菌分類和菌種鑒別上。操作步驟為:DNA提取→PCR擴(kuò)增→瓊脂糖凝膠電泳→克隆載體→克隆子→質(zhì)粒提取→測(cè)序。

該技術(shù)首先應(yīng)用于腸道細(xì)菌的鑒定，由于其穩(wěn)定性好、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，進(jìn)而被應(yīng)用于污泥微生物和發(fā)酵微生物的鑒定。廖永紅等人將米醋沉淀中枯草芽孢桿菌DNA提取及ERIC-PCR體系條件優(yōu)化中建立了一套用于分析米醋中菌種的體系，可快速鑒定枯草芽孢桿菌［26］。耿予歡等人利用ERIC-PCR手段研究腐乳發(fā)酵過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，反映發(fā)酵系統(tǒng)的運(yùn)行狀況［27］。根據(jù)各檢測(cè)時(shí)期指紋圖譜條帶的差異，結(jié)合對(duì)發(fā)酵過(guò)程中的重要理化指標(biāo)、風(fēng)味物質(zhì)等數(shù)據(jù)，進(jìn)一步探究微生物種群結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系。在混合體系的鑒定中，Gonzalez等采用ERICPCR技術(shù)對(duì)釀酒過(guò)程中醋酸菌種群的變化進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)酵菌數(shù)量的增加，醋酸菌也迅速增殖;而改變一些乙醇發(fā)酵的條件，醋酸菌的多樣性也大大減少。跟蹤并快速檢測(cè)出醋酸菌的菌種水平，為控制好酒的質(zhì)量提供了保障［28］。白酒釀造中的微生物群落具有同污泥和腸道菌群相似的特征，筆者認(rèn)為該技術(shù)可以應(yīng)用于白酒釀造微生物的檢測(cè)。

3 單鏈構(gòu)象多態(tài)性擴(kuò)增技術(shù)(single-strand conformation polymor-phism，SSCP)

SSCP技術(shù)是指相同長(zhǎng)度的不同堿基構(gòu)成的單鏈DNA點(diǎn)突變電泳技術(shù)。其原理是:相同長(zhǎng)度的單鏈DNA，其不同的堿基序列可形成不同的構(gòu)象，即單鏈構(gòu)象多態(tài)性。該單鏈DNA主要是由分子內(nèi)相互作用力來(lái)維持，當(dāng)有一個(gè)堿基發(fā)生改變時(shí)，會(huì)影響其空間構(gòu)象，使構(gòu)象發(fā)生改變，空間構(gòu)象有差異的單鏈DNA分子在聚丙烯酰胺凝膠中受排阻的大小也不同。因此，在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)中，不同的單鏈構(gòu)成的DNA片段可以在不同變性梯度的膠體中分離。操作步驟為:基因組DNA提取→采用通用引物PCR擴(kuò)增16S rDNA或18S rDNA特定區(qū)域→變性成單鏈DNA→制膠(聚丙烯酰胺凝膠)→電泳→回收DNA→測(cè)序。

該技術(shù)操作簡(jiǎn)便、快速、靈敏度較高、經(jīng)濟(jì)，是突變分析中最為常用的方法。此外利用該方法可以切膠純化直接測(cè)序，與GenBank的已知序列比較，得到特異的基因序列，從而達(dá)到分類的目的。

SSCP技術(shù)在根際微生物群落結(jié)構(gòu)分析、自然環(huán)境微生物多樣性調(diào)查等研究方面，都表現(xiàn)出較強(qiáng)的應(yīng)用潛力。Kornelia Smalla等采用 SSCP、DGGE、TRFLP不同方法對(duì)4種耕地土壤中的細(xì)菌多樣性進(jìn)行了比較分析，發(fā)現(xiàn)4種方法的測(cè)定結(jié)果一致［29］。因此，采用SSCP方法在微生物群落多樣性分析中的測(cè)定準(zhǔn)確性比較高。在白酒領(lǐng)域中，羅惠波等人在利用PCR-SSCP對(duì)瀘州老窖曲中真核微生物在發(fā)酵不同時(shí)期的豐度、優(yōu)勢(shì)度、多樣性及其相似性的研究中發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵過(guò)程中，菌群結(jié)構(gòu)相似，但其優(yōu)勢(shì)度和多樣性差異很大［30］。該結(jié)果表明，在不同發(fā)酵時(shí)期優(yōu)勢(shì)菌群變化顯著，這可能是由于溫濕度和環(huán)境的改變以及不同微生物菌群之間的相互制約作用，使得真核微生物在大曲的發(fā)酵過(guò)程中出現(xiàn)演替現(xiàn)象。

