姜黃素對結腸癌細胞HT-29中NDRG2基因表達的影響

姜黃素對結腸癌細胞HT-29中NDRG2基因表達的影響

李照偉柳長明1何其勇1趙東慧2姜吉洵2

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江佳木斯154002)

摘要〔〕目的探討姜黃素對HT-29結腸癌細胞株中N-myc F下游調節(jié)基因(NDRG)2表達的影響及姜黃素不同濃度處理下NDRG2基因表達情況。方法應用不同濃度的姜黃素干預體外培養(yǎng)的HT-29細胞48 h后，提取總RNA，并運用RT-PCR技術檢測姜黃素對HT-29細胞中NDRG2基因表達的影響。利用RIPA細胞裂解液提取細胞總蛋白，運用Western印跡技術，檢測姜黃素對HT-29細胞中NDRG2蛋白質表達的影響。結果姜黃素不但能夠在mRNA水平促進HT-29細胞中NDRG2基因的表達，且能夠促進NDRG2蛋白質的表達，且均具有統(tǒng)計學意義。但有效濃度范圍在20～100 μmol/L，且80 μmol/L效果最佳，表明姜黃素在一定濃度范圍內對NDRG2基因上調 (P<0.05)，RG2基因，并能有效抑制腫瘤細胞。結論姜黃素能夠促進結腸癌細胞株HT-29細胞中NDRG2基因和蛋白的表達，且具有劑量依賴性，最佳濃度為80 μmol/L。

關鍵詞〔〕結腸癌；HT-29；NDRG2基因；姜黃素

中圖分類號〔〕R73〔

通訊作者：柳長明(1969-)，男，博士，副主任醫(yī)師，主要從事腸道腫瘤研究。

1佳木斯大學附屬第一醫(yī)院2佳木斯市中心醫(yī)院

第一作者：李照偉(1982-)，男，碩士，主要從事腸道腫瘤研究。

N-myc下游調節(jié)基因(NDRG)家族是近年來發(fā)現的一個新基因家族，主要是由NDRG1、NDRG2、NDRG3和NDRG4組成〔1〕。前期的研究發(fā)現NDRG2的表達量與細胞的分化呈正相關，和增殖能力呈負相關〔2〕。姜黃素是從姜科、天南星科中一些植物的根莖中提取的一種化學成分，可以增強抗腫瘤藥物塞來昔布的藥效〔3〕。本研究主要探討不同濃度梯度姜黃素的干預下結腸癌組織中NDRG2基因的表達。

1材料與方法

1.1材料選用人結腸癌細胞株(HT-29)作為體外模型，由中國科學院上海細胞庫提供；姜黃素粉劑購自成都普非德生物有限公司。

1.2主要儀器微量注射器(10～1 000 μl)EPPENdORF公司產品;圖像采集顯微鏡，BX50，日本OLYMPUS公司；Mini垂直電泳儀，Bio-Rad，昆士蘭生物(Queensland)公司：PCR儀RR014A，日本TAKARA公司。

1.3HT-29細胞的復蘇、培養(yǎng)、傳代、種板姜黃素溶解于二甲基亞砜配制成的100 mmol/L的儲存液，配置終濃度分別為20、40、80、100 μmol/L，滴入6孔培養(yǎng)板中,37℃細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

1.4RT-PCR應用不同濃度的姜黃素干預體外培養(yǎng)的HT-29細胞48 h后，提取總RNA,引物設計、反轉錄得到cDNA做模板，再行RT-PCR檢測NDRG2 mRNA表達水平。

1.5Western印跡利用RIPA細胞裂解液提取細胞總蛋白，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠分離蛋白，再通過電濕轉法將分離的蛋白轉至聚氟偏乙烯(PVDF)膜，利用NDRG2蛋白抗體檢測姜黃素對HT-29細胞中NDRG2蛋白質表達的影響。

1.6統(tǒng)計學方法采用SPSS19.0 軟件，計數資料組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法。

