山葡萄黃烷酮3—羥化酶VamF3H基因及其克隆

李娟　曹芳芳　權(quán)哲　劉海峰

摘要：采用RT-PCR與RACE技術(shù)相結(jié)合的方法，從山葡萄果皮中克隆到黃烷酮3-羥化酶（F3H）基因的cDNA全長序列。該基因全長1 398 bp，包含1 092 bp的完整開放閱讀框，編碼363個氨基酸，相對分子質(zhì)量為40.81 ku，等電點（PI）值為5.37。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，隨機卷曲是VamF3H蛋白最大量的結(jié)構(gòu)元件，不具有信號肽，屬于不穩(wěn)定親水蛋白。氨基酸序列與歐亞種葡萄（FQ389950）、圓葉葡萄（KF040970）、美國蔓藤（JX087441）等的F3H類基因同源性較高，相似性分別為99%、99%、96%。

關(guān)鍵詞：山葡萄；cDNA克?。稽S烷酮3-羥化酶

中圖分類號： S663.101 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）10-0036-05

黃烷酮3-羥化酶（flavanone 3-hydroxylase，F(xiàn)3H）是花色素合成途徑中的結(jié)構(gòu)基因，是花青素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶[1]。F3H屬于依賴2-酮戊二酸的雙加氧酶，反應(yīng)需要2-酮戊二酸、分子氧、鐵、抗壞血酸[2]。其作用為催化柚皮素C3位羥基化，生成二氫山奈酚（dihydrokaempferol，DHK），而DHK是黃酮和異黃酮合成的重要中間產(chǎn)物；因此，F(xiàn)3H調(diào)控著黃酮與花青素苷產(chǎn)物的合成，是整個黃酮類化合物代謝途徑的中樞位點[3]。有報道指出F3H與花青苷合成關(guān)系密切[4]，然而此方面的研究尚較少。Holton等發(fā)現(xiàn)F3H對黃烷酮、兒茶酸、原花青素、花青素代謝影響較大，是該代謝途徑的關(guān)鍵酶[3]。Lepiniec等研究證實，由F3H和F3′H催化生成的黃烷酮醇在DFR的催化作用下能夠合成無色花青素[5]。F3H的活性最初在紫羅蘭花中被檢測到[6]。Martin等利用鑒別篩選與基因圖譜技術(shù)首次從金魚草中分離克隆到F3H基因[7]。研究表明，F(xiàn)3H基因在矮牽牛等植物中是獨立表達(dá)的，而大多數(shù)情況下，F(xiàn)3H與其上游的CHS、CHI基因，以及下游的DFR基因協(xié)同表達(dá)[8]。在大多數(shù)物種中，F(xiàn)3H基因僅以單拷貝形式存在[9-11]。

山葡萄別稱野葡萄，最初發(fā)現(xiàn)于我國東北和俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)，在我國主要分布于吉林省長白山、黑龍江省完達(dá)山、小興安嶺、遼寧省北部等地[12]。山葡萄是我國重要的野生果樹資源，具有極強的抗寒性，是東北地區(qū)釀造葡萄酒的主要原料[13]，其漿果含有大量花色苷。目前，分子生物技術(shù)已廣泛應(yīng)用于葡萄遺傳育種的各個領(lǐng)域，加速了葡萄遺傳學(xué)圖譜、基因的克隆表達(dá)、新基因的分離鑒定等研究的進(jìn)展[14]。F3H基因已在玉米、矮牽牛花、水母雪蓮等很多植物中克隆得到并且定性[15]。在擬南芥、茄子、苜蓿、葡萄、蘋果、柑橘、梨、康乃馨、翠菊、日本牽牛等植物中均克隆到了F3H基因，但未見山葡萄中F3H基因的相關(guān)報道。本研究采用RT-PCR和RACE技術(shù)相結(jié)合的方法克隆F3H基因，獲得全長序列，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，旨在為闡明山葡萄花色苷的生物合成及調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 供試山葡萄品種為雙豐（Vitis amurensis Shuang Feng），采自國家山葡萄種質(zhì)資源圃。采摘無病蟲害、飽滿的成熟期果粒，立即置于液氮中冷凍，并于-80 ℃冰箱保存，取其果皮作為供試材料。

