組織因子途徑抑制物－2在宮頸癌中的表達(dá)及其對宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響

組織因子途徑抑制物-2在宮頸癌中的表達(dá)及其對宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響

孟斐

(沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，遼寧沈陽110024)

摘要〔〕目的觀察組織因子途徑抑制物(TFPI)-2在正常宮頸、宮頸上皮內(nèi)腫瘤(CIN)和宮頸鱗癌組織中表達(dá)的差異及TFPI-2對體外培養(yǎng)的宮頸癌Hela細(xì)胞增殖和凋亡的影響。方法收集2009～2010年在該院婦產(chǎn)科住院治療的68例宮頸鱗癌患者，48例CIN患者及12例宮頸正?；颊叩膶m頸組織標(biāo)本，免疫組化染色檢測宮頸組織中TFPI-2的表達(dá)。取生長狀態(tài)良好的宮頸癌Hela細(xì)胞，應(yīng)用基因轉(zhuǎn)染的方法建立TFPI-2高表達(dá)細(xì)胞系，Real-time PCR和Western印跡方法檢測基因轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞中TFPI-2 mRNA和蛋白的表達(dá)；四甲基偶氮唑藍(lán)比色法(MTT)檢測各組細(xì)胞的增殖活性，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。結(jié)果①免疫組化染色顯示，正常宮頸組織、CIN和宮頸癌中TFPI-2表達(dá)逐漸降低，三者間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.01)。②體外觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-TFPI-2的Hela-TFPI-2組細(xì)胞TFPI-2 mRNA和蛋白表達(dá)明顯高于轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒組和空白對照組(P<0.01)；MTT結(jié)果顯示，Hela-TFPI-2組細(xì)胞增殖速度明顯低于空白對照組和空白質(zhì)粒組，且隨著培養(yǎng)時間的延長，這種抑制作用更明顯(P<0.05)；流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示Hela-TFPI-2組細(xì)胞凋亡率顯著高于空白對照組和空白質(zhì)粒組(P<0.05)。結(jié)論TFPI-2表達(dá)隨著宮頸病變的進(jìn)展逐漸降低；同時過表達(dá)的TFPI-2可明顯抑制宮頸癌Hela細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡。提示TFPI-2的表達(dá)減少可能是宮頸癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制之一，TFPI-2可能是治療宮頸癌的新靶點(diǎn)。

關(guān)鍵詞〔〕宮頸癌；組織因子途徑抑制物-2；Hela細(xì)胞；細(xì)胞增殖；凋亡

中圖分類號〔〕R73〔

第一作者：孟斐(1972-),女，博士，主任醫(yī)師，主要從事宮頸疾病研究。

組織因子途徑抑制物(TFPI)-2具有抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的作用〔1〕。研究〔2～4〕發(fā)現(xiàn)，在許多類型的人類腫瘤細(xì)胞中，都存在編碼TFPI-2基因的抑制及缺失。目前國內(nèi)外關(guān)于TFPI-2在宮頸癌中的研究并不多見，有研究〔5〕顯示，TFPI-2失活可能與宮頸癌細(xì)胞的增殖和凋亡有關(guān)，但是目前尚缺乏相關(guān)報道。本研究分別通過體內(nèi)和體外實驗觀察TFPI-2在正常宮頸、宮頸上皮內(nèi)腫瘤(CIN)和宮頸鱗癌組織中表達(dá)的差異，及TFPI-2對宮頸癌Hela細(xì)胞增殖和凋亡的影響。探討TFPI-2在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用，為尋找新的抗腫瘤治療方法提供思路，為宮頸癌的基因治療尋找新的靶點(diǎn)。

