姜黃素通過阻滯MAPK/ERK通路抑制人子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移

陳 茜，陳麗娟，黨媛媛，李 牧，吳曉玲(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，西安 710004;通訊作者，E-mail:wxlxjtu07@sina．com)

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，僅次于卵巢癌和宮頸癌，約占20%－30%，發(fā)病率近年來呈上升趨勢。姜黃素(curcumin)是姜黃的主要有效成分，因其具有抗腫瘤的作用而日益引起人們的關(guān)注［1］。近年來大量研究表明，姜黃素對肺癌、膀胱癌、宮頸癌、卵巢癌及直腸癌等均有抗腫瘤作用［2－4］。前期研究表明，姜黃素有抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞侵襲的作用，但其作用及機(jī)制尚不明確，國內(nèi)外也鮮有報(bào)道。腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程是多步驟、多基因參與的過程，涉及多條細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路的異常。MAPK信號通路是真核細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞外信號到細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)的重要信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，受刺激后發(fā)生磷酸化而活化，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分化、分裂、死亡以及細(xì)胞間功能同步化過程［5］，包括ERK細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、p38分裂原激活蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinase，p38MAPK)、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶5(extracellular regulated kinase 5，ERK5)。其中 ERK通路是MAPK經(jīng)典的通路，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程而倍受關(guān)注。EMT是腫瘤侵襲和遷移過程中的重要環(huán)節(jié)，涉及一系列的上皮標(biāo)記［上皮鈣黏蛋白E-cadhrein(CDH1)］，纖維粘連蛋白Fibronectin-1(FN 1))，間質(zhì)相關(guān)分子［神經(jīng)鈣黏蛋白N-cadhrein(CDH2)，波紋蛋白 Vimentin］及一些重要的轉(zhuǎn)錄因子［Twist、Snail、鋅指E－盒結(jié)合同源異形盒－1/2(Zinc finger E-box binding homeobox 1/2，Zeb 1/2)］表達(dá)改變。因此，本研究將探討姜黃素在抑制子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過程中對ERK/MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用，并分析該過程是否影響EMT發(fā)生，為臨床子宮內(nèi)膜癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 細(xì)胞株及主要試劑

人子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、姜黃素及 ERK抑制劑(U0126)購自美國Sigma公司，LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自Invitrogen公司，人工重構(gòu)基底膜膠(Matrigel)購自美國BD公司，Transwell小室購自美國Corning公司，TaKaRa BCA蛋白定量試劑盒購自大連寶生物公司，real-time PCR引物由TAKARA公司合成?？笶RK1/2、p-ERK1/2、抗體購于美國Cell signal公司，抗 E-cadhrein、Vimentin、Twist、Snail和β-actin抗體購于Santa Cruz。

1．2 細(xì)胞培養(yǎng)

人子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B細(xì)胞株購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞中心。細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，青霉素濃度100 U/ml、鏈霉素濃度100 U/ml，靜置于37℃、5%CO2的飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞定期換液，融合率約到70%－80%時進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前1 d洗滌細(xì)胞換液。

1．3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及分組

1．3．1 姜黃素對ERK1/2的影響 為研究姜黃素對HEC-1-B細(xì)胞中ERK1/2的影響，我們將各處理組分為兩組:不加藥組(0 μmol/L)設(shè)為空白對照組;不同濃度(10，20和 30 μmol/L)姜黃素預(yù)處理組為實(shí)驗(yàn)組即curcumin組。

1．3．2 姜黃素對ERK通路的作用 為研究姜黃素對ERK通路的特異性作用，我們構(gòu)建質(zhì)粒pcDNA 3．1(+)-MEK1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至HEC-1B細(xì)胞，將未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞設(shè)為空白對照組;轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3．1組為陰性對照組;轉(zhuǎn)染真核表達(dá)載體pcDNA3．1(+)-MEK1組設(shè)為實(shí)驗(yàn)組。在此基礎(chǔ)上，依據(jù)是否加藥，分別設(shè)為 pcDNA3．1 不加藥組(0 μmol/L)，pcDNA3．1 加藥組(20 μmol/L curcumin);pcDNA3．1(+)-MEK1 不加藥組(0 μmol/L)及 pcDNA3．1 加藥組(20 μmol/L curcumin)。

