石斛合劑對2型糖尿病模型大鼠脂肪組織內(nèi)脂素基因表達(dá)的影響

嚴(yán)曉丹，王 林，鄭雪花，黃靈艷(福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福州 350;福建省血液中心)

糖尿病作為一種由遺傳和環(huán)境因素相互作用所致的臨床綜合征，發(fā)病率在全球范圍每年都有增長。本課題組近年來在臨床上開展石斛合劑加減方治療2型糖尿病取得良好效果［1］，因此我們通過高脂高糖飲食喂養(yǎng)加注射鏈脲佐菌素建立2型糖尿病模型，測定血糖血脂、內(nèi)脂素等指標(biāo)，探討內(nèi)脂素和2型糖尿病的關(guān)系，以揭示石斛合劑治療糖尿病的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 實(shí)驗(yàn)動物 健康成年SD雌性大鼠40只，體重210－230 g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，許可證號:SCXK(滬)2007－0005。

1．1．2 藥品和試劑 石斛合劑(石斛、黃芪、丹參、生地黃)購自福建中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂;鏈脲佐菌素(美國Sigma公司)，臨用時用0．1 mol/L檸檬酸鈉－檸檬酸緩沖液(pH4．3)配成0．25%鏈脲佐菌素溶液;血糖試劑盒(上海復(fù)旦大學(xué)張江生物醫(yī)藥股份有限公司);Trizol試劑(美國Invitrogen公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Invitrogen公司);引物(上海英俊生物有限公司);Perfect Real Time(日本Takara公司)。

1．1．3 儀器 ELX800酶標(biāo)儀(Bio-Tek);Stratos冷凍離心機(jī)(Thermo Scientific);DU730蛋白核酸分析儀(Beckman Coulter);Eppendorf5331基因擴(kuò)增儀(Eppendorf基因有限公司);Gel doc xr凝膠電泳成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad);DYY-6C雙穩(wěn)定時電泳儀(北京市六一儀器廠);DYCP-31DN水平電泳槽(北京市六一儀器廠);ULT-1386－5V超低溫冰箱(美國Thermo);Epgradient S實(shí)時熒光定量PCR儀(Eppendorf基因有限公司)。

1．2 方法

1．2．1 動物模型制備 健康成年SD雌性大鼠40只，造模前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常組10只，造模組30只，兩組大鼠自由飲水進(jìn)食。正常組給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，造模組給予高脂高糖飼料(蔗糖10%、豬油10%、膽固醇2．5%、膽酸鈉0．25%、基礎(chǔ)飼料87．75%)喂養(yǎng)。1個月后造模組給予低劑量鏈脲佐菌素，按25 mg/kg體重，一次性腹腔注射，其后自由進(jìn)食基礎(chǔ)飼料72 h。微量血糖儀檢測血糖含量，隨機(jī)血糖≥16．7 mmol/L為造模成功，隨后連續(xù)2周，每周測3次隨機(jī)血糖，≥16．7 mmol/L為穩(wěn)定模型。

1．2．2 動物分組及給藥 正常對照組:清潔級SD大鼠10只，按1 ml/100 g體重給予生理鹽水灌胃;2型糖尿病模型組:穩(wěn)定模型大鼠12只，按1 ml/100 g體重給予生理鹽水灌胃;石斛合劑干預(yù)組:穩(wěn)定模型大鼠12只，按1 ml/100 g體重給予石斛合劑灌胃，相當(dāng)于生藥量12 g/(kg·d)，灌胃6 d，休息1 d，連續(xù)8周。

各組大鼠于末次給藥后，禁食15 h，以20%烏拉坦進(jìn)行腹腔注射，抽取腹主動脈血液并分離血清，于－20℃保存?zhèn)溆?，取脂肪組織液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．3 脂肪組織內(nèi)脂素(Visfatin)mRNA表達(dá)水平檢測 ①總RNA的提取。取300 mg腸系膜脂肪組織，按照試劑盒操作方案提取總RNA，用紫外分光光度計測定OD260/OD280的比值，并計算濃度。②逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。每個樣品取5 μg總RNA為模板，使用qRT-PCR試劑盒(Invitrogen公司)采用Oligo(dT)20引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，所合成的cDNA被保存在－20℃低溫冰箱。③實(shí)時定量PCR。用β-actin作為參考基因，在實(shí)時熒光定量PCR儀上進(jìn)行檢測?；驍U(kuò)增引物按照cDNA序列設(shè)計為:內(nèi)脂素上游引物5'－T CTGGAAATCCGCTCGACAC－ 3'，下游引物5'－AGTAAGTTCCCCTGCCTCAC－3'，擴(kuò)增產(chǎn)物129 bp。β-actin上游引物5'－ATTGTGATGGACTCCGGAGA－3'，下游引物 5'－CTCGTCAGGATCTTCATGA－3'，擴(kuò)增產(chǎn)物136 bp。反應(yīng)條件設(shè)定:95℃5min，95 ℃ 15 s，55－60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共45個循環(huán)。融解曲線分析:溫度60－95℃，每個樣本重復(fù)3次，以相對表達(dá)量(2－ΔΔCt)來表示目的基因mRNA的相對表達(dá)水平。ΔΔCt=測試樣品ΔCt－對照樣品ΔCt;測試樣品ΔCt=測試樣品目的基因Ct值－測試樣品內(nèi)參Ct值;對照樣品ΔCt=對照樣品目的基因Ct值－對照樣品內(nèi)參Ct值。