4 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性擴(kuò)增技術(shù)(restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)

PCR-RFLP又稱為 CAPs(cleaved amplification polymorphism sequence-tagged sites)技術(shù)。是指特異性PCR引物擴(kuò)增的特定位點(diǎn)的堿基突變、插入或缺失，以至多態(tài)性產(chǎn)生的技術(shù)。該技術(shù)是根據(jù)特定的限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)是否存在而確定的。限制性內(nèi)切酶能識(shí)別一段特異的雙鏈DNA短序列，識(shí)別長(zhǎng)度為4～6個(gè)堿基對(duì)，可在識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)或附近將DNA分子切開(kāi)，產(chǎn)生長(zhǎng)度不同的DNA分子片段，稱為限制性片段。某一內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)上堿基的替換、DNA片段上一個(gè)或多個(gè)堿基對(duì)的突變、缺失或插入以及重組等，均可致使限制性片段產(chǎn)生出多態(tài)性，使酶切片段的大小和數(shù)量產(chǎn)生變化，并在電泳中被辨別出來(lái)。一般的電泳分辨范圍在0.2～25 kb，因此在這個(gè)范圍呈現(xiàn)的RFLP均可被檢測(cè)［31］。操作步驟為:DNA提取→PCR擴(kuò)增→酶切→凝膠電泳→轉(zhuǎn)膜→Southern雜交→分析數(shù)據(jù)。

RFLP分析雖然有準(zhǔn)確的特點(diǎn)，但對(duì)樣品純度要求較高，樣品用量大，且RFLP多態(tài)信息含量低，多態(tài)性水平過(guò)分依賴于限制性內(nèi)切酶的種類和數(shù)量，加之RFLP分析技術(shù)步驟繁瑣、工作量大、成本較高，應(yīng)用受到了限制。

PCR-RFLP技術(shù)通過(guò)分離提取自然環(huán)境中殘留的DNA，選定合適的RFLP片段，經(jīng)過(guò)PCR的擴(kuò)增，結(jié)合其他研究手段，可以鑒定出核酸的生物來(lái)源和生物種類以及與環(huán)境的關(guān)系。海洋和湖泊沉積物中的硫酸鹽還原反應(yīng)是在硫酸鹽還原菌的作用下進(jìn)行的，而該菌種類多，用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法，難度大而且不能獲得所有種類的純培養(yǎng)菌株，研究硫酸鹽還原菌在沉積物中不同深度的空間分布和種類的鑒定是關(guān)鍵，因此合成硫酸鹽還原菌的特征性引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增沉積物中殘存的DNA的限制性片段，經(jīng)過(guò)RFLP的鑒定，就可輕易了解硫酸鹽還原菌的狀況。在這方面的研究中硫酸鹽還原菌的SBR385基因片段是可選用的片段之一。因此，運(yùn)用PCR-RFLP技術(shù)可以不通過(guò)培養(yǎng)硫酸鹽還原菌而直接用沉積物中殘存的DNA研究硫酸鹽還原的生物作用過(guò)程［32］。Scala［33］等人運(yùn)用PCR技術(shù)對(duì)海洋沉積物中一氧化二氮還原酶的基因進(jìn)行了擴(kuò)增研究，用 CAMPNos661F和CAMP-Nos1773R為引物，擴(kuò)增1 000 bp的一氧化二氮還原酶基因，研究結(jié)果顯示，脫氮微生物群落受地理分布的限制。此外，該技術(shù)已在釀酒微生物中成功應(yīng)用，包括在對(duì)葡萄酒不同釀酒葡萄品種相關(guān)酵母菌的分離、分類鑒定以及在白酒小曲細(xì)菌多樣性研究中都已經(jīng)成功應(yīng)用［34-35］，在白酒中得到小曲主要細(xì)菌種類為黃單胞菌屬、沙雷氏菌屬、木崎氏菌屬和片球菌屬等，其中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌是以戊糖片球菌為主的乳酸菌［36］。