1資料和方法

1.1材料納入2009～2010年在我院婦產(chǎn)科住院治療的患者。其中宮頸鱗癌患者68例，年齡22～71〔平均(43±6)〕歲；CIN患者48例，年齡25～69〔平均(45±5)〕歲；宮頸正?；颊?2例，為子宮肌瘤患者切除肌瘤時的正常宮頸組織，年齡34～62〔平均(42±3)〕歲。所有患者在取材前均未經(jīng)放化療及生物和手術(shù)治療，均經(jīng)病理診斷證實，排除宮頸腺癌患者。各組患者年齡無統(tǒng)計學(xué)差異。均簽署知情同意書。人宮頸癌Hela細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞研究所。37℃溫水浴復(fù)蘇，高糖DMEM培養(yǎng)基(Hyclon公司)中培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿80%以上進(jìn)行傳代，取第3代對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.2方法

1.2.1免疫組化染色檢測宮頸組織TFPI-2的表達(dá)取宮頸組織，40 g/L多聚甲醛固定后，脫水，浸蠟，包埋，行4 μm厚連續(xù)切片，切片常規(guī)脫蠟，二甲苯透明，梯度乙醇水化后熱修復(fù)抗原；磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，3%過氧化氫37℃孵育20 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；PBS沖洗，山羊血清封閉。在兔抗人TFPI-2多克隆抗體(1∶160；北京博奧森生物技術(shù)有限公司)中4℃孵育過夜；PBS沖洗后生物素標(biāo)記二抗工作液(北京中山金橋生物技術(shù)公司)中37℃孵育15 min；PBS沖洗后滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育15 min，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色(北京中山金橋生物技術(shù)公司)，顯微鏡(日本Olympus公司)下控制染色程度，蒸餾水洗滌終止反應(yīng)，蘇木精復(fù)染，自來水沖洗，返藍(lán)；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。用PBS代替一抗作為陰性對照。由兩名病理科醫(yī)師進(jìn)行盲法閱片，在200倍鏡下隨機(jī)選取5個視野進(jìn)行判讀，細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色可以為TFPI-2表達(dá)陽性。其中陽性表達(dá)75%～100%為強(qiáng)陽性()，50%～75%為次強(qiáng)陽性()，10%～50%為陽性()，<10%為弱陽性(+)，不表達(dá)為陰性(-)。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染目的基因pcDNA3.1-TFPI-2質(zhì)粒和空白pcDNA3.1質(zhì)粒均由上海吉凱基因化學(xué)有限公司合成。參照Lipofectamine2000試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。取對數(shù)生長期Hela細(xì)胞，胰酶消化，含10%胎牛血清的DMEM重懸細(xì)胞，按1×105個細(xì)胞接種至培養(yǎng)板，待細(xì)胞70%～80%融合后，加入1∶1的脂質(zhì)體/質(zhì)?；旌弦哼M(jìn)行轉(zhuǎn)染。Hela-TFPI-2組轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-TFPI-2質(zhì)粒，空白質(zhì)粒組轉(zhuǎn)染pcDNA3.1 空白質(zhì)粒，空白對照組不進(jìn)行轉(zhuǎn)染。48 h后G418進(jìn)行抗性篩選，用于Real-time PCR和Western印跡檢測。

1.2.3Real-time PCR檢測轉(zhuǎn)染后的宮頸癌細(xì)胞Hela中TFPI-2 mRNA的表達(dá)按Trizol試劑說明提取各組細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計檢測RNA完整性和純度，利用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)Gen-Bank的人TFPI-2 mRNA序列，以primer5.0設(shè)計其上、下游引物序列，由大連寶生物公司合成。Real-time PCR反應(yīng)體系共20 μl，2×Real-time PCR Master Mix(SYBR Green) 10 μl，模板(cDNA稀釋10倍)2 μl，上、下游引物各0.4 μl (10 μmol/L)，ddH2O 7.2 μl。反應(yīng)條件：95℃，預(yù)變性30 s。95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，共40個循環(huán)。應(yīng)用Rotor-Gene 3000熒光實時定量PCR儀的Comparative Delta-delta Ct法對獲得的熒光曲線結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果用2-ΔΔCt表示，以DAPDH作為內(nèi)參。

