結(jié)腸癌患者血漿中microRNA-100的檢測(cè)及其與臨床病理特征的關(guān)系

張 銘，李曉利，許君望，黃 蓉，吉亞紅，張娜娜，李 娜(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬紅會(huì)醫(yī)院消化內(nèi)科，西安 70054;西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科;通訊作者，E-mail:zhangminghonghui@6．com)

結(jié)腸癌(colon cancer)是常見的胃腸道惡性腫瘤，早期表現(xiàn)為腹脹、消化不良，而后出現(xiàn)排便習(xí)慣改變，便前腹痛，稍后出現(xiàn)黏液便或黏液膿性血便。結(jié)腸癌的發(fā)病原因尚未清楚，遺傳因素和環(huán)境因素均發(fā)揮了一定作用，流行病學(xué)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究提示結(jié)腸癌的發(fā)病與高脂肪食譜和食物纖維攝入不足密切相關(guān)［1］。微小 RNA(microRNA，miRNA，miR)是一類廣泛存在于真核生物中長度約為18－25個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，miRNA通過與靶基因mRNA的3'端非編碼區(qū)域(3'-untranslated region，3'-UTR)結(jié)合從而抑制靶基因的表達(dá)，研究證實(shí)miRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［2］。由于miRNA長度較短且能較強(qiáng)地抵抗RNA酶的降解，miRNA可以與蛋白質(zhì)結(jié)合并在血液中穩(wěn)定存在［3］。miR-100是屬于miR-99家族成員之一，越來越多研究證實(shí)miR-100在多種腫瘤中表達(dá)異常，在不同類型的腫瘤中，miR-100可以發(fā)揮致癌基因作用或抑癌基因作用［4－12］。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌組織或細(xì)胞株中miR-100表達(dá)下調(diào)，且與腫瘤的進(jìn)展及預(yù)后有關(guān)［13，14］。為了進(jìn)一步研究miR-100在結(jié)腸癌中的作用，本研究采用莖環(huán)RT-PCR法檢測(cè)結(jié)腸癌患者血漿中miR-100的表達(dá)水平，分析miR-100表達(dá)水平與患者性別、年齡、腫瘤大小、淋巴轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及臨床分期等病理參數(shù)之間的關(guān)系，以便為研究結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制、早期診斷、判斷預(yù)后及治療提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1．1 研究對(duì)象

本研究選取2014－01～2014－09在我院消化內(nèi)科及普外科住院確診的結(jié)腸癌患者40例，其中男性26例，女性14例，年齡44－78歲，平均年齡(62．97±17．13)歲，均經(jīng)過術(shù)后病理結(jié)果證實(shí)。根據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)/國際抗癌聯(lián)盟(UICC)結(jié)直腸癌TNM分期系統(tǒng)(2010年第七版)進(jìn)行TNM分期。40例同期健康體檢者作為正常對(duì)照組，其中男性25例，女性15例，年齡44－73歲，平均年齡(59．14±14．75)歲。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1．2 方法

1．2．1 主要試劑與儀器 RNA提取試劑 mirVanaTMmiRNA分離試劑盒為美國Ambion公司產(chǎn)品，miScript Reverse Transcription試劑盒為美國Ambion公司產(chǎn)品，SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ?yàn)榈聡鳴iagen公司產(chǎn)品，紫外分光光度計(jì)購自美國Thermo Scientific公司，冷凍高速離心機(jī)購自德國Eppendorf公司，定量PCR擴(kuò)增儀購自美國Bio-Rad公司。

