灰產(chǎn)色鏈霉菌海藻糖合成酶的自誘導(dǎo)表達(dá)及兩階段溫度控制發(fā)酵的優(yōu)化

楊鑫，吳茜，崔懷言，徐嫻，朱麗英，江凌，2

1(南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇南京，210009)

2(南京工業(yè)大學(xué) 食品與輕工學(xué)院，江蘇南京，210009)3(南京工業(yè)大學(xué)理學(xué)院，江蘇南京，210009)

海藻糖是自然界中普遍存在的一種非還原性二糖，作為一種天然的非特異性生物保護(hù)劑備受人們的矚目［1］。隨著海藻糖應(yīng)用范圍日益擴(kuò)大，市場(chǎng)需求不斷增加，開發(fā)一種簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)的海藻糖生產(chǎn)工藝是目前亟待解決的問題。海藻糖合成酶(trehalose synthase，EC 5.4.99.16)是一種新型變位酶，通過分子內(nèi)轉(zhuǎn)糖基作用將α，α-1，4糖苷鍵連接的麥芽糖一步轉(zhuǎn)化為α，α-1，1糖苷鍵連接的海藻糖，工藝簡(jiǎn)單，易于調(diào)控，適合工業(yè)放大生產(chǎn)。海藻糖合成酶一步酶催化過程既不消耗高能物質(zhì)(如UDP，二磷酸尿核苷)，也不依賴磷酸，且底物麥芽糖目前生產(chǎn)技術(shù)成熟，廉價(jià)易得，與成品海藻糖相比有較大的價(jià)格空間［2］?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的海藻糖合成酶分子量集中在60～80 kDa，報(bào)道的麥芽糖轉(zhuǎn)化率在50%～70%左右，其中轉(zhuǎn)化率較高的海藻糖合成酶基因多來自極端微生物和嗜熱菌，也體現(xiàn)了海藻糖的抗逆功能［3］。因此，海藻糖合成酶以麥芽糖為底物生產(chǎn)海藻糖是一條極有工業(yè)化前景的途徑。

自誘導(dǎo)(auto-induction)［3-4］與傳統(tǒng)的 IPTG(異丙基-β-D硫代半乳糖苷)誘導(dǎo)方法相比，接種后不需對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)，極大地方便了高通量篩選;且以價(jià)格低廉、無毒的乳糖替代IPTG可大大降低生產(chǎn)成本，在重組蛋白的發(fā)酵生產(chǎn)中有著重要的意義。此外，針對(duì)重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，采用兩階段溫度調(diào)控策略［5］，先在37℃下培養(yǎng)增加菌體量，然后降低溫度到25℃減緩重組蛋白的合成速率以促進(jìn)蛋白的正確折疊。小分子物質(zhì)乙醇在大腸桿菌物質(zhì)代謝過程中具有多重作用，如改變油脂的不飽和度，調(diào)節(jié)糖酵解通量，本文將有效劑量的乙醇添加到細(xì)菌生長(zhǎng)后期，以期提高可溶性蛋白的表達(dá)量［6-8］?；诖?，本文克隆了灰產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces griseochromogenes)海藻糖合成酶基因，將該基因插入表達(dá)載體pET28a中，導(dǎo)入E.coli中高效表達(dá)并對(duì)其自誘導(dǎo)發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

灰產(chǎn)色鏈霉菌(S.griseochromogenes)YX-1為本實(shí)驗(yàn)室保存，大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)為本實(shí)驗(yàn)室保存;質(zhì)粒pET28a，pMD20-T購自TaKaRa公司。

1.1.2 主要試劑和儀器

Taq DNA聚合酶、T4DNA連接酶、限制性核酸內(nèi)切酶(NdeⅠ、HindⅢ)、DNA Marker均購自TaKaRa公司;DNA凝膠回收試劑盒、DNA質(zhì)粒提取試劑盒均購自TaKaRa公司;引物合成和測(cè)序由蘇州金唯智生物科技有限公司完成;PCR儀、DNA凝膠電泳儀、DNA凝膠成像儀、蛋白SDS-PAGE電泳儀和成像儀均購自Bio-Rad公司;海藻糖標(biāo)準(zhǔn)樣品和麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)樣品為色譜分析純;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

