白鰱中鹽溶蛋白提取工藝優(yōu)化及其加工特性研究*

雷頌，竇建洲，梅志方，楊品紅，王伯華

(湖南文理學院生命科學學院，水產高效健康生產湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心，環(huán)洞庭湖水產健康養(yǎng)殖及加工湖南省重點實驗室，湖南常德，415000)

我國淡水魚產量穩(wěn)居世界高位，并保持每年5%的增長勢頭。但目前我國淡水魚資源浪費嚴重，產品開發(fā)利用與加工水平不高，淡水魚的加工利用只占到總魚量5%左右，而且其中絕大多數(shù)為冷凍冷藏及冰鮮品，深加工產品僅占很小的一部分［1］。鰱魚，四大家魚之一，又名白鰱，屬于鯉形目，鯉科。白鰱新鮮食用因其具有土腥味、骨刺多，銷路受到局限，經(jīng)濟效益低其附加值還沒有真正完全發(fā)掘出來。

鹽溶蛋白(salt soluble proteins，SSP)又稱肌原纖維蛋白［2］，是肌肉中最重要的蛋白質，是決定肉制品品質的最主要的蛋白，約占總蛋白含量的50% ～60%。研究表明鹽溶性蛋白性質對魚肉的保水性、膠凝性等加工特性影響甚大［3］。鹽溶性蛋白質中的幾種重要蛋白質如肌球蛋白、機動蛋白及機動球蛋白的凝膠機理已研究的較為清楚。目前，對豬肉、牛肉、雞肉以及海水魚的鹽溶性蛋白做了較為詳細的研究，而針對淡水魚鹽溶性蛋白熱誘導凝膠保水性及其乳化性等加工特性的研究相對較少。深入研究白鰱鹽溶蛋白的功能性質能促進白鰱的深加工和新產品開發(fā)，創(chuàng)造營養(yǎng)價值高、安全天然的食品，提高白鰱的附加值、改善鮮銷壓力大的狀況具有重要的意義。

本試驗以鮮活鰱魚為研究對象，優(yōu)化其鹽溶蛋白提取條件，并對鹽溶蛋白熱誘導凝膠保水性以及鹽溶蛋白乳化性等加工特性進行研究，并探討其用作高檔天然肉糜制品品質改良劑的可行性。

1 材料與方法

1.1 試驗原料及主要試劑

鮮活白鰱，購自生鮮市場(質量在1～1.25 kg/條);一級大豆油，購自嘉里糧油(深圳)有限公司。

NaOH、NaCl、KI、CuSO4·5H2O、四水合酒石酸鉀鈉、HCl、Na2HPO4、NaH2PO4、三聚磷酸鈉，天津市科密歐化學試劑有限公司，均為分析純;標準牛血清白蛋白，北京馳明瑞生物科技有限公司;十二烷基磺酸鈉(SDS)，生興生物技術(南京)有限公司，分析純。

1.2 實驗設備

LD4-2A低速離心機，北京醫(yī)用離心機廠;JJ-2組織搗碎勻漿機，富華儀器有限公司;DELTA320 pH計，梅特勒-托麗多儀器(上海)有限公司;AL204電子分析天平，梅特勒-托麗多儀器有限公司;C12型絞肉機，廣東省韶關市新通力食品機械有限公司;BCD-257SL冰箱，青島海爾股份有限公司;721N可見光分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司;ULTRA-TURRAX T25型高速分散儀，IKA儀科有限公司。

1.3 實驗方法

鹽溶蛋白的提取:取鰱魚背肉，剔出紅色肉，用絞肉機絞碎，稱取每份25 g，真空包裝后在-18℃下凍結，備用。提取鹽溶蛋白時，先將冷凍樣品在4℃下解凍，加入4倍質量0～4℃的蒸餾水，用高速組織搗碎機勻漿(6 000 r/min，5 min)。再轉入離心管中，離心(3 000 r/min，10 min)，去除上清液，重復1次，向沉淀中加入不同提取條件的 NaCl溶液，勻漿液在4℃靜置25 h后，紗布初濾，濾液經(jīng)(4 000 r/min，30 min)后得到上層溶液即為鹽溶蛋白質溶液。

