CK15在食管鱗癌患者組織及血清中的表達與意義

張艷姣，許翠萍，喬亞光，申宇宏，趙和平(山西醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)院消化科，太原 03000;通訊作者，E-mail:cuipingxu@hotmail．com)

食管鱗癌(esophageal squamous cell cancer，ESCC)是我國常見的惡性腫瘤。國內(nèi)研究［1］發(fā)現(xiàn)，由于食管鱗癌早期癥狀不明顯，許多患者未能及時就診以致病情惡化，超過70%的食管鱗癌患者就診時已處于晚期，即使手術(shù)切除預(yù)后效果也不容樂觀。因此，對食管鱗癌的早期診斷意義重大。本研究通過檢測細胞角蛋白15(Cytokeratin15，CK15)在食管鱗癌患者癌組織中的表達情況，檢測CK15、增殖細胞核抗原(PCNA)及細胞角蛋白19片段抗原(CYFRA21-1)在食管鱗癌患者血清中的表達情況，探討CK15在食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展中可能的作用及意義，為食管鱗癌診斷標志物的發(fā)現(xiàn)提供實驗依據(jù)。

1 材料及方法

1．1 臨床資料

本研究通過倫理委員會審查并簽署知情同意書。30例食管鱗癌患者均經(jīng)病理確診的食管組織活檢標本都來自山西醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院，分別取食管鱗癌組織及癌旁組織(距病灶中心為5－10 cm，內(nèi)鏡下黏膜顏色正常，結(jié)構(gòu)完整，并且病理檢測無癌細胞)放于Corning管中－80℃保存。抽取食管鱗癌患者組、體檢的正常對照組受檢者晨起空腹狀態(tài)肘靜脈血5 ml，3 000 r/min離心10 min，分裝于Eppendorf管中－80℃保存。食管鱗癌組男性16例，女性14例，年齡 44－70歲，平均(59．9±7．38)歲。正常對照組男性10例，女性20例，年齡28－60歲，平均(42．40±9．95)歲。

1．2 試劑與儀器

兔抗人CK15單克隆抗體分子量49 kD(英國ABcam公司);鼠抗人β-actin單克隆抗體，分子量43 kD，山羊抗兔二抗，山羊抗鼠二抗均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;CK15、PCNA的ELISA試劑盒購自上海酶聯(lián)生物有限公司。CYFRA21-1試劑購自蘇州常光華醫(yī)生物試劑有限公司。

半干電轉(zhuǎn)儀(Bio-Rad，USA)，Alpha多功能數(shù)字凝膠成像分析系統(tǒng)(美國ProteinSimple公司)，ZLX800全自動酶標儀(Bio-Tek，USA)，CYFRA21-1檢驗儀器使用EVERESYS A1800系列化學發(fā)光測定儀(蘇州常光華醫(yī)有限公司)。

1．3 方法

1．3．1 Western blot法檢測CK15的表達 將收集的組織加入組織裂解液后研磨，制備總蛋白液，按照二奎琳甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒說明書測定蛋白濃度。10%SDS不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳(電壓80－120 V)，半干電轉(zhuǎn)移(PVDF膜，15 V恒壓，15 min)、封閉、加一抗(1∶700)及抗 β-actin單體(1∶700)4℃孵育過夜，洗膜后分別加HRP標記的羊抗兔二抗(1∶10 000)及HRP標記的羊抗鼠二抗(1∶10 000)孵育(4 ℃，2 h)、洗膜、顯影。運用Alpha View圖像分析軟件分析樣品灰度值，以目的蛋白/β-actin表示CK15的相對蛋白表達量。

1．3．2 ELISA 法檢測血清中 CK15、PCNA 的含量 按說明書操作步驟稀釋標準品，設(shè)空白孔、標準孔、待測樣本孔后準確加樣品及標準品，溫育、洗板、加酶、再溫育、洗板、加顯色劑，溫育10 min后加終止液，最后450 nm波長下依序測量各孔的吸光度值。CK15正常人血清學參考值范圍是25－490 μg/L，PCNA正常人血清學參考范圍是0．45－8．5 ng/ml。

1．3．3 化學發(fā)光法檢測 CYFRA21-1 按EVERESYS A1800系列化學發(fā)光測定儀說明書操作步驟進行操作。CYFRA21-1正常人血清學的參考值為小于 4．0 ng/ml。

1．4 統(tǒng)計學分析

應(yīng)用SPSS 17．0統(tǒng)計學軟件進行結(jié)果分析，計量資料比較采用t檢驗，不服從正態(tài)分布采用秩和檢驗(u)，檢驗水準P＜0．05。診斷實驗評價:敏感性=食管鱗癌檢測陽性/食管鱗癌病人總數(shù)，特異性=正常人檢測陰性數(shù)/正常人總?cè)藬?shù)，聯(lián)合檢測采用并聯(lián)方法。

2 結(jié)果

2．1 Western blot檢測 CK15的表達

Western blot檢測結(jié)果顯示，CK15及β-actin的條帶在PVDF膜中主要分別分布在分子量大小為49 kD及43 kD的區(qū)域中，CK15在食管鱗癌組織及癌旁組織中的表達相對強度分別為5．21±2．80和24．35±11．39，CK15在食管鱗癌組織中的表達明顯低于癌旁食管組織(P＜0．05，見圖1)。

圖1 CK15在食管鱗癌組織中的表達Figure 1 Expression of CK15 in the tissues of patients with ESCC

2．2 ELISA法檢測CK15、PCNA及化學發(fā)光法測定CYFRA21-1的表達

食管鱗癌患者血清CK15水平明顯低于正常對照組(P＜0．05)，CYFRA21-1水平明顯高于正常對照組(P＜0．05)，PCNA在食管鱗癌患者血清及正常對照組中表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0．05，見表1)。

