穩(wěn)定同位素iTRAQ標(biāo)記/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定3種紅菇中游離氨基酸*

施文祥，陳新華

(桂林醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，廣西桂林，541004)

紅菇屬(Russula Pers.)(1796)是一類大型傘菌，隸屬于擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、傘菌綱(Agaricomycetes)、紅菇目(Russulales)、紅菇科(Russulaceae)，是真菌系統(tǒng)學(xué)中具有相當(dāng)重要意義、系統(tǒng)發(fā)育位置頗為重要的類群。該屬主要形態(tài)特征為:子實(shí)體肉質(zhì)而較脆，菌蓋顏色鮮艷而多樣，有菌絲和其纏繞的球狀細(xì)胞組成，無鎖狀聯(lián)合，菌柄粗短，孢子具淀粉質(zhì)紋飾，子實(shí)層常具囊狀體。紅菇屬的種類廣泛分布于世界，通常與松屬、落葉松屬、冷杉屬、鐵杉屬、云杉屬等裸子植物，以及殼斗目、楊柳目、豆科、蓼科等種子植物形成外生菌根，它們中的一些種類是美味的食用菌，可供食用，如變綠紅菇Russula virescens(Schaeff)Fr，灰肉紅菇Russula griseocarnosa sp.nov.，也有一些種類具有毒素，誤食它們能引起胃腸炎型中毒甚至死亡，如亞稀褶紅菇Russula subnigricans Hongo。目前關(guān)于紅菇屬的研究主要集中在種質(zhì)資源鑒定、化學(xué)成分和抗氧化等方面［1-4］，而缺乏對(duì)紅菇屬種類中的游離氨基酸(包括非蛋白質(zhì)氨基酸)組成的系統(tǒng)研究。游離氨基酸是食品中可以被人體直接吸收的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)又是食品中主要的風(fēng)味物質(zhì)，因此，測(cè)定紅菇中各種游離氨基酸的含量，將可作為評(píng)價(jià)該類真菌的食用和保健價(jià)值的重要指標(biāo)。

由于多數(shù)氨基酸不具有紫外吸收和熒光檢測(cè)的發(fā)色基團(tuán)，1958年Moore等首先提出了用陽離子交換色譜與柱后茚三酮衍生結(jié)合的方法分析蛋白質(zhì)中的氨基酸，實(shí)現(xiàn)了氨基酸分析的自動(dòng)化［5］。此后，不斷出現(xiàn)新的氨基酸檢測(cè)方法，如柱前衍生反相高效液相色譜法、高效陰離子交換色譜-積分脈沖安培檢測(cè)法、毛細(xì)管電泳法、質(zhì)譜法等相繼應(yīng)用于氨基酸分析［6-8］。采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)測(cè)定體內(nèi)化合物，具有選擇性好、靈敏度高、分析時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，己普遍應(yīng)用于生物體內(nèi)研究［9-11］。穩(wěn)定同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(iTRAQ)技術(shù)是近年來最新開發(fā)的一種新的蛋白質(zhì)組學(xué)定量研究技術(shù)，具有較好的定量效果、較高的重復(fù)性，并可對(duì)多達(dá)4種不同樣本同時(shí)進(jìn)行定量分析，iTRAQ己成功應(yīng)用于小分子氨基酸LC-MS/MS和GC/MS的定量檢測(cè)［12-14］。本文采用高效液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS/MS)同位素內(nèi)標(biāo)法，較全面地比較廣西藤縣紅菇、廣西容縣紅菇和變綠紅菇中游離氨基酸組成及含量。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

3200QTRAP型液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)Applied Biosystem公司)，配有電噴霧離子化源(ESI)以及Analyst 1.4.2數(shù)據(jù)處理軟件;U1tiMate3000標(biāo)準(zhǔn)型液相色譜儀(美國(guó)戴安公司)，包括雙三元梯度泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱，切換閥;氮吹濃縮儀(日本東京理化器械株式會(huì)社)。

LTRAQTM試劑盒，批號(hào):0709002(美國(guó) Applied Biosystem公司)，包括:400 μmol/L正異亮氨酸的1000磺基水楊酸溶液、標(biāo)記緩沖液(0.45 mol/L硼酸鹽緩沖液，pH 8.5，含有 20 μmol/L 正纈氨酸)，115-iTRAQ衍生化試劑，1.2%羥胺水溶液、iTRAQ-114同位素標(biāo)記的44種氨基酸內(nèi)標(biāo)(用0.5%甲酸標(biāo)準(zhǔn)稀釋液溶解后使用)。

1.2 紅菇來源

變綠紅菇樣品采自云南，另外2種紅菇屬樣品分別采自廣西藤縣和廣西容縣。作者對(duì)廣西藤縣和廣西容縣2種紅菇子實(shí)體的rDNA ITS進(jìn)行克隆測(cè)序和序列特征比較分析，與形態(tài)極其相似的灰肉紅菇(Russula griseocarnosa)的相似率低于90%，初步鑒定為2個(gè)新類群。將采集的3種紅菇成熟子實(shí)體小心清除上面的泥土和雜物，經(jīng)50℃烘干至恒重后，用植物粉碎機(jī)粉碎，過40目篩，用于游離氨基酸分析。

