中性蛋白酶生產(chǎn)菌種AS1.398的多相復(fù)核鑒定*

張欣，劉勇，李金霞，程池

(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京，100015)

枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)AS1.398是中性蛋白酶的生產(chǎn)菌種，俗稱1.398或1398，在我國蛋白酶制劑工業(yè)上有多年的使用歷史［1］。該菌株產(chǎn)生的蛋白酶可在中性條件下催化蛋白質(zhì)肽鍵水解，分解為多肽及游離氨基酸，廣泛應(yīng)用于食品、飼料、制藥、化妝品、洗滌劑、絲紡、毛皮軟化等行業(yè)［2］。

目前對(duì)1.398中性蛋白酶生產(chǎn)菌種的研究主要集中在誘變育種、酶學(xué)特性、發(fā)酵特性、蛋白酶基因克隆表達(dá)等方面，未見對(duì)該菌種的種屬鑒定報(bào)道。近幾年來，我國對(duì)生產(chǎn)菌種的管理越來越嚴(yán)格，如2010年衛(wèi)生部發(fā)布的《可用于食品的菌種名單》中對(duì)可用于食品的微生物菌種種類進(jìn)行了規(guī)定，2013年農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《飼料添加劑目錄》中對(duì)可用于飼料的酶制劑生產(chǎn)菌種及可直接添加的微生物種類進(jìn)行規(guī)定。基于1.398中性蛋白酶及其生產(chǎn)菌種在食品、飼料等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用和重要地位，本文利用16S rRNA、gyrA、gyrB多基因位點(diǎn)分析結(jié)合生理生化表型特征對(duì)1.398中性蛋白酶生產(chǎn)菌種CICC 10888進(jìn)行多相復(fù)核鑒定，從而對(duì)其科學(xué)種屬分類地位進(jìn)行論述。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

中性蛋白酶生產(chǎn)菌種1.398(=CICC 10888)，保藏于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

營養(yǎng)瓊脂(NA)培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;Taq DNA 聚合酶、dNTP、DL 2000 Marker，天根生化科技有限公司;GoldView，北京塞百盛基因技術(shù)有限公司;溶菌酶，Sigma公司;蛋白酶 K，Merk公司;API 50 CHB和API 20E試劑條，法國梅里埃公司;其他化學(xué)藥品均為進(jìn)口分析純產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)觀察

將供試菌株接種于NA培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)24 h后，觀察其菌落形態(tài)，革蘭氏染色觀察菌體形態(tài)特征;將供試菌株接種于TSA培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)24 h后，芽胞染色觀察芽胞形態(tài)［3］。

1.2.2 16S rRNA基因序列分析

利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(Tiangen公司)提取菌株CICC 10888基因組DNA，具體步驟參見試劑盒說明書。以基因組DNA為模板，利用通用引物對(duì)16S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增［4］。測序由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成。測序結(jié)果用Chromas軟件參照正反序列圖譜人工校對(duì)。將測序得到的結(jié)果在EzTaxon server 2.1數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)［5］，確定與已知近緣種序列的相似性。采用CLUSTAL W對(duì)1.398菌種及其若干近緣種16S rRNA基因序列進(jìn)行多序列比對(duì)［6］，并利用N-J法通過MEGA 4軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析［7］。

1.2.3 gyrA、gyrB基因序列分析

以菌株CICC 10888的基因組DNA為模板，對(duì)靶基因gyrA(DNA促旋酶A亞基基因)和gyrB(DNA促旋酶B亞基基因)進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件參照［8-9］。純化后的PCR產(chǎn)物由北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行測序。測序得到的結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)分析，并通過MEGA 4軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析［7］。

1.2.4 API檢測及生理生化特征

采用API 20 E、API 50 CH、API ZYM試劑條對(duì)菌株CICC 10888的酶活性、碳源利用、發(fā)酵產(chǎn)酸等生理生化表型特征進(jìn)行檢測，具體操作方法按試劑條說明書進(jìn)行。

將菌株接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，分別置于15、25、35、45、50 和 55 ℃溫度下培養(yǎng) 48 h，觀察菌株對(duì)溫度的耐受性。