表1 食管鱗癌患者組和正常對照組血清中三種指標含量的分析Table 1 Comparison of serum levels of three indexes between ESCC and control group

單項及聯(lián)合檢測血清CK15與CYFRA21-1對食管鱗癌的診斷分析見表2。單項檢測血清中CK15、CYFRA21-1水平對食管鱗癌診斷的敏感性分別為33．33%、30．00%，而聯(lián)合檢測敏感性為60．00%，因此聯(lián)合檢測可提高對食管鱗癌診斷的敏感性。

表2 CK15及CYFRA21-1診斷食管鱗癌的分析 (%)Table 2 Comparison of sensitivity and specificity of CK15 and CYFRA21-1 in diagnosis of ESCC(%)

3 討論

細胞角蛋白(CK)是細胞骨架蛋白，其基因表達有很強的規(guī)律性，受細胞分化的調(diào)節(jié)，由30種不同的基因編碼，可以轉(zhuǎn)錄成20種不同的多肽，分為Ⅰ型角蛋白和Ⅱ型角蛋白［2］。CK15是Ⅰ型酸性細胞角蛋白，既往研究認為，CK15是毛囊干細胞特異性標記物［3］。Lyle等研究表明:CK15在毛囊隆突區(qū)細胞中有特異性的表達，CK15陽性細胞具有干細胞生長周期慢的特點，同時高表達β1整合素和CK19。CK15陽性細胞在毛囊生長期開始時有短暫的增殖，而在其余生長周期中處于靜止狀態(tài)，在細胞的分化過程中CK15表達量減少出現(xiàn)時間較CK19更早，證明CK15陽性細胞是表皮干細胞，CK15可用于鑒定表皮干細胞［4］。多數(shù)研究不僅強調(diào)CK15的表達在上皮性腫瘤診斷中的重要性，還強調(diào)發(fā)育異常的角化細胞抑制CK15的表達而使鱗狀細胞發(fā)生癌變［5］。大量研究證明，CK15還存在于食管、宮頸及角膜緣上皮的鱗狀細胞中［6－9］，病理條件下還存在于口腔鱗狀細胞中［10］。但CK15是否在食管鱗癌中表達尚未見報道。本研究采用兩種方法檢測到CK15在食管鱗癌患者的表達下調(diào)，提示CK15的表達下調(diào)與食管鱗癌的發(fā)生有關(guān)。

CK19是較早被發(fā)現(xiàn)的能用來標記表皮干細胞的標志物之一。CYFRA21-1為CK19可溶性片段抗原，CYFRA21-1分布于上皮細胞胞質(zhì)中，當上皮組織發(fā)生癌變時，可加速惡性上皮細胞的降解，使得大量可溶性的細胞角蛋白片段釋放到細胞外液及血液中。因此，血液中CYRFA21-1的檢測有助于腫瘤的診斷和病情監(jiān)測。CYFRA21-1被廣泛認為是非小細胞肺癌敏感的腫瘤標志物［11］。近來有報道認為，CYFRA21-1在腫瘤中的陽性率較其他腫瘤標志物高［12］。已有研究報道CYFRA21-1可能是診斷人類食管鱗癌有價值的標志物，且CYFRA21-1不僅可評估食管鱗癌治療前的臨床療效而且還可以預(yù)測食管鱗癌的預(yù)后［13］。目前CYFRA21-1已經(jīng)在臨床上用于鱗癌的輔助診斷，但因其敏感性差，常需與其他的腫瘤標志物聯(lián)合檢測。

PCNA作為DNA聚合酶δ的輔助蛋白，其表達與細胞周期有關(guān)，為細胞核內(nèi)DNA的復(fù)制與修復(fù)中各蛋白之間的協(xié)調(diào)作用提供平臺，其量的變化與DNA的合成相一致，參與組織的增殖、分化以及損傷后修復(fù)［14］，因此可作為評價細胞增殖狀態(tài)的一項指標，也可用于判斷腫瘤的惡性程度及預(yù)后。PCNA目前被認為是鱗狀上皮細胞腫瘤的特異性標志物。國內(nèi)孫海濤等［15］研究證實PCNA在食管鱗癌組織中表達增高。這也與本課題組前期的PCNA免疫組化的實驗結(jié)果一致。然而本實驗研究中發(fā)現(xiàn)PCNA在食管鱗癌組及正常對照組血清中表達無差異，可能因為PCNA是反映細胞核增殖的指標，主要在組織細胞核中表達而在血清中不分泌或者不表達。

本實驗結(jié)果顯示食管鱗癌患者組織及血清中CK15表達明顯低于正常對照組，而CYFRA21-1在食管鱗癌患者血清中的表達明顯高于正常對照組，提示CK15、CYFRA21-1對食管鱗癌的輔助診斷有一定的價值。表2的結(jié)果顯示，分別單項檢測血清中CYFRA21-1、CK15水平對食管鱗癌診斷的敏感性均呈較低水平，所以在食管鱗癌的診斷中依靠單項腫瘤標志物容易引起漏診，而聯(lián)合檢測CYFRA21-1、CK15可明顯提高食管鱗癌診斷的敏感性。

綜上，本研究觀察CK15在食管鱗癌患者組織及血清中的表達情況，結(jié)果提示CK15與食管鱗癌的發(fā)生有關(guān)，聯(lián)合檢測血清CYFRA21-1、CK15可提高對食管鱗癌診斷的敏感性，是診斷食管鱗癌的標志物，今后將在臨床上擴大樣本進一步驗證。

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