1．3．3 姜黃素對腫瘤細(xì)胞侵襲的作用 為了研究姜黃素對腫瘤細(xì)胞侵襲的抑制作用是否與ERK通路的抑制有關(guān)，我們將各組分為:細(xì)胞未加藥組為對照組(control組);單獨(dú)使用20 μmol/L姜黃素組為curcumin組;單獨(dú)使用10 μmol/L U0126處理組為U0126組;姜黃素及U0126聯(lián)合使用為curcumin+U0126組。

1．4 Western blot實(shí)驗(yàn)

為研究curcumin對各蛋白(ERK1/2、p-ERK1/2、E-cadhrein、Vimentin、Twist和 Snail)的影響，用Western blot法檢測這些指標(biāo)的表達(dá)。收集1．3中所述的各組細(xì)胞，PBS洗2次，離心，2×106個細(xì)胞重懸于 200 μl裂解緩沖液(1 mmol/L EDTA，40 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L KCl，1%Triton X-100，100 mmol/L NaVO3，1 mmol/L PMSF，pH 7．5)中裂解、離心，收集上清，采用BCA法測定蛋白濃度。各組蛋白樣品各取80 μg經(jīng)10%或12%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。該P(yáng)VDF膜經(jīng)37℃、5%脫脂牛奶封閉1 h后，于搖床上用TBST緩沖液漂洗10 min×3次，然后用特異性抗體4℃冰箱孵育過夜。次日取出，室溫條件下用相應(yīng)的二抗再次孵育1 h。暗室中加入ECL發(fā)光，顯色成像，并用Image J軟件對電泳條帶進(jìn)行灰度分析，每個實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次，計(jì)算各蛋白的相對表達(dá)率=(目的條帶的灰度值/相對應(yīng)的內(nèi)參條帶的灰度值)×100%。

1．5 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染

用KOD?DNA聚合酶克隆MEK1的全長PCR產(chǎn)物，以制備全長pcDNA3．1MEK1載體。采用DNA測序法測定質(zhì)粒序列。在轉(zhuǎn)染前24 h將細(xì)胞接種于6孔板，密度為每孔2×105個細(xì)胞。嚴(yán)格按照Invitrogen公司LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明，將pcDNA3．1(+)-MEK1表達(dá)載體(實(shí)驗(yàn)組)和pcDNA3．1(+)空載體(陰性對照組)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至HEC-1-B細(xì)胞中，通過添加G418篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)MEK1的陽性克隆。每組至少為3個陽性克隆，共試驗(yàn)三次。

1．6 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)

通過體外Transwell小室實(shí)驗(yàn)來評估HEC-1-B細(xì)胞的侵襲能力。首先，在超凈工作臺中用Matrigel覆蓋Transwell小室的上室，鋪膠時盡可能保證膠面平整，風(fēng)干待用。取對數(shù)生長期的細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基調(diào)整濃度為1×106個細(xì)胞/ml，每個小室上室中加入 200 μl的細(xì)胞懸液，按上述 1．3．2 和 1．3．3試驗(yàn)分組進(jìn)行加藥，下室中加入400 μl含20%胎牛血清的DMEM條件培養(yǎng)基，設(shè)空白對照組，即不做任何干預(yù)。每組平行3個復(fù)孔，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對小室底端的細(xì)胞用95%乙醇固定10 min后、結(jié)晶紫染色15 min，在倒置顯微鏡下(×200)觀察并計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞，每膜隨機(jī)計(jì)算5個視野，取均值。

