傳統(tǒng)自然發(fā)酵四川香腸加工貯藏過程中生物胺含量變化*

孫霞，鞏洋，楊勇，曾建華，方秋艷，萬(wàn)重，楊敏，卿丹丹，李躍文

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安，625014)

生物胺(Biogenic amines，BA)是由氨基酸脫羧或醛和酮氨基化形成的具有生物活性的小分子量含氮有機(jī)化合物［1］。按組成成分的不同，可將生物胺分為單胺(組胺、酪胺、色胺、苯乙胺等)、二胺(尸胺、腐胺等)和多胺(精胺和亞精胺等)這三類［2］。適量的生物胺可以增強(qiáng)代謝活力、促進(jìn)生長(zhǎng)、增強(qiáng)腸道系統(tǒng)免疫活性、消除自由基和控制血壓等，并在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮活性作用［3］。過量的生物胺不僅會(huì)影響產(chǎn)品的風(fēng)味，而且會(huì)對(duì)人體健康造成危害，導(dǎo)致高血壓、腹部痙攣和腹瀉等，引起人體心臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等器官的損害［4-5］。富含蛋白質(zhì)的發(fā)酵肉制品、魚類和發(fā)酵豆制品由于易被微生物侵染而可能具有高濃度的生物胺［6-8］。目前應(yīng)用于生物胺的檢測(cè)方法較多，主要包括高效液相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用、薄層色譜法、毛細(xì)管電泳和生物傳感器法［9-11］。

傳統(tǒng)四川香腸主要利用自然發(fā)酵，發(fā)酵微生物來源于環(huán)境中混入的雜菌和肉中有益菌與雜菌競(jìng)爭(zhēng)形成的優(yōu)勢(shì)菌群［12］，這些微生物可能具有氨基酸脫羧酶活性，導(dǎo)致四川香腸中的氨基酸脫羧形成生物胺。De Mey等［13］研究發(fā)現(xiàn)，干發(fā)酵香腸中腐胺、尸胺和組胺的含量在保質(zhì)期的時(shí)間內(nèi)未超過FDA的標(biāo)準(zhǔn)。Gardini等［14］研究發(fā)現(xiàn)成熟120天的發(fā)酵香腸中酪胺、腐胺和尸胺的含量分別為165.55、22.87和52.90 mg/kg。目前對(duì)傳統(tǒng)自然發(fā)酵的四川香腸中生物胺的種類和含量的研究均較少。因此，測(cè)定傳統(tǒng)自然發(fā)酵的四川香腸加工過程中生物胺的含量具有十分重要的意義，本文以高效液相色譜法對(duì)其進(jìn)行測(cè)定，期望為傳統(tǒng)自然發(fā)酵的四川香腸中生物胺的安全評(píng)估提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺的標(biāo)準(zhǔn)品以及衍生劑丹磺酰氯均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司;乙腈和丙酮為色譜純;高氯酸、氨水、NaOH、Na2CO3等均為分析純，購(gòu)于成都化工試劑有限公司;超純水為實(shí)驗(yàn)室自制。

ST16R高速冷凍離心機(jī)，北京博儀恒業(yè)科技發(fā)展有限公司;HWS24電熱恒溫水浴鍋，上海一恒公司;BMS602型均質(zhì)機(jī)，德國(guó)BRT公司;微型漩渦混合儀上海滬西分析儀器廠;海爾冰箱;電子天平;高效液相色譜儀(島津 LC-2010CHT);超聲波清洗器(KH5200B型);超純水儀(Milli-Q，Millipore)。

1.2 傳統(tǒng)自然發(fā)酵四川香腸的制作

工藝配方:豬肉100 kg(皮下脂肪20 kg，瘦肉80 kg)，食鹽 2.5 kg，辣椒粉1.0 kg，花椒粉 0.4 kg，白砂糖1.0 kg，味精 0.15 kg，白酒 1.0 kg，十三香 0.05 kg，NaNO30.025 kg，NaNO20.007 5 kg。

工藝流程:原料肉→預(yù)處理→絞碎→添加配料→攪拌→腌制(4℃，4 h)→灌腸→自然晾掛(溫度為8～15℃，相對(duì)濕度為75% ～90%)→成品

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺和亞精胺各50 mg，用0.4 mol/L HClO4定容到50 mL，在4℃冰箱避光保存。分別吸取各生物胺單組分標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，置于10 mL容量瓶中，用0.4 mol/L HClO4分別稀釋制成濃度分別為:0.5、1.0、2.5、5.0、10、20 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在4℃冰箱避光保存。

1.3.2 生物胺標(biāo)準(zhǔn)品的衍生

參照胡鵬等［8］的方法，略作修改。取1 mL的標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液，加入200 μL 2 mol/L NaOH使之呈堿性，再加入300 μL飽和NaHCO3溶液進(jìn)行緩沖，加入2 mL 10 mg/mL丹磺酰氯丙酮溶液，在40℃下處于黑暗中反應(yīng)45 min后加入100 μL的NH4OH終止反應(yīng)，在室溫下暗反應(yīng)30 min，去除殘留的丹磺酰氯溶液，加入乙腈使終體積為5mL。衍生處理后0.22 μm濾膜過濾，用于分析檢測(cè)。