2結果

2.1姜黃素促進HT-29細胞中NDRG2基因mRNA表達姜黃素對HT-29細胞中NDRG2基因表達有促進作用，且NDRG2 mRNA表達量的增加與姜黃素濃度呈劑量依賴性關系，NDRG2 mRNA表達量隨姜黃素濃度的增加而上調；且80 μmol/L濃度時，NDRG2增加量最明顯；當姜黃素濃度繼續(xù)增加時，對NDRG2 mRNA的表達促進作用反而有所減弱。60、80 μmol/L姜黃素組與 0、20 μmol/L姜黃素處理組相比，NDRG2基因的表達顯著增加(P<0.01)，但當姜黃素濃度增加到100 μmol/L時， NDRG2 mRNA的表達并沒有隨濃度增加而繼續(xù)增加，反而有所下降，但與陰性對照組相比仍差異顯著(P<0.05)。見圖1。

與0 μmol/L組比較：1)P<0.05，2)P<0.01，下圖同 圖1　姜黃素處理48 h后NDGR2 mRNA表達水平變化

圖2　姜黃素處理48 h后HT-29結腸癌細胞中 NDGR2蛋白質表達的變化

2.2姜黃素促進HT-29細胞中NDRG2蛋白質的表達圖2可見，DRG2蛋白表達量隨姜黃素濃度的增加而上調，且當姜黃素濃度為60或80 μmol/L時，NDRG2蛋白表達量增加最明顯，當姜黃素濃度繼續(xù)增加時，對NDRG2蛋白表達的促進作用反而有所減弱(圖2A)。當用20、40 μmol/L姜黃素處理細胞時，與陰性對照組相比，NDRG2蛋白的增加較顯著；而用60、80 μmol/L姜黃素處理HT-29細胞時， 與陰性對照組相比，NDRG2蛋白的表達增加更明顯(P<0.01)，但當姜黃素濃度增加到100 μmol/L時， NDRG2蛋白表達量并沒有隨濃度增加而繼續(xù)增加，反而有所下降，但與陰性對照組相比差異仍比較顯著(P<0.05)。

3討論

癌基因的激活與抑癌基因的失活參與癌的發(fā)生、發(fā)展，針對其二者的治療也越來越多。 在目前所有的腫瘤基因治療計劃中,免疫基因治療占40%。也有用藥物敏感基因即自殺基因治療,還有腫瘤抑制基因治療,以及用多藥耐藥基因轉染到患者造血干細胞以增強患者對化療的耐受性等〔4〕。有人在結腸癌細胞株中導入抗癌基因,其生長就受到不同程度的抑制,如果SW480細胞株缺失或突變的是P53基因,導入野生型P53即發(fā)現腫瘤明顯消退〔5〕。

相關文獻報道〔6〕，通過原位雜交和免疫組化方法證實,姜黃素處理細胞后,c-myc基因 mRNA 和蛋白表達水平均降低,說明 c-myc 基因表達水平降低與姜黃素誘導細胞的凋亡密切相關，其具體機制可能與Caspase-3 的表達增加引起細胞內的凋亡有重大關系。同時，相關研究人員利用反義表達載體封閉內源性的c-myc表達后發(fā)現NDRG2的啟動子活性反而略有增加，這可能與myc的過表達可以抑制NDRG2啟動子有關。

本研究結果表明，姜黃素在一定濃度范圍內使NDRG2基因上調，其有效濃度為40～100 μmol/L，能有效抑制腫瘤細胞。

4參考文獻

1Stanton BR, Perkins AS, Tessarollo L,etal. Loss of N-myc function results in embryonic lethality and failure of the epithelial component of the embryo to develop〔J〕.Genes Dev,1992;6(12A): 2235-47.

2李劍，林樹新，劉新平，等.一種新的抑癌候選基因：-DNR2在人類正常組織及相應腫瘤中的表達〔J〕.生物化學與生物物理進展,2002;29(2): 223-7.

3國家藥典委員會.中國藥典臨床用藥須知〔M〕.北京：人民衛(wèi)生出版社，2005:201.

4沃興德,洪行球,魏佳萍,等.姜黃醇提取物對高脂血癥患者脂代謝及肝腎功能的影響〔J〕.浙江中醫(yī)學院學報,1999;23(1):20-2.

5Charron J,Malynn BA,Fisher P,etal. Embryonic lethality in mice homozygous for a targeted disruption of the N-myc gene〔J〕.Genes Dev，1992;6(12A): 2248-57.

6Shimono A,Okuda T, Kondoh H.N-myc-dependent repression of ndr1, a gene identified by direct subtraction of whole mouse embryo cDNAs between wild type and N-myc mutant〔J〕.Mech Dev,1999;83(1-2): 39-52.

〔2013-09-12修回〕

(編輯袁左鳴)