1.3 樣品處理

樣本預(yù)處理:取適量樣本粉末加入甲醇水溶液［V(甲醇)∶V(水)=1∶1］充分提取，濃度為 50 mg/mL，提取液過0.45 μm油系濾膜，濾液進(jìn)行45AA前處理。

衍生化處理:移取40 μL樣本置于一試管內(nèi)，加入10 μL磺基水楊酸，漩渦混勻30秒，10 000倍重力加速度離心2 min沉淀蛋白;移取10 μL上層液體置于另一試管。加入40 μL標(biāo)記緩沖液，漩渦混勻，旋轉(zhuǎn)離心;移取10 μL上層液體置于另一試管。每個(gè)樣品管中加入5 μL稀釋的iTRAQ試劑，漩渦混勻，旋轉(zhuǎn)離心;于室溫下孵化至少30 min。管中加入5 μL羥胺，漩渦混勻，旋轉(zhuǎn)離心;每支管中加入32 μL內(nèi)標(biāo)，漩渦混勻，旋轉(zhuǎn)離心。使用液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀檢測(cè)樣本。

1.4 LC-MS/MS參數(shù)

1.4.1 色譜條件

色譜柱:AAA-C18(150 mm × 4.6 mm，5 μm，AB SCIEX公司);流動(dòng)相:水(含有0.01%七氟丁酸、0.1%甲酸)-乙睛(含有0.01%七氟丁酸、0.1%甲酸)，梯度洗脫條件見表1;柱溫:50℃;進(jìn)樣量:3 μL。

表1 流動(dòng)相梯度表Table 1 HPLC mobile phase gradient

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源:離子噴霧離子化源正離子化模式;離子噴射電壓:3 000 V;離子源溫度:580℃;源內(nèi)氣體1(GS1，N2)壓力:345 kPa;氣體 2(GS2，N2)壓力:414 kPa;氣簾氣體(N2)壓力:138 kPa;掃描方式為多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);碰撞氣(N2)壓力:Medium;解簇電壓(DP)為:35 V;碰撞能量(CE)為:30 eV。

1.5 氨基酸定性和定量方法

采用電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行定性和定量檢測(cè)，根據(jù)同位素內(nèi)標(biāo)物的出峰時(shí)間和峰面積，對(duì)待測(cè)樣品中氨基酸進(jìn)行定性和定量的檢測(cè)。圖1是γ-氨基丁酸的原始譜圖，同位素內(nèi)標(biāo)物γ-氨基丁酸的出峰時(shí)間為7.39 min，樣品譜峰出峰時(shí)間7.39 min，根據(jù)同位素內(nèi)標(biāo)物的出峰時(shí)間判定該峰是γ-氨基丁酸;對(duì)樣品峰面積積分與同位素內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值乘以反應(yīng)系數(shù)，用全譜氨基酸軟件計(jì)算γ-氨基丁酸的含量。

圖1 γ-氨基丁酸原始譜圖Fig.1 Original spectrum of GABA

2 結(jié)果與分析

2.1 三種紅菇的游離蛋白質(zhì)氨基酸種類與含量

食用菌味道尤為鮮美，主要是因?yàn)楹泻芏圊r甜味活性成分，其氨基酸中有25% ～35%處于游離狀態(tài)［15］，稱之為游離氨基酸，游離氨基酸就是一類重要的味覺活性物質(zhì)。采用高效液相色譜-質(zhì)譜儀經(jīng)同位素內(nèi)標(biāo)物定性和定量、全譜氨基酸軟件計(jì)算出3種紅菇中游離氨基酸含量，結(jié)果見表2和表3。從組成蛋白質(zhì)的氨基酸種類來看，廣西藤縣紅菇和廣西容縣紅菇所含的氨基酸是一致的，缺少半胱氨酸和甲硫氨酸，其他18種基本氨基酸檢出。變綠紅菇缺少半胱氨酸和酪氨酸，其他18種基本氨基酸檢出。蛋白質(zhì)氨基酸總量以廣西容縣紅菇最高，達(dá)24.25 mg/g，其次是變綠紅菇(20.86 mg/g)，最低是廣西藤縣紅菇(14.36 mg/g)。其中，人體必需8種氨基酸含量最高的是變綠紅菇(4.33 mg/g)，其次是廣西容縣紅菇(4.03 mg/g)，最低是廣西藤縣紅菇(2.39 mg/g)。精氨酸和組氨酸是嬰幼兒必需氨基酸，兩者含量為0.58 mg/g(廣西藤縣紅菇)、1.44 mg/g(廣西容縣紅菇)和2.92 mg/g(變綠紅菇)。在游離蛋白質(zhì)氨基酸中，3種紅菇樣品均以谷氨酰胺含量最高，占氨基酸總量的43.59%(廣西藤縣紅菇)、46.31%(廣西容縣紅菇)和15.63%(變綠紅菇);其次是谷氨酸，占氨基酸總量的13.51%(廣西藤縣紅菇)、10.47%(廣西容縣紅菇)和11.98%(變綠紅菇)。