單因素試驗:在固液比為1∶4(g∶mL)、提取液pH值為6.5、浸提時間為25 h的條件下，設置鹽濃度(mol/L)0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 七個梯度進行試驗，測定鹽濃度對鹽溶蛋白得率的影響;在NaCl濃度為0.6 mol/L、提取液 pH值為6.5、浸提時間為25 h的條件下，設置固液比(魚肉與添加溶液的比例，g∶mL)1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6 五個梯度進行試驗，測定固液比對鹽溶蛋白得率的影響;在NaCl濃度為 0.6 mol/L、固液比1∶4、提取液 pH為6.5的條件下，設置浸提時間為5、10、15、20、25、30六個梯度進行試驗，測定浸提時間對鹽溶蛋白得率的影響;在NaCl濃度為0.6 mol/L、固液比1∶4、浸提時間為 25 h，設置浸提 pH 值為 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0五個梯度進行試驗，測定浸提 pH對鹽溶蛋白得率的影響。

提取工藝的優(yōu)化:采用正交試驗法，通過以上單因素實驗設計出正交試驗如表1所示。

表1 正交因素實驗水平Table1 Factors and levels for the orthogonal test

蛋白質含量的測定采用雙縮脲法，以BSA(牛血清白蛋白)作為標準蛋白。

鹽溶蛋白熱誘導凝膠的制備及保水性的測定采用于巍［1］等的方法略作修改:先稱離心管質量(m)，取鹽溶蛋白提取液10 mL置于干凈離心管中制備凝膠，在4℃下保存24 h，稱離心管和凝膠質量m1，然后將凝膠在3 000 r/min、4℃下離心5 min，稱傾去水分后的離心管和凝膠的質量m2，則:

鹽溶蛋白乳化性的測定參考郭玲［4］的方法略作修改:取一定量的鹽溶蛋白提取液調節(jié)蛋白質濃度為1%，將鹽溶蛋白提取液與大豆油按體積比3∶1的比例混合，在10 000 r/min的轉速下乳化1 min后立即倒入小燒杯中，在杯底取50 μL的乳化液加入到5 mL的0.1%SDS(十二烷基磺酸鈉)中，充分搖勻后在波長500 nm處測定吸光度，重復4次。乳化活力指數(shù)(EAI)和乳化穩(wěn)定指數(shù)(ESI)用如下公式計算:

式中:A0，后迅速被稀釋的乳化液的吸光度;Φ，油相體積分數(shù)(V/V，φ=0.25);c，蛋白質量濃度，g/mL;A10，乳化液在靜置10 min后的吸光度。

2 結果與分析

2.1 蛋白質含量標準曲線

由圖1可知，雙縮脲法測定鹽溶蛋白含量的標準曲線為y=0.039x+0.008 1，其R2=0.999，具有較好的擬合度，可用于鹽溶蛋白乳化性測定中蛋白濃度的調整。

圖1 蛋白質含量標準曲線Fig.1 Protein content standard curve

2.2 鹽濃度對鹽溶蛋白得率的影響

由圖2可知，其他因素固定不變條件下，提取液的鹽溶蛋白得率隨著鹽濃度的提高而增加，說明鹽濃度在0.2～0.7 mol/L內，較高的鹽濃度能提高鹽溶蛋白的浸出率;鹽濃度在0.7 mol/L以上，提取液的蛋白濃度變化不大，尤其在0.5和0.6 mol/L濃度時，提取液蛋白得率基本不變，0.8 mol/L提取濃度時得率稍有下降，表明在鹽濃度在0.7 mol/L時，基本上將可溶的鹽溶蛋白提出。因此，鹽濃度0.7 mol/L是最優(yōu)的選擇，后續(xù)試驗采取鹽濃度0.7 mol/L。