5 實(shí)時(shí)熒光定量擴(kuò)增技術(shù)(real-time quantitative PCR，Real-time PCR)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，連續(xù)地分析整個(gè)PCR進(jìn)程中擴(kuò)增相關(guān)的熒光信號(hào)，能對(duì)每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法［37］。該方法特異性更強(qiáng)，能夠有效解決PCR污染問(wèn)題，而且自動(dòng)化程度高。操作步驟為:RNA的提取→RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA→定量PCR檢測(cè)→獲得曲線;或:DNA的提取→定量PCR檢測(cè)→獲得曲線。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR具有定量準(zhǔn)確、定量范圍寬、樣品無(wú)需做梯度稀釋、特異性強(qiáng)、克服了假陽(yáng)性問(wèn)題、操作快速、免去PCR后處理;Taq酶具有天然的5'→3'核酸外切酶活性，技術(shù)簡(jiǎn)單、易于學(xué)習(xí)和掌握安全，對(duì)操作員和環(huán)境都無(wú)危害;自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)。但還存在著如成本高、只能檢測(cè)單一樣本等缺點(diǎn)。

由于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)可以對(duì)微生物的含量進(jìn)行準(zhǔn)確定量，因此該技術(shù)可應(yīng)用于環(huán)境和食品中致病菌的研究。Daum等［38］建立利用熒光定量PCR法從引起沙門(mén)氏菌性食物中毒剩菜及病人糞便中檢測(cè)沙門(mén)氏菌方法，且利用熒光TaqMan PCR法在3 h內(nèi)即可從雞肉中檢測(cè)出沙門(mén)氏菌，更證明熒光定量檢測(cè)時(shí)效性。此外，焦紅等［39］建立了用熒光定量PCR檢測(cè)食品中副溶血弧菌方法，具有良好特異性和靈敏度，大大提高檢測(cè)效率;且操作簡(jiǎn)便快速、檢驗(yàn)周期短，在食品病原菌檢測(cè)中將有廣闊應(yīng)用前景。實(shí)時(shí)熒光定量PCR還成功應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的領(lǐng)域，Hagen等［40-42］研究表明，熒光定量PCR法可檢測(cè)出包括豆腐等在內(nèi)豆制品中轉(zhuǎn)基因成份含量。此外，該技術(shù)可作為微生物生理代謝、菌群分布的研究工具，雖然該技術(shù)在白酒研究中并未報(bào)道，但可望應(yīng)用于對(duì)白酒功能菌的定量研究，其前景十分廣闊。

上述5種分子生態(tài)學(xué)檢測(cè)手段在微生物檢測(cè)、混合體系的鑒定中已廣泛應(yīng)用。筆者將上述幾種分子生態(tài)學(xué)技術(shù)特征總結(jié)歸類(表1)?？紤]準(zhǔn)確性、使用的廣泛性因素，目前PCR-DGGE技術(shù)已經(jīng)相比其他4種技術(shù)應(yīng)用更加廣泛，但其本身還存在著不能絕對(duì)定量等問(wèn)題;將該技術(shù)同real-time PCR技術(shù)相結(jié)合，可以對(duì)白酒發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)微生物進(jìn)行定量。SSCP技術(shù)應(yīng)用于白酒中尚不廣泛，但可以對(duì)條件進(jìn)行優(yōu)化后對(duì)白酒微生物進(jìn)行分析。ERIC-PCR和RFLP技術(shù)雖在白酒的研究中未進(jìn)行報(bào)道，但這些技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域與白酒發(fā)酵環(huán)境相似，可通過(guò)方法的建立和條件的優(yōu)化應(yīng)用于白酒當(dāng)中。相信未來(lái)這些技術(shù)可以廣泛應(yīng)用于白酒中，為揭示白酒微生物提供廣泛的平臺(tái)。

表1 幾種常規(guī)分子技術(shù)的比較Table 1 The comparation of several molecular techniques

6 總結(jié)與討論

基于PCR技術(shù)研究白酒微生物是近年來(lái)的一個(gè)研究熱點(diǎn)，基于PCR衍生出的分子生物學(xué)技術(shù)有望成為研究白酒釀酒微生物的重要手段，在研究釀酒微生物中發(fā)揮重要作用。相信隨著研究的深入，分子生態(tài)學(xué)技術(shù)在白酒行業(yè)中的應(yīng)用將會(huì)更加廣泛，會(huì)在白酒風(fēng)格特征分析、特色鑒別、質(zhì)量控制及產(chǎn)品開(kāi)發(fā)等方面發(fā)揮巨大的作用，為我國(guó)傳統(tǒng)白酒的快速發(fā)展提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持。

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