1.2.4Western印跡法檢測轉(zhuǎn)染后的宮頸癌細(xì)胞Hela中TFPI-2蛋白的表達(dá)取各組組織，用細(xì)胞裂解液提取蛋白，二喹啉甲酸(BCA)方法測蛋白濃度；調(diào)節(jié)蛋白濃度一致，取等量蛋白樣品，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白，然后用半干式電轉(zhuǎn)的方法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏氟丙烯(PVDF)膜上，封閉液室溫封閉2 h，1∶200稀釋的兔抗人TFPI-2多克隆抗體室溫雜交2 h；1∶3 000稀釋的生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG室溫雜交2 h，電化學(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光，曝光、顯影、定影。應(yīng)用北京航天航空大學(xué)CM-2000B型生物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測量條帶的吸光度值，以β-actin作為內(nèi)參。

1.2.5四甲基偶氮唑藍(lán)比色法(MTT)檢測轉(zhuǎn)染后的宮頸癌細(xì)胞Hela增殖情況分別于轉(zhuǎn)染后24、48、72 h以0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)消化為單細(xì)胞懸液后，按照103～104/孔接種于包被過的多聚賴氨酸的96孔板中，0.2 ml/孔，每孔加入5 mg/ml MTT溶液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，棄上清，然后每孔加入150 μl二甲基亞砜，振蕩10 min，于酶免分析儀490 nm測定吸光度(A)值。

1.2.6流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染后的宮頸癌細(xì)胞Hela的凋亡情況胰酶消化收集細(xì)胞，4℃PBS洗細(xì)胞，重懸，調(diào)細(xì)胞濃度為1×106/ml，流式細(xì)胞凋亡雙染色法(Annexin V/FITC和PI)雙染細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀分別檢測細(xì)胞凋亡。其中左上象限為壞死和晚期凋亡細(xì)胞(Annexin-/PI+)、右上象限為壞死細(xì)胞(Annexin+/PI+)、左下象限為正?；罴?xì)胞(Annexin-/PI-)、右下象限為早期凋亡細(xì)胞(Annexin+/PI-)。

2結(jié)果

2.1正常宮頸、CIN及宮頸鱗癌組織TFPI-2的表達(dá)免疫組化染色結(jié)果顯示TFPI-2蛋白主要表達(dá)在胞質(zhì)中，呈棕黃色，在正常宮頸上皮組織TFPI-2表達(dá)較高，染色較均一；而在宮頸鱗癌組織中表達(dá)較低或不表達(dá)，CIN組織表達(dá)介于正常宮頸組織和宮頸鱗癌組織之間。三者間兩兩比較差異顯著(P<0.01)，見表1，圖1。

表1宮頸癌與CIN，正常宮頸組織中TFPI-2表達(dá)比較(n)

組別n-+正常宮頸組織12000210CIN組織480219198宮頸癌組織6820281820

圖1　正常宮頸、CIN及宮頸癌組織中TFPI-2的表達(dá)(免疫組化染色，×200)

2.2TFPI-2基因轉(zhuǎn)染后宮頸癌細(xì)胞Hela中TFPI-2 mRNA及蛋白的表達(dá)實驗應(yīng)用real-time PCR檢測轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞酸氨酸磷酸酶2(SHP-2)mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示，Hela-TFPI-2組細(xì)胞TFPI-2 mRNA的表達(dá)量為8 652.12±351.04，明顯高于轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒組的1.01±0.05和空白對照組的1.00±0.10(P<0.01)，而空白質(zhì)粒組和空白對照組間TFPI-2 mRNA的表達(dá)無明顯差異(P>0.05)，可見pcDNA3.1-TFPI-2質(zhì)粒可成功將TFPI-2基因轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞，并在細(xì)胞中表達(dá)。同時，實驗采用Western印跡檢測轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞SHP-2蛋白的表達(dá)，其結(jié)果與real-time PCR結(jié)果一致，見圖2。