圖2 鹽濃度對鹽溶蛋白得率的影響Fig.2 Effects of salt concentration on salt soluble proteinyield

2.3 固液比對鹽溶蛋白得率的影響

由圖3可知，提取液的鹽溶蛋白得率隨著固液比的增加而增加，從1∶3到1∶4之間增幅顯著，而后增幅緩慢。在要求提取液的鹽溶蛋白濃度和得率盡可能高的情況下，固液比1∶4為最優(yōu)，后續(xù)試驗采用鹽濃度 0.7 mol/L，固液比1∶4。

圖3 固液比對鹽溶蛋白得率的影響Fig.3 Effects of solid-liquid ratio on salt soluble protein yield

2.4 浸提時間對鹽溶蛋白得率的影響

從圖4可以看出，提取液中蛋白含量隨著浸提時間的增加而增加，在25 h以前，隨時間的延長蛋白含量增長幅度較大;25 h以后，隨浸提時間的延長蛋白質含量增長幅度很小。這表明，浸提25 h左右，鹽溶蛋白基本上都已溶出，如果時間過長，蛋白性質會發(fā)生變化，不利于后期試驗，綜合考慮25 h是最佳的浸提時間，后續(xù)試驗采取鹽濃度0.7 mol/L、固液比1∶4、提取時間為25 h。

圖4 時間與鹽溶蛋白得率的關系Fig.4 Effects of extraction time on salt soluble protein yield

2.5 浸提液pH值對鹽溶蛋白得率的影響

從圖5可以看出，隨著pH值的改變，鹽溶蛋白得率的變化幅度非常大，表明pH值的變化對鹽溶蛋白的提取的影響很大。pH值從5.0到6.5，鹽溶蛋白得率迅速升高，pH為6.5時鹽溶蛋白得率最高，達到12%;pH 6.5以后，得率開始下降。這與 Westphalen［5］和 Lesiow［6］的研究結果類似。

圖5 pH與鹽溶蛋白得率的關系Fig.5 Effects of pH on salt soluble protein yield

2.6 鹽溶蛋白提取工藝正交優(yōu)化

由表2和表3可以看出，最后確定鹽溶蛋白提取的最佳工藝條件為:A1B3C3D3，即提取液中NaCl濃度為0.8 mol/L、固液比為1∶5、提取液 pH 為6.0、浸提時間為30 h。在這4個因素中，影響大小順序是B＞C＞D＞A，即鹽濃度影響最大，其次是固液比和提取時間，pH值影響最小;浸提時間和pH值影響相對較小。最佳工藝參數(shù)組合A1B3C3D3出現(xiàn)在正交表中即實驗3，在此最佳條件下鰱魚背肉鹽溶蛋白得率為12.66%，提取效果最好。優(yōu)于劉安軍［7］研究中鱈魚鹽溶蛋白的最佳提取率。因此，后續(xù)實驗提取條件為NaCl濃度為0.8 mol/L、固液比 1∶5、提取液pH值為6.0、浸提時間為30 h。

表2 正交試驗表Table 2 Results of the orthogonal test

表3 正交試驗方差分析表Table 3 Variety analysis of the results

2.7 溫度對白鰱鹽溶蛋白熱誘導凝膠保水性的影響

從圖6可以看出，隨著處理溫度的升高，保水性升高，在 80℃ 時保水性達到最大值，最大值為98.24%，90℃ 時保水性逐漸下降。這可能是由于:一是溫度升高后，水分子的運動加劇，加快了蛋白質的吸水速度;二是在熱作用下，某些處于蛋白質分子內部的極性側鏈轉而朝向蛋白質表面，進而提高了蛋白質的親水性［8］。從結果可知，以保水性為依據(jù)，80℃為白鰱鹽溶蛋白最佳凝膠溫度，即后續(xù)試驗采用鹽溶蛋白熱凝膠溫度為80℃。