1.1.2 菌株、酶、生化試劑 Tris-HCl、CTAB、EDTA、無水LiCl、β-巰基乙醇、DEPC水、AMP、IPTG、X-gal均為AITiresco分裝試劑；大腸桿菌DH5α、pMD19-T載體、Taq酶、Marker DL 2 000均購自TaKaRa公司；膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司；反轉(zhuǎn)錄酶SuPerscriptll購自invitrogen公司；SMARTTM RACE試劑盒購自Clonteeh公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。引物由英俊生物技術(shù)有限公司合成，DNA測序由上海生工生物公司完成。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 登錄NCBI網(wǎng)站，根據(jù)GenBank中已登陸的F3H基因的核苷酸序列和氨基酸序列，通過多序列比對確定其共有的保守區(qū)，利用Primer 6.0軟件設(shè)計1對特異引物用來擴增目的片段。上游引物F1：5′-TGTCTGGTGGCAAGAAAGGC-3′；下游引物F2：5′-CGAGGGTGAGGTCTGGCTGT-3′。

以該引物擴增出的序列設(shè)計5′RACE和3′RACE引物，分別為：F3H-a：5′-AGCGTCCTTGTCCAAATCCA-3′；F3H-s：5′-CGTTTCCAGCCATCTTCA-3′。

1.2.2 山葡萄果皮總RNA的提取及cDNA的合成 采用改良的CTAB[16]法提取山葡萄果皮中的總RNA。采用紫外分光光度計測定其230、260、280 nm處的吸光度及總RNA濃度，用1%TAE檢測RNA的完整性。

按照Invitrogen公司的SuperScriptⅡ反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說明書，以O(shè)ligo（dT）20為引物、總RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA的第1條鏈。

1.2.3 PCR擴增目的基因片段 以山葡萄cDNA第1鏈為模板，用引物F1、F2進(jìn)行PCR擴增。50 μL反應(yīng)體系包括：2.0 μL cDNA、5.0 μL 10×Ex Taq Buffer（Me2+ free）、0.4 μL Ex Taq（5 U/μL）、36.6 μL ddH2O、F1和F2引物各1.0 μL。反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min，于4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并回收純化目的片段。

1.2.4 5′RACE和3′RACE法獲得基因片段 參照SMARTTM RACE試劑盒說明書，以逆轉(zhuǎn)錄分別合成的5′-RACE-Ready-cDNA和3′-RACE-Ready-cDNA為模板，以F3H-a、F3H-s分別同UPM為引物，進(jìn)行5′RACE、3′RACE擴增以獲得5′端片段、3′端片段。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min，于4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測以確定條帶。

1.2.5 目的片段的回收和連接 按照膠回收試劑盒說明書對PCR產(chǎn)物的DNA片段進(jìn)行回收、連接、轉(zhuǎn)化。將回收的DNA片段與pMD-18載體連接，于16 ℃連接3 h。反應(yīng)體系為pMD-18載體0.5 μL、DNA片段4.5 μL、SolutionⅠ5.0 μL。

1.2.6 轉(zhuǎn)化 將DH5α感受態(tài)細(xì)胞解凍后，取50 μL加入10 μL連接產(chǎn)物，冰浴30 min；取出后熱激90 s，并置于冰上2～3 min；加入預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基300 μL，于37 ℃、190 r/min培養(yǎng)1 h；取適量菌液涂布于含有AMP、X-Gal、IPTG的LB固體培養(yǎng)基平板上，于37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過夜。次日，挑白色單克隆置于37 ℃搖床中，200 r/min培養(yǎng)12 h。隨后進(jìn)行菌液PCR檢測，將成功克隆的菌樣測序。

1.3 VamF3H基因序列及其編碼蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析

利用DNAstar軟件查找VamF3H基因的開放閱讀框（ORF）并推導(dǎo)其氨基酸序列；利用NCBI的BLAST程序檢索數(shù)據(jù)庫，對VamF3H基因全長cDNA序列及其氨基酸序列進(jìn)行比對分析；利用ProtParam在線軟件（http：//www.expasy.org/tools/protparam.html）分析VamF3H基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)；運用ProtScale在線軟件（http：//ca.expasy.org/tools/protscale.html）、TMHMM在線軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0）、SignalP在線軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）對所編碼蛋白質(zhì)的親水性、疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)域、信號肽進(jìn)行分析；通過ExPASY中的HNN工具分析其蛋白質(zhì)序列的二級結(jié)構(gòu)；采用GeneDoc軟件進(jìn)行多序列比對，并采用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 山葡萄VamF3H基因cDNA全長的克隆及序列分析