表2 三種紅菇游離蛋白質(zhì)氨基酸組成及含量mg/gTable 2 Content of free protein amino acids in three edible Russula fungi mg/g

在20種蛋白質(zhì)氨基酸中，食用菌通常含有16～18種氨基酸，本實(shí)驗(yàn)所檢測(cè)結(jié)果與之相符。谷氨酰胺在3種紅菇中含量均為最高，以往許多報(bào)道蘑菇中谷氨酰胺含量很低或者檢測(cè)不出來［16-17］，是因?yàn)闃悠酚盟徇M(jìn)行前處理水解過程中，谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為谷氨酸。谷氨酸在3種紅菇中含量也較高。谷氨酸、天冬氨酸是鮮味氨基酸中的特征性氨基酸，谷氨酸的鮮味最強(qiáng)，鮮味氨基酸的組成和含量決定了蘑菇的鮮美可口程度［18］。食用菌含有的氨基酸不足之處，就是含硫的氨基酸的含量太低，與我們目前的研究報(bào)道相一致。

2.2 三種紅菇的游離非蛋白氨基酸種類及含量

除了檢測(cè)到18種游離蛋白質(zhì)氨基酸外，從3種紅菇中還檢測(cè)出 β-丙氨酸、γ-氨基丁酸(GABA)、鳥氨酸等一些游離非蛋白質(zhì)氨基酸(表3)。由表3可以看出，GABA含量在3種紅菇中均高，其次是β-丙氨酸(變綠紅菇除外)，其他如鳥氨酸、乙醇胺、α-氨基正丁酸和α-氨基已二酸等非蛋白質(zhì)氨基酸含量較少。GABA在其它蘑菇中也報(bào)道過［19-20］。其他幾種檢測(cè)到的非蛋白質(zhì)氨基酸多是代謝中的前體物質(zhì)或中間產(chǎn)物，例如β-丙氨酸是維生素泛酸的前體，瓜氨酸和鳥氨酸是合成精氨酸的前體。通過高絲氨酸可以合成蘇氨酸和蛋氨酸。

表3 三種紅菇游離非蛋白質(zhì)氨基酸組成及含量mg/gTable 3 Content of free non-protein amino acids in three edible Russula fungi mg/g

非蛋白質(zhì)氨基酸是相對(duì)于組成蛋白質(zhì)的20種常見氨基酸而言，指除組成蛋白質(zhì)的20種常見氨基酸以外的含有氨基和羧基的化合物。非蛋白質(zhì)氨基酸可以說是對(duì)天然氨基酸的有益補(bǔ)充，與蛋白氨基酸相比，它們對(duì)生命機(jī)體的生存和發(fā)育，自身代謝與結(jié)構(gòu)功能方面有著蛋白氨基酸所不能起到的作用。如GABA是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛分布的最重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，約50%的中樞突觸部位以GABA為遞質(zhì)［21］。GABA具有降低血壓，促進(jìn)睡眠增強(qiáng)記憶力，抗焦慮，對(duì)癲癇有預(yù)防和治療作用，有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用能影響腦衰老，解毒作用，能調(diào)節(jié)激素分泌及生殖生理作用［22-23］。另外，非蛋白質(zhì)氨基酸在食品工業(yè)上也得到應(yīng)用，例如L-a-天冬氨酞苯丙氨酸甲酯其甜味為蔗糖的150倍，易吸收，口味正，已風(fēng)靡飲料市場(chǎng)等食品工業(yè)。DL-丙氨酸可用于制造清涼飲料。因此，非蛋白質(zhì)氨基酸生物合成及生物學(xué)作用的研究，近年來已廣泛地引起人們的重視。

3 結(jié)論

本文采用高效液相色譜-質(zhì)譜儀同位素內(nèi)標(biāo)法技術(shù)，可快速地對(duì)3種紅菇樣品進(jìn)行42種氨基酸定性和定量測(cè)定。試驗(yàn)結(jié)果表明，3種紅菇均含有7種人體必需氨基酸和11種非必需氨基酸。蛋白質(zhì)氨基酸總量以廣西容縣紅菇最高，其次是變綠紅菇，最低是廣西藤縣紅菇。在游離蛋白質(zhì)氨基酸中，3種紅菇樣品均以谷氨酰胺含量最高，其次是谷氨酸。另外從3種紅菇中還檢測(cè)出β-丙氨酸、GABA、鳥氨酸等一些游離非蛋白質(zhì)氨基酸，其中以GABA含量較高。因此，可見，3種紅菇中含有常見的游離蛋白質(zhì)氨基酸以及其他食品所少見的非蛋白質(zhì)氨基酸使它們具有一定的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功能。

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