將菌株接種于添加10%NaCl的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)48 h，觀察菌株對(duì)10%NaCl的耐受性。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

CICC 10888在營養(yǎng)瓊脂(NA)培養(yǎng)基平板上菌落呈乳白色，微凸起，圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤，不透明(見圖1);利用光學(xué)顯微鏡觀察顯示菌體細(xì)胞桿狀，成對(duì)或成鏈排列，大小為(0.3～0.7)μm×(1.5～3.0)μm，革蘭氏陽性(見圖2)。TSA培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，芽胞呈柱狀，端生，胞囊不膨大(見圖3)。

圖1 CICC 101888在營養(yǎng)瓊脂(NA)培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.1 The colonical morphology image of CICC 10888 on NA

圖2 菌株CICC 101888在營養(yǎng)瓊脂(NA)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h的顯微形態(tài)Fig.2 The cell morphology image of CICC 10888 on NA for 24h

圖3 菌株CICC 101888在TSA培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h的芽胞形態(tài)Fig.3 The spore morphology image of CICC 10888 on TSA for 24 h

2.2 16S rRNA基因序列分析

測序得到的菌株CICC 10888的16S rRNA基因序列信息提交至 GenBank，獲得登錄號(hào)KM654296。以Bacillus cereus ATCC 14579(AE016877)為外群，構(gòu)建CICC 10888與相關(guān)近緣模式菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖4)。

圖4 CICC 10888 16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.4 Phylogenetic analysis of CICC 10888 16S rRNA gene

由系統(tǒng)發(fā)育分析可斷，CICC 10888歸屬為枯草芽胞桿菌群(Bacillus subtilis group)，與解淀粉芽胞桿菌解淀粉亞種(Bacillus amyloliquefaciens subsp.amyloliquefaciens)、解淀粉芽胞桿菌植物亞種(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)、西姆芽胞桿菌(B.siamensis)、枯草芽胞桿菌(B.subtilis)等聚為一個(gè)系統(tǒng)發(fā)育分支，16S rRNA基因序列相似性均高于99%。

2.3 gyrA、gyrB基因序列分析

gyrA、gyrB基因可作為芽胞桿菌屬內(nèi)種間分子生物學(xué)鑒定的重要判據(jù)，能夠有效區(qū)分枯草芽胞桿菌和解淀粉芽胞桿菌以及其他枯草芽胞桿菌群近緣種［10-14］。以菌株 CICC 10888的基因組 DNA為模版，利用特異性引物(BS-gyrA-f/BC-gyrA-r［12］;BC-gyrB-f/BC-gyrB-r［13］)對(duì) gyrA 和 gyrB 基因進(jìn)行擴(kuò)增，序列信息提交至 GenBank，獲得登錄號(hào)分別為KM667968和KM654297。

gyrB基因序列分析顯示(見圖5)，菌株CICC 10888與解淀粉芽胞桿菌植物亞種(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)的gyrB基因序列相似度為99%，而與其他近緣種的相似度均低于97%，與枯草芽胞桿菌(B.subtilis)相似性僅為74%。gyrA基因序列分析顯示(見圖6)，菌株CICC 10888與解淀粉芽胞桿菌植物亞種(B.amyloliquefaciens subsp.plantarum)的gyrA基因序列相似度最高(98%)，與其他近緣種的相似度均低于97%，與枯草芽胞桿菌(B.subtilis)相似性僅為69%。通過gyrA和gyrB基因發(fā)育分析，菌株CICC 10888被鑒定為解淀粉芽胞桿菌植物亞種(B.amyloliquefaciens subsp.plantarum)，與原名稱枯草芽胞桿菌(B.subtilis)不符。

圖5 CICC 10888 gyrB基因系統(tǒng)發(fā)育分樹Fig.5 Phylogenetic analysis of CICC 10888 gyrB gene

圖6 CICC 10888 gyrA基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic analysis of CICC 10888 gyrA gene