以山葡萄果皮總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用特異引物F1和F2擴增出1條324 bp的預(yù)期片段（圖1-a）。經(jīng)Blastn分析發(fā)現(xiàn)，該序列與其他物種F3H基因高度同源，與歐亞種葡萄（FQ389950）的同源性高達(dá)99%，初步確認(rèn)其為山葡萄F3H基因的核心序列。根據(jù)所得中間段序列設(shè)計末端擴增的特異引物F3H-a和F3H-s，經(jīng)RACE擴增、產(chǎn)物克隆、測序后，分別得到長度為965 bp的3′末端和647 bp的5′末端（圖1-b）。將RT-PCR和RACE擴增片段進(jìn)行序列拼接得到VamF3H基因cDNA全長序列，最終獲得1條長為1 398 bp的cDNA全長序列，經(jīng)Blastn比對發(fā)現(xiàn)，該cDNA序列與其他物種的F3H基因同源。

經(jīng)DNAstar軟件分析發(fā)現(xiàn)，該cDNA包含1個1 092 bp的完整開放閱讀框、214 bp的3′-非翻譯區(qū)、92 bp的5′-非翻譯區(qū)，推測其編碼363個氨基酸。GenBank登錄號為KP966099，將其命名為VamF3H。

2.2 VamF3H基因編碼蛋白質(zhì)的理化性狀

利用ProParam軟件在線預(yù)測分析VamF3H基因編碼蛋

白的理化性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)該蛋白由363個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量（MV）為40.81 ku，等電點值為5.37。組成VamF3H蛋白的20種氨基酸中亮氨酸（Leu）含量最高，達(dá)到9.9%；半胱氨酸（Cys）、色氨酸（Trp）含量最少，僅為1.4%。正電荷殘基（Arg+Lys）數(shù)為45個，負(fù)電荷殘基（Asp+Glu）數(shù)為55個，不穩(wěn)定指數(shù)為44.25，脂肪指數(shù)為84.33，表明VamF3H基因蛋白屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。

2.3 VamF3H蛋白保守區(qū)預(yù)測

利用NCBI的BlastP程序，在蛋白保守區(qū)數(shù)據(jù)庫預(yù)測山葡萄VamF3H基因的蛋白保守區(qū)。結(jié)果表明，VamF3H具有2-酮戊二酸的雙加氧酶（2-ODD）結(jié)構(gòu)域、非血紅素雙加氧酶結(jié)構(gòu)域。VamF3H具有特征性結(jié)構(gòu)域FE2OG_OXY PS51471（圖2），屬于雙加氧酶家族。

2.4 VamF3H蛋白的親水性

利用ProtScale程序分析山葡萄VamF3H基因氨基酸序列的親水性及疏水性（圖3）。圖中縱坐標(biāo)為氨基酸標(biāo)度值，橫坐標(biāo)為氨基酸序列位置。依據(jù)氨基酸分值越低親水性越強、分值越高疏水性越強的規(guī)律，可明顯看出疏水性最大值在第168位點，值為1.900；最小值在第145位點，值為-2.722?？偲骄H水性指數(shù)為-0.444，整體表現(xiàn)為親水性。

2.5 VamF3H蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域

根據(jù)TMHMM、TMpred Server網(wǎng)站分析，超過500分才被認(rèn)為顯著。可見VamF3H蛋白無跨膜螺旋，故可推測VamF3H不含有跨膜結(jié)構(gòu)域。

2.6 VamF3H蛋白的信號肽預(yù)測及二級結(jié)構(gòu)

利用SignalP 4.1 Server軟件對山葡萄VamF3H基因蛋白進(jìn)行信號肽預(yù)測。結(jié)果表明，VamF3H基因編碼的蛋白不具有信號肽。

利用HNN軟件在線預(yù)測VamF3H基因的二級結(jié)構(gòu)（圖4）。該蛋白的二級結(jié)構(gòu)由48.48%的無規(guī)卷曲（random coil）、32.78%的α-螺旋（alpha helix）、18.73%的β-折疊（extended strand）組成。

2.7 山葡萄VamF3H編碼蛋白質(zhì)的同源性及進(jìn)化

登陸NCBI主頁，利用BlastP在線軟件將克隆得到的VamF3H基因編碼氨基酸序列進(jìn)行同源性搜索比較。結(jié)果表明，該基因與歐亞種葡萄（FQ389950）、圓葉葡萄（KF040970）、美洲種葡萄（JX087441）、桑樹（KF438044）等的F3H類基因同源性較高，相似性分別為99%、99%、96%、81%。利用GeneDoc軟件對包括VamF3H在內(nèi)10個物種的F3H基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行多重比對分析（圖5），圖中劃線部分為保守結(jié)構(gòu)域。