1．7 real-time PCR

收集上述1．3中1．3．3實(shí)驗(yàn)分組的細(xì)胞，TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，按照TaKaRa公司PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real-time)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA。然后，以cDNA為模板，利用表1中所合成的引物進(jìn)行real-time PCR，檢測相應(yīng)基因的表達(dá)情況，采用Bio-Rad IQ5軟件進(jìn)行結(jié)果分析。各基因mRNA的相對達(dá)量為2－ΔCt，不同組別各基因mRNA表達(dá)量之間的倍數(shù)關(guān)系計(jì)算公式為:fold changes=實(shí)驗(yàn)組的平均 2－ΔCt值/對照組的平均 2－ΔCt值［6］。

1．8 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2．1 姜黃素抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中的p-ERK1/2的表達(dá)

我們首先將子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B細(xì)胞用不同濃度(10，20和30 μmol/L)姜黃素處理24 h后，采用Westernblot檢測姜黃素對HEC-1-B細(xì)胞中ERK1/2的影響。Western blot結(jié)果表明，隨著姜黃素濃度的增加(0－30 μmol/L)，HEC-1-B 細(xì)胞中的 ERK1/2的磷酸化水平顯著降低(見圖1A)。各處理組(10，20和30 μmol/L)的表達(dá)率分別為(68±21)%，(37±13)%，(19±2)%;與空白對照組相比，除了10 μmol/L姜黃素預(yù)處理組ERK磷酸化程度無顯著性差異外，20 μmol/L和30 μmol/L姜黃素處理組均可顯著抑制細(xì)胞p-ERK1/2表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01，見圖1B)。為了排除細(xì)胞毒性對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，我們選擇20 μmol/L姜黃素進(jìn)行后續(xù)研究。以上結(jié)果提示，姜黃素抑制HEC-1-B細(xì)胞中p-ERK1/2的表達(dá)，且呈濃度依賴性。

2．2 MEK1的異位表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)姜黃素對HEC-1-B細(xì)胞侵襲的抑制作用

為了進(jìn)一步證實(shí)姜黃素對ERK通路的特異性作用，我們構(gòu)建質(zhì)粒pcDNA3．1(+)-MEK1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至HEC-1B 細(xì)胞。Western blot結(jié)果顯示，pcDNA3．1(+)-MEK1轉(zhuǎn)染后，HEC-1B細(xì)胞中p-MEK1和p-ERK1/2的表達(dá)增加，說明MEK/ERK通路的活性增加(見圖2A)。同時我們發(fā)現(xiàn)，用20 μmol/L姜黃素處理pcDNA3．1(+)和 pcDNA3．1(+)-MEK1 組24 h后，與 pcDNA3．1(+)空載體組相比較，MEK1過表達(dá)后可以削弱姜黃素對腫瘤細(xì)胞侵襲力的抑制作用，pcDNA3．1(+)組和pcDNA3．1(+)-MEK1組的侵襲能力抑制率分別為(78．4 ±3．5)%和(64．92 ±5．1)%，二者間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05，見圖2B和圖3)。

圖2 MEK1的異位表達(dá)對姜黃素引起的HEC-1-B細(xì)胞侵襲作用的影響Figure 2 Effect of ectopic MEK1 expression on the invasion inhibition caused by curcumin in HEC-1-B cells

圖3 Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)證實(shí)過表達(dá)MEK1減弱了姜黃素引起的HEC-1-B細(xì)胞侵襲抑制作用Figure 3 The invasion assay in vitro demonstrated MEK1 overexpression significantly relieved the inhibitory effect of curcumin on HEC-1-B cell invasion

2．3 姜黃素通過阻滯ERK信號通路抑制HEC-1-B細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移

為了進(jìn)一步研究姜黃素對腫瘤細(xì)胞侵襲的抑制作用是否與ERK通路的抑制有關(guān)，我們引入ERK抑制劑(U0126，10 μmol/L)，將其預(yù)處理 HEC-1B細(xì)胞30 min后，分別在有或無姜黃素(20 μmol/L)的培養(yǎng)基中孵育24 h后進(jìn)行體外侵襲實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，單獨(dú)使用 U0126或姜黃素均可顯著降低HEC-1-B細(xì)胞侵襲力(P ＜0．01或 P ＜0．05，見圖4A)。與單獨(dú)使用姜黃素或U0126相比，兩者聯(lián)用后侵襲抑制作用增強(qiáng)(P＜0．05，見圖4B)，說明ERK抑制劑U0126可明顯增強(qiáng)姜黃素的侵襲抑制作用。