圖2　Western印跡檢測轉(zhuǎn)染后各組Hela細(xì)胞中 TFPI-2蛋白的表達(dá)

2.3TFPI-2基因轉(zhuǎn)染對Hela細(xì)胞增殖的影響應(yīng)用MTT法分別于轉(zhuǎn)染后24 h，48 h，72 h各組細(xì)胞的吸光度值進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，與空白質(zhì)粒組和空白對照組比較，各時間Hela-TFPI-2組的吸光度值明顯降低(P<0.05)，且隨著培養(yǎng)時間的延長，各組的差異更明顯。說明TFPI-2基因轉(zhuǎn)染可明顯抑制Hela細(xì)胞的增殖，見圖3。

圖3　TFPI-2對宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖的影響

2.4TFPI-2基因轉(zhuǎn)染對Hela細(xì)胞凋亡的影響實驗應(yīng)用流式細(xì)胞儀Annexin V/PI雙染法檢測TFPI-2基因轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果顯示Hela-TFPI-兩組細(xì)胞凋亡率為(5.46±0.52)%，而空白對照組和空白質(zhì)粒組的細(xì)胞凋亡率分別為(1.25±0.14)%和(1.23±0.20)%，統(tǒng)計學(xué)結(jié)果顯示，Hela-TFPI-兩組的細(xì)胞凋亡率明顯高于空白對照組和空白質(zhì)粒組，而空白對照組和空白質(zhì)粒組的細(xì)胞凋亡率間差異無顯著性意義。

3討論

目前對宮頸癌的治療包括手術(shù)、放療、化療等，但仍有大量的患者復(fù)發(fā)而死亡。隨著對腫瘤發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制研究的不斷深入，惡性腫瘤的基因治療已成為當(dāng)前腫瘤研究的熱點(diǎn)。

TFPI-2，又稱胎盤蛋白-5，定位于7號染色體7q22，體內(nèi)主要以相對分子質(zhì)量為32 000的形式存在于內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的ECM中。TFPI-2分子共由5個部分組成：富含酸性氨基酸的N端、3個首尾相連的Kunitz結(jié)構(gòu)域和富含堿性氨基酸的C端。TFPI-2通過Kunitz結(jié)構(gòu)域與蛋白水解酶結(jié)合來抑制其活性〔6～8〕。TFPI-2屬于Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑家族蛋白，是一種廣譜的絲氨酸蛋白酶抑制物，研究發(fā)現(xiàn)TFPI-2能夠抑制ECM相關(guān)的胰蛋白酶，纖溶酶，凝血因子Ⅶ(FⅦa)/組織因子復(fù)合物等從而維持ECM結(jié)構(gòu)的完整性。同時，TFPI-2可以通過抑制纖溶物和MMPs的活性〔9〕，以及下調(diào)血管生成因子(VEGF)的表達(dá)抑制腫瘤新生血管的生成，間接抑制腫瘤細(xì)胞的增殖〔10〕。研究發(fā)現(xiàn)TFPI-2降解絲氨酸的蛋白產(chǎn)物可以結(jié)合細(xì)胞凋亡受體，引導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡增加，發(fā)揮其抗腫瘤效應(yīng)〔11～13〕。

實驗中宮頸癌組織中的TFPI-2表達(dá)明顯低于正常宮頸組織和CIN組織，可能是TFPI-2的表達(dá)減少，導(dǎo)致其與MMPs的結(jié)合降低，無法抑制MMPs的活性及血管形成，進(jìn)而促進(jìn)了宮頸癌的形成和發(fā)展。本實驗提示，TFPI-2處理與MMPs作用應(yīng)用ECM的完整性及影響腫瘤血管生成以外，其對宮頸癌的抑制作用還與其他因素有關(guān)，有待進(jìn)一步的研究。

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〔2013-06-10修回〕

(編輯袁左鳴)