1．2．2 方法 所有病例均在進(jìn)行手術(shù)、放療或化療等抗腫瘤治療前進(jìn)行采樣，無菌抽取靜脈血5．0 ml，置于EDTA抗凝管中，室溫下2 500 r/min離心10 min后收集上層血漿置于無RNA酶的EP管中，4℃12 000 r/min再次離心10 min后收集上清至新的無RNA酶的EP管，－80℃保存待用。采用mir-VanaTMmiRNA分離試劑盒提取血漿總RNA，操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。使用紫外分光光度儀檢測(cè)RNA濃度及純度，計(jì)算 OD260/OD280比值(比值在1．8－2．1的 RNA 符合要求)，－80 ℃保存。根據(jù)文獻(xiàn)［15］合成miR-100及內(nèi)參照U6莖環(huán)RT引物及PCR引物，miR-100 RT引物:GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCACAAGT，PCR上游引物:GCTCTGAACCCGTAGARCCGAAC，下游引物:GTGCAGGGTCCGAGGT;U6 RT引物:AACGXTTCACGAATTTGCGT，PCR上游引物:CTCGCTTCGGCAGCACA，下 游 引 物:AACGXTTCACGAATTTGCGT。使用 miScript Reverse Transcription試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，20 μl反應(yīng)體系包括:2．0 μl莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物、10．0 μl逆轉(zhuǎn)錄緩沖液(2 ×)、3．0 μl總 RNA、1．0 μl逆轉(zhuǎn)錄酶及4．0 μl水，反應(yīng)條件為:37℃ 60 min，95℃ 5 min，合成的cDNA在－20℃保存。采用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ進(jìn)行定量 PCR 擴(kuò)增，20 μl PCR 擴(kuò)增體系包括:10 μl SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(2 ×)、上下游引物各 1．0 μl、4．0 μl cDNA 模板、4．0 μl 水;擴(kuò)增程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性3 min，95℃ 5 s、61℃ 30 s共35個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣本做三個(gè)復(fù)孔。擴(kuò)增結(jié)束后得到循環(huán)閾值(Ct值)，miR-100 的表達(dá)水平采用 2－ΔΔCt進(jìn)行分析，ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)組ΔCt(目的基因Ct－內(nèi)參基因Ct)－對(duì)照組ΔCt(目的基因Ct－內(nèi)參基因Ct)。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16．0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料采用±s表示，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，miR-100水平在不同臨床病理參數(shù)之間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0．05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 結(jié)腸癌患者與正常對(duì)照組血漿中miR-100水平的比較

莖環(huán)定量RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組血漿中 miR-100水平(0．65±0．21)相比，結(jié)腸癌患者血漿中miR-100水平(0．39±0．14)明顯降低，二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6．515，P ＜0．01)。

2．2 結(jié)腸癌患者血漿中miR-100水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

為了進(jìn)一步研究miR-100在結(jié)腸癌發(fā)病中的作用，我們統(tǒng)計(jì)分析了結(jié)腸癌患者血漿中miR-100水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌患者血漿中miR-100水平在不同性別、年齡及不同腫瘤大小間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)，而有淋巴轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌患者血漿中miR-100水平明顯低于無淋巴轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者，二者差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)，Ⅲ、Ⅳ期結(jié)腸癌患者血漿中miR-100水平明顯低于Ⅰ、Ⅱ期患者，二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05，見表1)。

表1 結(jié)腸癌患者血漿中miR-100水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系Table 1 The relationships between the plasma levels of miR-100 and clinicopathological characteristics in patients with colon cancer

3 討論

miRNA是存在于真核細(xì)胞當(dāng)中具有進(jìn)化保守性的一族非編碼小片段 RNA，長度約為300－1 000的pri-miRNA經(jīng)過一次加工后，成為長度大約為70－90個(gè)堿基的pre-miRNA，pre-miRNA再經(jīng)過Dicer酶酶切后，成為長約18－25個(gè)核苷酸的成熟miRNA，miRNA在多種生理和病理過程均發(fā)揮重要的調(diào)控作用，大量研究證實(shí)多種miRNA在腫瘤中表達(dá)異常，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程密切相關(guān)。miR-100是由Mourelatos等2002年發(fā)現(xiàn)的一種miRNA［16］，人 miR-100 基因定位于 11q24．1，大小為22個(gè)核苷酸，基因序列為 AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG。越來越多研究證實(shí)，miR-100在不同類型的腫瘤可能發(fā)揮不同的作用，miR-100可以發(fā)揮抑癌基因作用，也可以發(fā)揮促癌基因的作用［4－14］。研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌、膀胱癌、肺癌、急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphocytic leukemia，ALL)、肝癌、乳腺癌、卵巢癌等腫瘤組織或腫瘤細(xì)胞株中miR-100 低表達(dá)［4－9］，抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展，而在前列腺癌、急性骨髓性白血病(acute myeloid leukemia，AML)、胃癌中 miR-100 表達(dá)水平增高［10－12］，可以促進(jìn)腫瘤的生長。