大腸桿菌LB培養(yǎng)基配置參照分子克?。?］;自誘導(dǎo)培養(yǎng)基［10］:甘油 5 g/L，大豆蛋白胨 10 g/L，Na2HPO46 g/L，K2HPO46 g/L，NH4Cl 1 g/L，NaCl 0.5 g/L，MgSO4·7 H2O 6 g/L［1］。大腸桿菌的普通LB培養(yǎng)溫度為37℃，自誘導(dǎo)培養(yǎng)條件為30℃，兩階段溫度培養(yǎng)條件為37℃培養(yǎng)2.5 h，25℃培養(yǎng)14 h。

1.3 PCR擴(kuò)增目的基因Tres

通過比對(duì)海藻糖合成酶基因的保守序列，分析設(shè)計(jì)了簡(jiǎn)并 PCR 引物［11］。引物為 F-jian、R-jian(表1)。純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD20-T連接，送金唯智測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序分析。根據(jù)測(cè)序得到的灰產(chǎn)色鏈霉菌海藻糖合成酶核苷酸序列，設(shè)計(jì)上游引物、下游引物(表1)，下劃線為酶切位點(diǎn)，便于連接到表達(dá)載體pET28a上。PCR條件按94℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，完成30個(gè)循環(huán)后72℃后延伸5 min。將PCR產(chǎn)物連接T載體后與pET28a質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行NdeⅠ、HindⅢ雙酶切，酶切產(chǎn)物連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，篩選得到的重組質(zhì)粒命名為pET28a-tres，委托蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 簡(jiǎn)并PCR引物和克隆引物Table 1 Primers for degenerated PCR and cloning

1.4 重組海藻糖合成酶SDS-PAGE分析及酶活測(cè)定［12］

1.4.1 重組海藻糖合成酶表達(dá)產(chǎn)物的分離及SDSPAGE分析

重組菌于LB培養(yǎng)基中(含終濃度50 mg/L卡納霉素)，37℃過夜培養(yǎng)，再以1%的接種量接種至新鮮的LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8時(shí)，加入IPTG(終濃度1 mmol/L)，30℃誘導(dǎo)表達(dá)14 h，取2 mL發(fā)酵液，12 000 ×g離心1 min收集菌體，0.04 mol/L的磷酸緩沖(PBS)液清洗兩次(pH 7.0)，加等體積的PBS重懸，超聲破碎離心得上清，取30 μL粗酶液和10 μL 4 ×SDS-PAGE loading buffer混合，沸水煮沸5 min。取5 μL進(jìn)行SDS-PAGE分析。確定表達(dá)產(chǎn)物的蛋白分子量和表達(dá)程度。

1.4.2 海藻糖的檢測(cè)

取200 μL超聲破碎粗酶液加入800 μL用0.04 mol/L磷酸鹽緩沖液PBS(pH 7.0)配置的0.15 mol/L麥芽糖溶液，30℃反應(yīng)1.5 h后，沸水浴5 min，采用高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)體系中海藻糖的含量。轉(zhuǎn)化率測(cè)定反應(yīng)體系:50 mL反應(yīng)液裝于150 mL三角瓶中，反應(yīng)液是以0.04 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)配制的30%(w/v)麥芽糖溶液加入50 mL培養(yǎng)菌液離心菌體中進(jìn)行全細(xì)胞催化，30℃反應(yīng)24 h，取樣測(cè)定海藻糖轉(zhuǎn)化率。