2．4 姜黃素對子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B細(xì)胞EMT的影響

圖4 姜黃素通過阻滯ERK信號通路抑制HEC-1-B細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移Figure 4 Curcumin inhibited the invasion of HEC-1-B through blocking the ERK pathway

為了研究姜黃素是否影響EMT發(fā)生來發(fā)揮其侵襲抑制作用，我們采用Western blot和real-time PCR方法檢測EMT相關(guān)分子的表達(dá)。按Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，單獨(dú)使用姜黃素(20 μmol/L)，或 UO126(10 μmol/L)處理 HEC-1-B 細(xì)胞后，上皮標(biāo)記E-cadhrein表達(dá)上調(diào)，而間質(zhì)標(biāo)記Vimentin及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)因子 Twist、Snail、表達(dá)均有所下調(diào)(見圖5A)。兩者聯(lián)合使用可增強(qiáng)分別單獨(dú)用藥所產(chǎn)生的效應(yīng)。我們進(jìn)一步采用realtime PCR檢測姜黃素對細(xì)胞中EMT相關(guān)基因mRNA水平的變化倍數(shù)。姜黃素組與不加藥組相比，上皮標(biāo)記CDH1、FN1的相對表達(dá)量分別平均增加了約2．5 倍、1．5 倍，而間質(zhì)標(biāo)記 CDH2、Vimentin 及各轉(zhuǎn)錄因子Twist、Snail的表達(dá)量則均有所下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05，見圖5B)，這些結(jié)果說明姜黃素(20 μmol/L)明顯抑制EMT發(fā)生。

圖5 姜黃素對子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B細(xì)胞EMT的影響Figure 5 Effects of curcumin on the EMT process of endometrial carcinoma HEC-1-B cells

3 討論

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路是介導(dǎo)細(xì)胞外刺激到細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)著細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等，參與細(xì)胞的生長、發(fā)育等過程的調(diào)控，在惡性腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、浸潤等方面發(fā)揮重要作用［5］。大量研究表明，該通路在腫瘤進(jìn)展和抗腫瘤治療過程中發(fā)揮著重要作用［5，7］。目前已發(fā)現(xiàn)4條MAPK信號通路，其中ERK，即Ras-Raf-MEK-ERK途徑在信號傳遞過程中起重要作用，同時也是與人類癌癥關(guān)系最為密切的途徑［8，9］。p-ERK是ERK的活化形式，只有磷酸化的ERK(p-ERK)才具有活性。ERK通過磷酸化反應(yīng)可以促進(jìn)多種癌基因相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，并破壞細(xì)胞外基質(zhì)、促進(jìn)腫瘤血管的生成，進(jìn)而利于腫瘤細(xì)胞運(yùn)動而發(fā)生轉(zhuǎn)移［10］。在很多腫瘤中，ERK信號通路通常是被過度激活的［11］。研究證實(shí)，ERK信號通路在調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖、存活及侵襲力中發(fā)揮重要作用［12，13］。姜黃素可以抑制 ERK信號通路的活性［14］。Shin等發(fā)現(xiàn)姜黃素可能通過對ERK信號通路的調(diào)節(jié)來抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的侵襲［15］。本研究證實(shí)，姜黃素可以抑制ERK信號通路的活性，且與U0126聯(lián)合應(yīng)用可增強(qiáng)對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞侵襲的抑制作用，然而其具體的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