1.3.3 樣品處理

取5 g香腸加入20 mL 0.4 mol/L HClO4，勻漿機(jī)上徹底勻漿，冷凍離心機(jī)(4℃，4 000 r/min)離心10 min，沉淀部分如前的方法再重新提取1次。取2次的上清液用0.4 mol/L HClO4定容到50 mL，取1 mL的樣液如標(biāo)準(zhǔn)溶液一樣進(jìn)行柱前衍生。

1.3.4 色譜條件

色譜柱為 C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，流速 1 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng) 254 nm，進(jìn)樣量 10 μL，柱溫30℃，流動(dòng)相A為水，流動(dòng)相B為乙腈，采用梯度洗脫程序，洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.3.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

所有測(cè)定結(jié)果均為3次以上重復(fù)測(cè)定的平均值，使用Excel 2007和SPSS17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物胺標(biāo)品圖譜及標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1是生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)樣品的色譜圖。由圖1可知，本實(shí)驗(yàn)所采用的HPLC方法可將溶劑峰及雜質(zhì)峰在前5 min內(nèi)全部洗脫出。而7種生物胺:色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺及亞精胺能在20 min內(nèi)有效分離，采用該方法來分離生物胺具有較好的分離效果。從表2可以看出，7種生物胺的峰面積與其相應(yīng)的濃度分別呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，通過該方法可準(zhǔn)確測(cè)定出生物胺的含量。

圖1 生物胺混合標(biāo)品HPLC色譜圖Fig.1 The HPLC chromatogram for a standard mixture of biogenic amines

表2 七種生物胺回歸方程及相關(guān)系數(shù)Table 2 Regression equations and correlation coefficients of seven biogenic amines

2.2 傳統(tǒng)自然發(fā)酵四川香腸中生物胺含量

傳統(tǒng)自然發(fā)酵四川香腸加工貯藏過程中生物胺含量變化見表3。原料肉中只檢測(cè)出了色胺、苯乙胺和亞精胺，這可能是由于原料肉中缺少了能夠產(chǎn)生氨基酸脫羧酶的微生物，導(dǎo)致生物胺的含量較少。有研究表明原料肉會(huì)影響生物胺的形成，Bover-Cid等［15］研究發(fā)現(xiàn)用經(jīng)4℃、5天處理的原料肉做的發(fā)酵香腸中的生物胺比經(jīng)-20℃、5天處理的原料肉形成更早且含量更高。亞精胺被認(rèn)為是原料肉中常見的生物胺，Komprda等［16］發(fā)現(xiàn)亞精胺的含量不會(huì)受到發(fā)酵劑菌種和發(fā)酵時(shí)間以及發(fā)酵溫度的影響。

傳統(tǒng)自然發(fā)酵四川香腸加工貯藏過程中檢測(cè)出的單胺有色胺、苯乙胺、組胺和酪胺，色胺是由色氨酸經(jīng)過氨基酸脫羧作用形成的，其含量由原料肉的5.12 mg/kg增加到33.16 mg/kg，這與 Komprda等［17］研究發(fā)酵劑、貯藏時(shí)間和溫度對(duì)干發(fā)酵香腸中生物胺的含量影響的結(jié)果不一致，這可能是由于其在發(fā)酵前期較高的溫度導(dǎo)致蛋白質(zhì)的降解，增加了色胺的積累。Suzzi［18］等發(fā)現(xiàn)發(fā)酵香腸中色胺含量低于30 mg/kg，傳統(tǒng)自然發(fā)酵四川香腸在加工貯藏前期也一直低于這個(gè)含量，但貯藏90 d后色胺超過30 mg/kg。苯乙胺由原料肉的1.77 mg/kg增加到22.12 mg/kg。有研究表明，發(fā)酵食品中苯乙胺含量在30 mg/kg以上就可對(duì)人體構(gòu)成潛在的危險(xiǎn)，傳統(tǒng)自然發(fā)酵四川香腸在加工貯藏過程中一直低于30 mg/kg，說明苯乙胺含量在安全范圍之內(nèi)。組胺由未檢出增加到127.90 mg/kg，組胺是生物胺中毒性最大的生物胺，美國(guó)食品藥品監(jiān)督局規(guī)定了水產(chǎn)品中組胺含量不得超過50 mg/kg，上海市食品藥品監(jiān)督管理局于2011年發(fā)布上海市地方標(biāo)準(zhǔn)《食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵發(fā)酵肉制品(征求意見稿)》，對(duì)比國(guó)內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，暫定發(fā)酵肉制品中組胺限量為低于200 mg/kg［19］，傳統(tǒng)自然發(fā)酵四川香腸在成熟前期(0～20 d)未超過50 mg/kg，在加工貯藏過程中未超過200 mg/kg。酪胺由未檢出增加到153.06 mg/kg，酪胺是毒性僅次于組胺，Latorre-Moratalla等［20］發(fā)現(xiàn)酪胺是歐洲傳統(tǒng)發(fā)酵香腸中含量最多的生物胺，酪胺含量最高達(dá)到773.43 mg/kg，有學(xué)者指出酪胺含量超過100 mg/kg會(huì)對(duì)人體健康造成不良影響［21］，傳統(tǒng)自然發(fā)酵四川香腸加工貯藏前期(0～70 d)未超過100 mg/kg。