分析條件:色譜柱:Shodex SUGAR SZ5532柱(6.0 mm ID ×150 mm);檢測(cè)器:Shodex RI101;柱溫:60℃，壓力:30×105Pa;反應(yīng)樣品稀釋10倍，進(jìn)樣 10 μL;流動(dòng)相為乙腈∶水(75∶25);流速:1.0 mL/min。酶活力單位定義:在最適條件下，1 min轉(zhuǎn)化1 nmol麥芽糖為海藻糖所需海藻糖合成酶的量為1個(gè)酶活單位(1U)。

1.5 重組海藻糖合成酶工程菌發(fā)酵條件優(yōu)化

1.5.1 LB發(fā)酵和自誘導(dǎo)發(fā)酵酶活對(duì)比

30℃ IPTG誘導(dǎo)發(fā)酵及自誘導(dǎo)發(fā)酵8、10、12 h，分別取2 mL發(fā)酵液，HPLC測(cè)定酶活。

1.5.2 自誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)的最適溫度

以1%的接種量接種到自誘導(dǎo)培養(yǎng)基，本研究選擇37、30、25 ℃三個(gè)培養(yǎng)溫度，培養(yǎng) 10、12、14、16、18 h后分別取2 mL發(fā)酵液，HPLC測(cè)定酶活。

1.6 兩階段溫度控制培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1.6.1 最適兩階段溫度控制培養(yǎng)條件

以1%的接種量接種到自誘導(dǎo)培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)2.5 h后，分別在30和25℃繼續(xù)培養(yǎng)，不同培養(yǎng)時(shí)間下(10、12、14、16、19、21 h)分別取2 mL 發(fā)酵液，選取30℃恒溫培養(yǎng)作為對(duì)照，HPLC測(cè)定酶活。

1.6.2 添加小分子物質(zhì)

以1%的接種量接種到自誘導(dǎo)培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)2.5 h后，25℃繼續(xù)培養(yǎng)，14 h后添加3%乙醇，以不添加乙醇作為對(duì)照，不同培養(yǎng)時(shí)間(16，19 h)分別取2 mL培養(yǎng)液，HPLC測(cè)定酶活。并對(duì)粗酶液進(jìn)行SDS-PAGE蛋白凝膠電泳，分析不同條件下蛋白表達(dá)量的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 灰產(chǎn)色鏈霉菌Tres基因的克隆及序列分析

以灰產(chǎn)色鏈霉菌總DNA為模板，簡(jiǎn)并PCR擴(kuò)增獲得產(chǎn)物海藻糖合成酶片段，測(cè)序得到核苷酸序列。根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)的引物成功擴(kuò)增出灰產(chǎn)色鏈霉菌海藻糖合成酶DNA片段，電泳結(jié)果(圖1)顯示在1.7 kb左右有明顯條帶，條帶長(zhǎng)度與預(yù)期的海藻糖合成酶基因大小符合。該片段含有1個(gè)開放閱讀框，編碼572個(gè)氨基酸。

圖1 Tres基因PCR產(chǎn)物凝膠電泳分析Fig.1 Electrphoresis of PCR products of tres gene

Blast分析顯示該序列與發(fā)布的玫瑰鏈霉菌(Streptosporangium roseum)的海藻糖合成酶同源性為80%。使用 SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在線對(duì)氨基酸序列進(jìn)行分析顯示，Tres為胞內(nèi)酶，沒有信號(hào)肽。Compute Pi/Mw(http://web.expasy.org/cbi-bin/compute_pi/pi_tool)分析顯示Tres理論等電點(diǎn)為4.86。

2.2 重組海藻糖合成酶SDS-PAGE凝膠電泳分析

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)9 h，轉(zhuǎn)化子發(fā)酵液上清液進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分析(圖2)，空質(zhì)粒 pET28a轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)發(fā)酵液上清作為對(duì)照，結(jié)果顯示在66 kDa得到明顯的條帶，且目的蛋白大多集中在上清液中，超聲破碎沉淀中目的蛋白含量相對(duì)很少。該蛋白質(zhì)分子量與核酸序列推測(cè)所得的理論分子質(zhì)量66 kDa相符，表明重組質(zhì)粒pET28a-tres在大腸桿菌中表達(dá)成功，且大部分目的蛋白以可溶性蛋白存在。