1．3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

與正常對照組相比，糖尿病模型組血糖、甘油三脂(TG)、總膽固醇(CHOL)均有明顯上升(P＜0．01)，說明造模成功;與糖尿病模型組相比，石斛合劑干預(yù)組血糖、甘油三脂(TG)、總膽固醇(CHOL)均有明顯下降(P ＜0．01，見表 1)，說明石斛合劑對治療糖尿病有療效。

與正常對照組相比，糖尿病模型組內(nèi)脂素(visfatin)的表達(dá)上升(P＜0．01);石斛合劑干預(yù)組與糖尿病模型組相比，內(nèi)脂素(visfatin)的表達(dá)下降(P＜0．01，見表1)，說明內(nèi)脂素(visfatin)可能是石斛合劑治療糖尿病的靶點(diǎn)。

表1 各組血糖和血脂及visfatin mRNA表達(dá)量的比較(±s)Table 1 Comparison of blood glucose，blood lipid and visfatin mRNA level among in three groups(±s)

表1 各組血糖和血脂及visfatin mRNA表達(dá)量的比較(±s)Table 1 Comparison of blood glucose，blood lipid and visfatin mRNA level among in three groups(±s)

與正常對照組比較，*P＜0．01;與糖尿病模型組比較，#P＜0．01

組別 n 血糖(mmol/L) TG(mmol/L) CHOL(mmol/L)visfatin正常對照組10 5．21 ±1．17 0．89 ±0．18 1．57 ±0．17 2．15 ±0．58糖尿病模型組 12 19．78 ±3．45* 1．71 ±0．14* 2．78 ±0．26* 5．98 ±1．87*石斛合劑干預(yù)組 12 15．98 ±4．12# 1．45 ±0．16# 2．03 ±0．16# 3．21 ±0．98#

3 討論

內(nèi)脂素(visfatin)是新近發(fā)現(xiàn)的一種脂肪細(xì)胞因子，主要由內(nèi)臟脂肪組織產(chǎn)生，它可通過與胰島素受體結(jié)合，增加脂肪細(xì)胞和肌細(xì)胞對葡萄糖的攝取，抑制肝糖原的釋放［4］，具有類胰島素樣的降血糖作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者血漿中visfatin水平明顯增高，相關(guān)分析顯示，visfatin水平是2型糖尿病的獨(dú)立相關(guān)因素［5－7］。

傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為，臨床2型糖尿病從早期到晚期主要呈現(xiàn)陰虛熱盛證到氣陰兩虛證，最終陰陽兩虛證的病程進(jìn)展，且血瘀貫穿始終。在此基礎(chǔ)上，我們認(rèn)為2型糖尿病屬虛實(shí)夾雜疾病，且虛實(shí)二者互為因果、惡性循環(huán)，構(gòu)成了2型糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)生和發(fā)展的病理基礎(chǔ)。為此，我們以扶正祛邪為總則，形成了以滋陰清熱、益氣活血、兼以疏肝解郁、清肝泄?jié)岬氖蟿?，我們以高脂高糖加注射鏈脲佐菌素造模?型糖尿病大鼠模型為研究對象，給予石斛合劑組方進(jìn)行治療。本課題研究中我們看到模型組大鼠脂肪組織visfatin mRNA表達(dá)顯著上升，石斛合劑組大鼠脂肪組織visfatin mRNA表達(dá)顯著下降，血糖、血脂水平與模型組比較顯著降低，說明visfatin是石斛合劑治療糖尿病的靶點(diǎn)。

［1］施紅，張學(xué)敏，崔乙，等．糖尿病石斛合劑序貫法的初步臨床觀察［J］．中醫(yī)臨床研究，2013，5(18):1－3．

［2］洪佳祝，劉宏波，高長花，等．石斛合劑序貫方基礎(chǔ)上運(yùn)用溫病理論指導(dǎo)加減治療糖尿?。跩］．中國醫(yī)藥指南，2014，12(15):274－275．

［3］張捷平，鄭曉玲，洪佳祝，等．復(fù)方石斛合劑治療2型糖尿病90例［J］．福建中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2011，21(5):6－8．

［4］Fukuhara A，Matsuda M，Nishizawa M，et al．Visfatin:a protein secreted by visceral fat that mimics the effects of insulin［J］．Science，2005，307(5708):426－430．

［5］Chen MP，Chung FM，Chang DM，et al．Elevated plasma level of visfatin/Pre-B cell colony-enhancing factor in patients with type 2 diabetes melitus［J］．Clin Endocrinol Metab，2006，91(1):259－299．

［6］Dogru T，Sonmez A，Tasci I，et al．Plasma visfatin levels in patients with newly diagnosed and untreated type 2 diabetes mellitus and impaired glucose tolerance［J］．Diabetes Res Clin Pract，2007，76(1):24－29．

［7］Haider DG，Schaller G，Kapiotis S，et al．The release of the adipocytokine visfatin is regulated by glucose and insulin［J］．Diabetologia，2006，49(8):1909－1914．