MEK1基因位于人第15號染色體上，其編碼序列長度為1 182 bp，該基因編碼的蛋白屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，具有絲裂原激活蛋白激酶的活性。屬于ERKs的激酶有MEK1和MEK2，MEK1是導(dǎo)致ERK磷酸化的主要激酶。多種激酶作用于MEK時，活化的MEK通過其N端區(qū)域與ERKs直接連接，催化ERK的亞功能區(qū)的Tyr/Thr殘基雙特異性磷酸化，從而激活ERK。同時，MEKs還可能是ERK在胞質(zhì)中的錨定器，當(dāng)信號通路無活性時，它就將ERK固定在胞質(zhì)中，一旦有信號刺激ERKs磷酸化，它就激活ERKs并將其轉(zhuǎn)移至胞核或其他活化位點(diǎn)，再進(jìn)一步磷酸化下游底物。MEK2的作用只是降低ERK1/2對MEK1的反饋性抑制?；诖?，我們將MEK1作為激活ERK信號通路的切入點(diǎn)。如圖2所示，我們構(gòu)建了pcDNA3．1(+)-MEK1過表達(dá)載體，將其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至HEC-1-B細(xì)胞中，采用Western blot鑒定并篩選出穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)外源性MEK1過表達(dá)后，顯著增加MEK/ERK信號通路的活性。進(jìn)一步的侵襲實(shí)驗(yàn)證實(shí)，MEK1的異位表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)姜黃素對細(xì)胞侵襲的抑制作用，再次證實(shí)了姜黃素對HEC-1-B細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移抑制作用是通過抑制ERK信號通路實(shí)現(xiàn)的。

EMT是腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的過程，指上皮細(xì)胞在形態(tài)上發(fā)生向成纖維細(xì)胞或間充質(zhì)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變并獲得遷移的能力，在胚胎發(fā)育、組織發(fā)生中起重要作用，并存在于多種慢性疾病的發(fā)病過程及腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移過程中，受許多轉(zhuǎn)錄因子(Snail，Twist，Zeb1 等)、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(NF-κB、MAPK、PI3K/AKT等)及微環(huán)境各種病理、生理性刺激的調(diào)節(jié)［16，17］。細(xì)胞經(jīng)歷EMT功能改變的過程是:與相鄰的細(xì)胞分離;遷移到鄰近的組織。其主要分子特征為:上皮標(biāo)記物(E-cadhrein、FN 1)表達(dá)的下調(diào)和間質(zhì)標(biāo)記物(N-cadhrein、vimentin)表達(dá)的上調(diào)［18］。目前已發(fā)現(xiàn)EMT存在于多種上皮來源的腫瘤中，如卵巢癌、乳腺癌、口腔癌、食管癌、鼻咽癌、直結(jié)腸癌等，EMT與腫瘤細(xì)胞的原位浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系［19］。Huang等［20］研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可以抑制體外培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞的遷移性和侵襲力，降低波形蛋白表達(dá)和增加E-cadherin表達(dá)，其分子機(jī)制可能與EMT進(jìn)程受破壞相關(guān)。在本研究中，單獨(dú)使用姜黃素可抑制ERK1/2，下調(diào)其下游的EMT誘導(dǎo)基因的表達(dá)，進(jìn)而阻礙腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，從而抑制子宮內(nèi)膜癌的侵襲轉(zhuǎn)移，這與單獨(dú)使用ERK抑制劑U0126得到相似的結(jié)果，且兩者聯(lián)合使用可增強(qiáng)單獨(dú)使用的效應(yīng)。此外，在本研究中，為了進(jìn)一步證實(shí)我們研究結(jié)果的可靠性，我們同時采用了Western blot及real-time PCR兩種方法證實(shí)了姜黃素作用后EMT各相關(guān)分子的蛋白及mRNA水平均發(fā)生了改變。以上結(jié)果提示ERK1/2通路在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生EMT的過程中起到了關(guān)鍵的調(diào)控作用?？傊覀兊难芯拷Y(jié)果表明，姜黃素通過抑制上游ERK1/2信號通路來影響EMT過程發(fā)生，進(jìn)而抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，希望這一發(fā)現(xiàn)可以為臨床惡性腫瘤包括子宮內(nèi)膜癌的靶向治療提供一個新的途徑。