結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)最為常見的惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率及死亡率呈逐年升高的趨勢(shì)。盡管手術(shù)、化療及放療等技術(shù)不斷進(jìn)步，但結(jié)腸癌患者5年生存率沒有明顯改善。利用miRNA芯片或定量PCR方法篩選miRNA在結(jié)腸癌組織和癌旁組織表達(dá)差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)100多種miRNA在結(jié)腸癌腫瘤組織、細(xì)胞株和正常組織中表達(dá)異常［17，18］，同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn) miR-20、miR-21、miR-31、miR-144、miR-155表達(dá)水平與腫瘤浸潤、腫瘤分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等臨床病理特征有關(guān)［19－21］。國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)miR-17-3p和miR-92在結(jié)腸癌患者血漿中水平升高，腫瘤切除后水平明顯下降［22，23］。目前國內(nèi)外有關(guān) miR-100與結(jié)腸癌關(guān)系的研究較少，國內(nèi)學(xué)者利用MiRNAMap-2．0發(fā)現(xiàn)miR-100在結(jié)直腸癌中低表達(dá)，并利用定量PCR驗(yàn)證了這一結(jié)果，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-100不僅可以調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW620的生長和凋亡，而且可以抑制SW620細(xì)胞的侵襲，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)RAP1B是miR-100的靶基因［13］。Chen等［14］研究也發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比，結(jié)直腸癌組織中miR-100水平明顯降低，且miR-100表達(dá)水平與腫瘤大小、淋巴轉(zhuǎn)移、TNM分期及預(yù)后密切相關(guān)。由于miRNA可以穩(wěn)定存在于血液中，血液樣本便于取得，檢測(cè)腫瘤患者血液中miRNA的水平成為研究的熱點(diǎn)之一，國內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者血清中miR-100水平明顯降低［24］。為了進(jìn)一步研究miR-100在結(jié)腸癌中的作用，我們利用莖環(huán)RT-PCR方法檢測(cè)了結(jié)腸癌患者血漿中miR-100的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌患者血漿中miR-100水平明顯低于正常對(duì)照組(P＜0．01)，這與miR-100在結(jié)腸癌組織中的研究結(jié)果基本一致［13，14］。我們的研究還發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌患者血漿中miR-100水平在不同性別、年齡及腫瘤大小之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)，而有淋巴轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌患者血漿中miR-100水平明顯低于無淋巴轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者，二者差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)，Ⅲ、Ⅳ期結(jié)腸癌患者血漿中miR-100水平明顯低于Ⅰ、Ⅱ期患者，二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)，這與Chen等在結(jié)腸癌組織中的研究結(jié)果一致［13］，但我們的研究卻沒有發(fā)現(xiàn)miR-100水平高低與腫瘤大小相關(guān)，這可能與病例的選擇等因素有關(guān)。同時(shí)我們的研究病例數(shù)量偏少且缺乏隨訪，有待于擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。

綜上所述，miR-100在結(jié)腸癌患者血漿中水平降低，且與腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及臨床分期明顯相關(guān)，綜合國內(nèi)外的研究結(jié)果提示miR-100參與了結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程。但miR-100在結(jié)腸癌中的具體作用及調(diào)控機(jī)制尚不清楚，相信隨著研究的深入，miR-100可能為結(jié)腸癌的早期診斷和治療提供新的策略。

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