經(jīng)16S rRNA、gyrA和gyrB基因序列的分子發(fā)育分析，菌株CICC 10888被鑒定為解淀粉芽胞桿菌植物亞種(B.amyloliquefaciens subsp.plantarum)。

2.4 生理生化特征鑒定

API試驗(yàn)及輔助生化試驗(yàn)結(jié)果顯示，菌株CICC 10888能水解明膠;具有β-葡萄糖苷酶、細(xì)胞色素氧化酶活性;并能夠利用蔗糖、糖原、D-乳糖等多種碳源物質(zhì)，生長溫度15～50℃，能耐受10%NaCl(表1)。生理生化特征與文獻(xiàn)報(bào)道［15］的解淀粉芽胞桿菌(B.amyloliquefaciens)一致。

表1 CICC 10888生理生化特征檢測結(jié)果Table 1 The physiological and biochemical characteristics of CICC 10888

2.5 鑒定結(jié)論

綜合形態(tài)學(xué)觀察、16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析、持家基因(gyrA和gyrB基因)的比對(duì)分析及生理生化特征試驗(yàn)結(jié)果，1.398中性蛋白酶生產(chǎn)菌種CICC 10888被鑒定為解淀粉芽胞桿菌植物亞種(B.amyloliquefaciens subsp.plantarum)。

3 討論

多相分類(polyphasic taxonomy)的概念最早是由Colwell［16］提出的，是綜合微生物多種不同信息，包括表型、基因型和系統(tǒng)發(fā)育分析，對(duì)微生物進(jìn)行分類的方法，已廣泛應(yīng)用于微生物分類學(xué)研究領(lǐng)域，能夠更加科學(xué)準(zhǔn)確地確定微生物的種屬分類地位。本文采用多相分類鑒定技術(shù)對(duì)中性蛋白酶生產(chǎn)菌種CICC 10888進(jìn)行種水平分類地位的復(fù)核鑒定，鑒定發(fā)現(xiàn)CICC 10888為解淀粉芽胞桿菌植物亞種(B.amyloliquefaciens subsp.plantarum)，與原名稱枯草芽胞桿菌(B.subtilis)不一致。

解淀粉芽胞桿菌(B.amyloliquefaciens)最早由Fukomoto于1943年提出［17-18］，由于其形態(tài)與枯草芽胞桿菌極為相似，而且僅僅通過生理生化試驗(yàn)很難與后者區(qū)分開來，因此并未得到認(rèn)可，很長時(shí)間以枯草芽胞桿菌命名。又因?yàn)槠渚哂挟a(chǎn)生豐富的胞外α-淀粉酶和蛋白酶的特性，后來提出將其作為枯草芽胞桿菌的一個(gè)亞種(B.subtilis subsp.amyloliquefaciens)或變種［19］。直至1987年，Priest等人通過DNA同源性證明了解淀粉芽胞桿菌(B.amyloliquefaciens)是區(qū)別于枯草芽胞桿菌群其他種的一個(gè)獨(dú)立種［20］。隨著分類學(xué)的發(fā)展，解淀粉芽胞桿菌(B.amyloliquefaciens)又細(xì)分成兩個(gè)亞種解淀粉芽胞桿菌解淀粉亞種和解淀粉芽胞桿菌植物亞種［14］。本文通過多相鑒定手段首次對(duì)1.398中性蛋白酶生產(chǎn)菌種進(jìn)行了復(fù)核，重新鑒定為解淀粉芽胞桿菌植物亞種。為規(guī)范菌種使用，建議將1.398中性蛋白酶生產(chǎn)菌種更名為解淀粉芽胞桿菌植物亞種。

［1］ GB/T 23527-2009.蛋白酶制劑［S］.

［2］ 許波，黃遵錫，陳金全，等.枯草芽胞桿菌1.398中性蛋白酶基因克隆及其在畢赤酵母中的高效表達(dá)［J］.云南師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，25(3):51-56.

［3］ LIU Y，LIU L，QIU FB，et al.Paenibacillus hunanensis sp.nov.，isolated from rice seeds［J］.Int J Syst Evol Micr，2010，60(6):1 266-1 270.