圖6 溫度對鹽溶蛋白凝膠保水性的影響Fig.6 Effects of temperature on salt soluble protein’s WHC

2.8 不同提取助劑對白鰱鹽溶蛋白熱誘導凝膠保水性的影響

由圖7可知，空白對照組的鹽溶蛋白熱凝膠保水性最低，添加磷酸鹽對鹽溶蛋白熱誘導凝膠的保水性均有提升作用，其中濃度0.1 mol/L的磷酸緩沖液［9］保水性最高，最高為96.61%，濃度為0.01 mol/L的三聚磷酸鈉溶液［10］效果次之。這是由于肌肉蛋白在pH值約5.4的等電點時保水性最差，添加磷酸鹽可將肉制品的pH值提高到6.0～6.4。磷酸鹽改變蛋白質電荷電勢使蛋白質之間互相排斥，從而產生更大的空間容納更多水分，提高肉的保水性［2，11］。而磷酸緩沖液對凝膠保水性的提升效果優(yōu)于三聚磷酸鈉，可能是由于磷酸緩沖液的離子強度較高，更利于鹽溶蛋白的溶解，因而凝膠保水性得以增強［12］。

圖7 不同提取助劑對鹽溶蛋白凝膠保水性的影響Fig.7 Effects of extraction agent on salt soluble protein’s WHC

2.9 白鰱鹽溶蛋白的乳化活性及乳化穩(wěn)定性

由表4可知，白鰱鹽溶蛋白的 EAI為19.47 m2/g，ESI為 89.50%，優(yōu)于董哲［13］文章中相同離子條件下草魚鹽溶蛋白的EAI和ESI。白鰱鹽溶蛋白的EAI、ESI的標準差均較小，具有較好穩(wěn)定性，偏差較小。由此可見，白鰱鹽溶蛋白具有較好乳化能力，能夠較好改善肉糜制品加工質量。

表4 鹽溶蛋白的乳化活性及乳化穩(wěn)定性Table 4 EAI and ESI of salt soluble protein

2.10 不同提取助劑對白鰱鹽溶蛋白乳化活性與乳化穩(wěn)定性的影響

由圖8可知，空白對照組白鰱鹽溶蛋白 EAI 最低，添加磷酸緩沖液及三聚磷酸鈉對白鰱鹽溶蛋白EAI均有較大提高，其中以三聚磷酸鈉提升作用最大，最大為19.52 m2/g，磷酸緩沖液次之。這可能是由于磷酸鹽提高了魚肉蛋白質的離子強度，改變了魚肉的pH值，影響了蛋白質分子疏水基團的分布情況，使得乳化活性提高。這與楊玉玲等［14］報道的 pH和離子強度是影響鹽溶蛋白的極顯著因素相符。

圖8 不同提取助劑對鹽溶蛋白的乳化活性(EAI)的影響Fig.8 Effects of extraction agent on salt soluble protein’s EAI

由圖9可知，添加磷酸緩沖液對白鰱鹽溶蛋白ESI有所改善，其穩(wěn)定性最高，最高為97%，而三聚磷酸鈉則使白鰱鹽溶蛋白ESI降低。這可能是由于磷酸鹽緩沖液對鹽溶蛋白乳濁液體系的pH具有較高的穩(wěn)定性，進而提高了乳化穩(wěn)定性。綜合比較磷酸緩沖液、三聚磷酸鈉對白鰱鹽溶蛋白EAI和ESI的影響，添加磷酸鹽緩沖液能較好提升白鰱鹽溶蛋白乳化能力。

圖9 不同提取助劑對鹽溶蛋白的乳化穩(wěn)定性(ESI)的影響Fig.9 Effects of extraction agent on salt soluble protein’s ESI

3 結論

本研究優(yōu)化了白鰱魚肉鹽溶蛋白的提取工藝參數(shù)，結果表明 NaCl濃度為0.8 mol/L、pH值為6.0、浸提時間為30 h、固液比為1∶5時，鰱魚魚背肉鹽溶蛋白最大提取濃度為2.602 4 g/100 g。通過對白鰱鹽溶蛋白的加工特性研究，發(fā)現(xiàn)其保水性可達98.24%，乳化活性最大為19.47 m2/g，乳化穩(wěn)定性最大為89.45%，具有較好的凝膠保水性及乳化能力，可有效改善肉糜制品加工品質。

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