腐胺和尸胺是傳統(tǒng)自然發(fā)酵四川香腸加工貯藏過程中檢測(cè)出的二胺，腐胺由未檢出增加到92.83 mg/kg，尸胺由未檢出增加到132.46 mg/kg，腐胺和尸胺等二胺與其他胺(色胺、苯乙胺、組胺和酪胺)不同，它們本身的毒性較小，但是它們能抑制組胺、酪胺代謝酶和羥甲基轉(zhuǎn)換酶的活性，從而增加組胺和酪胺的毒性;此外還可以與食物中的亞硝酸鹽反應(yīng)產(chǎn)生致癌物質(zhì)亞硝胺。腐胺在傳統(tǒng)自然發(fā)酵四川香腸加工貯藏過程中未超過100 mg/kg，而尸胺在加工貯藏前期(0～70 d)未超過100 mg/kg。

亞精胺是傳統(tǒng)自然發(fā)酵四川香腸加工貯藏過程中檢測(cè)出的多胺，且亞精胺的含量范圍在1.24～3.12 mg/kg，在整個(gè)加工貯藏過程中亞精胺的含量變化不顯著，這與Komprda等［17］的研究結(jié)果相似，即亞精胺的含量在加工貯藏過程中通常保持相對(duì)恒定，而與王桂瑛等［22］對(duì)火腿加工過程中生物胺的變化的研究結(jié)果不一致，這可能是由于香腸的加工工藝與火腿間存在差異。

在傳統(tǒng)自然發(fā)酵四川香腸貯藏120 d時(shí)，色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺和亞精胺以及生物胺總量分別為:33.16、22.12、92.83、132.46、127.90、153.06、3.12 和 564.64 mg/kg。Eerola 等［23］認(rèn)為，血管活性生物胺(色胺、苯乙胺、組胺和酪胺)的總量低于20 mg/100 g是發(fā)酵肉制品具有較高品質(zhì)的指標(biāo)之一，傳統(tǒng)自然發(fā)酵四川香腸中血管活性生物胺含量均低于20 mg/100 g。在傳統(tǒng)自然發(fā)酵四川香腸整個(gè)加工貯藏過程中生物胺總量呈明顯增加的趨勢(shì)(P＜0.01)，Santos［24］認(rèn)為生物胺總量超過1 000 mg/kg 會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生極大威脅，傳統(tǒng)自然發(fā)酵四川香腸中生物胺總量遠(yuǎn)低于1 000 mg/kg。

表3 傳統(tǒng)自然發(fā)酵四川香腸加工貯藏過程中生物胺含量 單位:mg/kgTable 3 Content of biogenic amines in traditional natural fermentation Sichuan-style sausage during processing and storage

3 結(jié)論

在傳統(tǒng)自然發(fā)酵四川香腸加工貯藏過程中，原料肉中只檢測(cè)出了色胺、苯乙胺和亞精胺，貯藏120 d檢測(cè)出了7種生物胺，除亞精胺外，6種生物胺(色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺和酪胺)的含量在加工貯藏過程中均顯著增加(P＜0.01)。傳統(tǒng)自然發(fā)酵四川香腸中主要以酪胺、組胺、尸胺和腐胺為主，含量分別達(dá)到 153.06、127.90、132.46 和 92.83 mg/kg，4種生物胺占生物胺總量的89.66%。傳統(tǒng)自然發(fā)酵四川香腸中血管活性生物胺(色胺、苯乙胺、組胺和酪胺)含量均低于20 mg/100 g。生物胺總量在加工貯藏過程中變化顯著(P＜0.01)，總量低于1 000 mg/kg。有學(xué)者建議發(fā)酵香腸中各種生物胺含量應(yīng)低于100 mg/kg，傳統(tǒng)自然發(fā)酵四川香腸在加工貯藏前期(0～70 d)各種生物胺含量均低于100 mg/kg，在貯藏后期(70～120 d)尸胺、組胺和酪胺的含量超過100 mg/kg，因此為保障傳統(tǒng)自然發(fā)酵四川香腸的安全，需對(duì)其貯藏后期生物胺的控制進(jìn)行進(jìn)一步研究。

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