圖2 重組菌發(fā)酵表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE檢測(cè)分析Fig.2 SDS-PAGE anlysis of recombinant trehalose synthase

2.3 重組海藻糖合成酶工程菌發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1 自誘導(dǎo)發(fā)酵和IPTG誘導(dǎo)發(fā)酵比較

取超聲破碎粗酶液30℃恒溫催化0.15 mol/L的麥芽糖1.5 h。IPTG誘導(dǎo)12h獲得的粗酶液中海藻糖合成酶催化酶活為0.83×104U/mL，自誘導(dǎo)發(fā)酵12 h獲得的粗酶液中海藻糖合成酶催化酶活為1.00×104U/mL。以本實(shí)驗(yàn)中酶活力最高者作為100%，繪制相對(duì)酶活曲線(圖3)。結(jié)果顯示，自誘導(dǎo)培養(yǎng)較IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)，海藻糖合成酶的催化酶活提高了20.48%，說明采用乳糖作為誘導(dǎo)劑的自誘導(dǎo)發(fā)酵能有效提高重組大腸桿菌海藻糖合成酶活性。亦有文獻(xiàn)報(bào)道，以乳糖為誘導(dǎo)劑的自誘導(dǎo)培養(yǎng)基無論在產(chǎn)出蛋白的質(zhì)量還是數(shù)量上都比傳統(tǒng)方法有很大提高［13］。

圖3 自誘導(dǎo)發(fā)酵和IPTG誘導(dǎo)發(fā)酵比較Fig.3 The comparison of auto-induction fermentation and fermentation induced by IPTG

2.3.2 自誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)溫度的優(yōu)化

自誘導(dǎo)發(fā)酵較傳統(tǒng)的IPTG誘導(dǎo)發(fā)酵，目的蛋白產(chǎn)量有所提高，接下來的實(shí)驗(yàn)主要針對(duì)自誘導(dǎo)發(fā)酵進(jìn)行研究，其中培養(yǎng)溫度對(duì)微生物生長(zhǎng)、產(chǎn)物合成及代謝的影響尤為顯著［13］。選擇37、30、25℃三個(gè)溫度，分別于 10、12、14、16、19、21 h 取樣測(cè)定酶活(圖 4)。結(jié)果顯示，30℃自誘導(dǎo)培養(yǎng)19 h海藻糖合成酶催化酶活最高，達(dá)到1.24×104U/mL。

2.4 兩階段溫度控制培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.4.1 最適兩階段溫度控制培養(yǎng)條件

圖4 溫度對(duì)自誘導(dǎo)發(fā)酵酶活的影響Fig.4 Effect of the temperature on the activity of recombinant enzyme by auto-induced fermentation

既然溫度對(duì)重組菌產(chǎn)酶有明顯的作用，本研究采用兩階段溫度調(diào)控策略，先在37℃下培養(yǎng)增加菌體量，然后低溫培養(yǎng)減緩重組蛋白的合成速率以促進(jìn)蛋白正確折疊［14］。37 ℃培養(yǎng)2.5 h，30、25 ℃繼續(xù)培養(yǎng)10、12、14、16、19、21h，取樣測(cè)酶活(圖 5)，30 ℃恒溫培養(yǎng)作為對(duì)照。結(jié)果顯示，兩階段溫度控制最適培養(yǎng)條件為:37℃培養(yǎng)2.5 h，25℃繼續(xù)培養(yǎng)，最高酶活達(dá)到1.26×104U/mL，較30℃恒溫培養(yǎng)提高了0.96%。