［4］ 劉洋，曹艷花，程池，等.1株西沙群島野生諾尼種子內(nèi)生細(xì)菌CICC 10599的分離與鑒定［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2014，40(6):65-69.

［5］ Chun J，Lee JH，Jung Y，et al.EzTaxon:a web-based tool for the identifi cation of prokaryotes based on 16S ribosomal RNA gene sequences［J］.Int J Syst Evol Micr，2007，57(10):2 259-2 261.

［6］ Thompson J D，Higgins D G，Gibson T J.CLUSTAL W:improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting，position-specific gap penalties and weight matrix choice［J］.Nucleic Acids Res，1994，22(22):4 673-680.

［7］ Tamura K，Dudley J，Nei M，et al.MEGA4:Molecular Evolutionary Genetics Analysis(MEGA)software version 4.0［J］.Molecular Biology and Evolution，2007，24(8):196-199.

［8］ De Clerck E，De Vos P.Genotypic diversity among Bacillus licheniformis strains from various sources［J］.FEMS Microbiol Lett.2004，231(1):91-8.

［9］ Yamamoto S，Harayama S.PCR amplification and direct sequencing of gyrB genes with universal primers and their application to the detection and taxonomic analysis of Pseudomonas putida strains［J］.Applied and Environmental Microbiology，1995，61(3):1 104-1 109.

［10］ Rezzonico F，Smits T H，Montesinos E，et al.Genotypic comparison of Pantoea agglomerans plant and clinical strains［J］.BMC Microbiology，2009，9:204-221.

［11］ Chun J，Bae K S.Phylogenetic analysis of Bacillus subtilis and related taxa based on partial gyrA gene sequences［J］.Antonie Van Leeuwenhoek，2000，78(2):123-127.

［12］ Marcela J G，F(xiàn)ernanda G，Stella M R，et al.Polyphasic identification of closely related Bacillus subtilis and Bacillus amyloliquefaciens isolated from dairy farms milk powder［J］.Journal of Microbiology，Biotechnology and Food Sciences，2013，2(5):2 326-2 331.

［13］ Wang L T，Lee F L，Tai C J，et al.Comparison of gyrB gene sequences，16S rRNA gene sequences and DNADNA hybridization in the Bacillus subtilis group［J］.Int J Syst Evol Micr，2007，57(8)，1 846-1 850.

［14］ Borriss R，CHEN X H，Rueckrt C，et al.Relationship of Bacillus amyloliquefaciens clades associated with strains DSM 7Tand FZB42T:a proposal for Bacillus amyloliquefaciens subsp.amyloliquefaciens subsp.nov.and Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum subsp.nov.based on complete genome sequence comparisons［J］.Int J Syst Evol Micr，2011，61(8):1 786-1 801.

［15］ Madhaiyan M，Poonguzhali S，Kwon SW，et al.Bacillus methylotrophicus sp.nov.，a methanol-utilizing，plantgrowth-promoting bacterium isolated from rice rhizosphere soil［J］.Int J Syst Evol Micr，2010，60(10):2 490-2 495.

［16］ Cowell R P.Polyphsic taxonomy of the genus Vibiro:numberical taxonomy of Vibiro cholera，Vibiro parahaemolyticus，and related Vibro species［J］.Journal of Bacteriology，1970，104(1):410-433.

［17］ Fukomoto J.Studies on the production of bacterial amylase.I.Isolation of bacteria secreting potent amylase and their distribution［J］.J Agric Chem SOC Jpn，1943，19:487-503.

［18］ Fukomoto J.Studies on the production of bacterial amylase.Ⅱ.Bacterial and physiological nature［J］.J Agric Chem SOC Jpn，1943，19:643-650.

［19］ Gordon R E，Haynes W C，Hor-Nay Pang C.The Genus Bacillus［M］.Washington DC:U.S.Department of Agriculture，1973:107-108.

［20］ Priest F G，Goodfellow M，Shute L A."Bacillus amyloliquefacienssp.nov.，nom.rev."［J］.International Journal of Systematic Bacteriology，1987，37(1):69-71.