［1］Lin JK，Pan MH，Lin-Shiau SY．Recent studies on the biofunctions and biotransformations of curcumin［J］．Biofactors，2000，13(1－4):153－158．

［2］王清，賈雪梅，王淑玉，等．姜黃素對人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤生長的影響［J］．江蘇醫(yī)藥，2005，31(3):217－218．

［3］徐昉，牟曉玲，趙敬．姜黃素對人宮頸癌細(xì)胞Caski侵襲轉(zhuǎn)移的影響［J］．中山大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)科學(xué)版，2009，30(1):92－95．

［4］Anand P，Sundaram C，Jhurani S，et al．Curcumin and cancer:an“old-age”disease with an“age-old”solution［J］．Cancer Lett，2008，267(1):133－164．

［5］Kohno M，Pouyssegur J．Targeting the ERK signaling pathway in cancer therapy［J］．Ann Med，2006，38(3):200－211．

［6］Livak KJ，Schmittgen TD．Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(－Delta Delta C(T))Method［J］．Methods，2001，25(4):402－ 408．

［7］Hilger RA，Scheulen ME，Strumberg D．The Ras-Raf-MEK-ERK pathway in the treatment of cancer［J］．Onkologie，2002，25(6):511－518．

［8］韋淑琴，隋麗華，魏麗惠．絲裂原活化蛋白激酶通路在婦科腫瘤中的研究進(jìn)展［J］．國外醫(yī)學(xué)婦產(chǎn)科學(xué)分冊，2004，31(1):51－53．

［9］鮑偉，蔡斌，楊懿霞，等．子宮內(nèi)膜癌中ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與雌、孕激素受體的相關(guān)性［J］．上海交通大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2009，29(1):5－8．

［10］孔衛(wèi)平，孫冬霞，時志民，等．p-ERK-1及相關(guān)因子在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及意義［J］．中國熱帶醫(yī)學(xué)，2013，13(3):270－272．

［11］Hoshino R，Chatani Y，Yamori T，et al．Constitutive activation of the 41－/43－kDa mitogen-activated protein kinase signaling pathway in human tumors［J］．Oncogene，1999，18:813－822．

［12］Tong JS，Zhang QH，Wang ZB，et al．ER-alpha36，a novel variant of ER-alpha，mediates estrogen-stimulated proliferation of endometrial carcinoma cells via the PKCdelta/ERK pathway［J］．PLoS One，2010，5:e15408．

［13］Wang Y，Zhu Y，Zhang L，et al．Insulin promotes proliferation，survival，and invasion in endometrial carcinoma by activating the MEK/ERK pathway［J］．Cancer Lett，2012，322:223－231．

［14］Guo Y，Shan Q，Gong Y，et al．Curcumin induces apoptosis via simultaneously targeting AKT/mTOR and RAF/MEK/ERK survival signaling pathways in human leukemia THP-1 cells［J］．Pharmazie，2014，69:229－233．

［15］Shin HK，Kim J，Lee EJ，et al．Inhibitory effect of curcumin on motility of human oral squamous carcinoma YD－10B cells via suppression of ERK and NF-kappaB activations［J］．Phytother Res，2010，24:577－582．

［16］Ishikawa T，Shimizu T，Ueki A，et al．Twist2 functions as a tumor suppressor in murine osteosarcoma cells［J］．Cancer Sci，2013，104(7):880－888．

［17］Jing Y，Han Z，Zhang S，et al．Epithelial-mesenchymal transition in tumor microenvironment［J］．Cell Biosci，2011，29(1):1－7．

［18］Guarino M．EMT and tumour invasion［J］．Int J Biochem Cell Biol，2007，39(12):2153－2160．

［19］Thiery JP．Epithelial-mesenchymal transitions in tumour progression［J］．Nat Rev Cancer，2002，2(6):442－454．

［20］Huang T，Chen Z，F(xiàn)ang L．Curcumin inhibits LPS-induced EMT through downregulation of NF-κB-Snail signaling in breast cancer cells［J］．Oncol Rep，2013，29(1):117－124．