圖5顯示，37℃培養(yǎng)2.5 h，菌體快速生長(zhǎng)，較快進(jìn)入產(chǎn)酶期，提高了發(fā)酵的生產(chǎn)強(qiáng)度。降至25℃有利于重組蛋白的正確折疊。兩階段溫度控制策略提高了海藻糖合成酶的合成能力，發(fā)酵10～18 h都有較高的酶活。

圖5 兩階段溫度對(duì)自誘導(dǎo)發(fā)酵酶活的影響Fig.5 Effect of the two-stage temperature on the activity of recombinant enzyme by auto-induced fermentation

2.4.2 添加小分子物質(zhì)

本文將有效劑量的乙醇添加到細(xì)菌生長(zhǎng)后期，提高目的蛋白的可溶性。37℃培養(yǎng)2.5 h，25℃繼續(xù)培養(yǎng)，穩(wěn)定后期14 h時(shí)添加3%乙醇，不添加乙醇作為對(duì)照，分別取樣測(cè)定酶活，結(jié)果顯示，添加乙醇有助于可溶性目的蛋白濃度的提高(圖6)，催化酶活較對(duì)照提高了2.68%。

圖6 乙醇對(duì)可溶性目的蛋白濃度的影響Fig.6 The influence of ethanol on the concentration of soluble protein

本實(shí)驗(yàn)在重組大腸桿菌穩(wěn)定期后期添加3%的乙醇，改變了培養(yǎng)環(huán)境的滲透壓，增加了蛋白表達(dá)量，同時(shí)乙醇誘導(dǎo)分子伴侶的表達(dá)，進(jìn)而提高可溶性目的蛋白的產(chǎn)量，結(jié)果顯示海藻糖合成酶催化麥芽糖酶活為:1.29×104U/mL，較最初提高了55.25%。該酶進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化30%的麥芽糖，24 h轉(zhuǎn)化率可達(dá)70%以上，生成海藻糖濃度約21%(w/v)(圖7)。

圖7 麥芽糖轉(zhuǎn)化生產(chǎn)海藻糖液相圖譜Fig.7 HPLC results for maltose and trehalose production

3 討論

本文構(gòu)建了含有灰產(chǎn)色鏈霉菌海藻糖合成酶基因的重組大腸桿菌BL21(DE3)。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)作為一種成熟的原核表達(dá)系統(tǒng)，已廣泛應(yīng)用于重組蛋白的外源表達(dá)，lac及其衍生的啟動(dòng)子常被用來裝配到表達(dá)載體中，需要IPTG作為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)，但傳統(tǒng)誘導(dǎo)劑IPTG因其價(jià)格昂貴和潛在的毒性不適用于大規(guī)模生產(chǎn)，且各國皆不提倡使用。乳糖作為誘導(dǎo)物替代IPTG的報(bào)道已有很多，對(duì)海藻糖合成酶重組菌自誘導(dǎo)培養(yǎng)和LB培養(yǎng)的對(duì)比，乳糖誘導(dǎo)在最終菌體密度和目的蛋白產(chǎn)量均有較大提高。

溫度對(duì)微生物細(xì)胞生長(zhǎng)、產(chǎn)物合成及代謝的影響是多方面的，不僅可以改變培養(yǎng)基的性質(zhì)，而且會(huì)影響細(xì)胞代謝過程中各種關(guān)鍵酶的活性，因此在發(fā)酵過程中必須保證穩(wěn)定且合適的外界環(huán)境。兩階段溫度調(diào)控研究結(jié)果表明，在海藻糖合成酶重組菌自誘導(dǎo)發(fā)酵過程中，采用變溫培養(yǎng)模式較單一溫度培養(yǎng)模式，重組酶表達(dá)量和酶活都有明顯提高。水溶性烷醇乙醇不僅可以促進(jìn)細(xì)菌培養(yǎng)后期生長(zhǎng)，且乙醇可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)極性，增加蛋白質(zhì)折疊，在促進(jìn)目的蛋白的可溶性表達(dá)方面具有明顯作用。

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