為進(jìn)一步分析VamF3H與其他植物F3H之間的進(jìn)化關(guān)系，在多重比對的基礎(chǔ)上，利用Mega 6.0軟件對該基因及其他植物F3H基因的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析（圖6）。結(jié)果表明，山葡萄VamF3H基因與歐亞種葡萄、圓葉葡萄、美國蔓藤的同源性最高，與梨、風(fēng)毛菊等親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3 結(jié)論與討論

本研究利用同源克隆和RACE技術(shù)相結(jié)合的方法，從山葡萄果皮中克隆獲得F3H的同源基因VamF3H，并對其編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，該蛋白的二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)卷曲為主，其次為α-螺旋，再次為β-折疊，無其他二級結(jié)構(gòu)元件，此預(yù)測結(jié)果與已報道的草莓、葡萄、海棠F3H蛋白的二級結(jié)構(gòu)一致[17]。保守結(jié)構(gòu)域分析表明，該基因編碼的蛋白具有典型2-O-酮戊二酸和Fe2+-依賴的雙加氧酶家族（2OG-FeⅡ_Oxy）的保守結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域中含有與鐵離子結(jié)合所需的組氨酸、天冬氨酸，以及與2-O-酮戊二酸結(jié)合所需的精氨酸、絲氨酸保守位點，這些都是植物雙加氧酶超家族基因的典型特征。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，VamF3H與同屬的歐亞種葡萄F3H親緣關(guān)系最近，而與薔薇科的梨、菊科的風(fēng)毛菊親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，可見VamF3H的進(jìn)化具有明顯的種屬特性。

從以上核苷酸、氨基酸較高的相似系數(shù)可知，F(xiàn)3H基因在進(jìn)化上較為保守，因為F3H僅以單拷貝形式存在于大多數(shù)物種中，提示F3H基因可能在花青素生成中具有重要地位。單拷貝基因比多拷貝基因更易于調(diào)控，且F3H基因在進(jìn)化上保守性很高，少數(shù)幾個堿基的突變就可能造成基因失活，從而阻礙花青素的生成。目前，關(guān)于控制花青素生成的研究主要集中于控制花青素生成的結(jié)構(gòu)酶，并通過轉(zhuǎn)入結(jié)構(gòu)酶的基因以獲得結(jié)構(gòu)酶的過量表達(dá)，從而增加花青素的生成，而關(guān)于調(diào)控結(jié)構(gòu)酶的基因或調(diào)控因子的研究尚未見報道；因此，研究花色素調(diào)控基因比單純研究結(jié)構(gòu)酶更具有意義。

通過獲得的F3H基因cDNA全長序列，可在以下方面做進(jìn)一步研究。驗證F3H基因在山葡萄中是否為單拷貝存在。F3H基因在很多物種中均以單拷貝存在，而葡萄中的F3H則為2個拷貝[18-20]，因此推測VamF3H也同為2個拷貝?？墒褂肧outhem Blot技術(shù)驗證F3H基因在山葡萄的果皮、果肉、根、莖、葉、種子等部位中是否為2個拷貝。將已有的F3H基因作為探針，與山葡萄基因組文庫雜交，可獲得F3H基因組DNA序列，以進(jìn)行內(nèi)含子組成、外顯子組成、結(jié)構(gòu)預(yù)測等分子生物學(xué)分析，為山葡萄花色素的研究提供分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]張 龍，李衛(wèi)華，姜淑梅，等. 花色素苷生物合成與分子調(diào)控研究進(jìn)展[J]. 園藝學(xué)報，2008，35（6）：909-916.

[2]張學(xué)英，張上隆，駱 軍，等. 果實花色素苷合成研究進(jìn)展[J]. 果樹學(xué)報，2004，21（5）：456-460.

[3]Holton T A，Cornish E C. Genetics and biochemistry of anthocyanin biosynthesis[J]. The Plant Cell，1995，7（7）：1071-1083.

[4]Zuker A，Tzfira T，Ben-Meir H，et al. Modification of flower color and fragrance by antisense suppression of the flavanone 3-hydroxylase gene[J]. Molecular Breeding，2002，9（1）：33-41.

[5]Lepiniec L，Debeaujon I，Routaboul J M，et al. Genetics and biochemistry of seed flavonoids[J]. Annual Review of Plant Biology，2006，57：405-430.

[6]Forkmann G，Heller W，Grisebach H. Anthocyanin biosynthesis in flowers of Matthiola incana、Favanone-3-hyroxylase and flavonoid-3′-hydroxylase[J]. Zeitschrift Fur Naturforschung C-A Journal of Biosciences，1980，35（9/10）：691-695.

[7]Martin C，Prescott A，Mackay S，et al. Control of anthocyanin biosynthesis in flowers of Antirrhinum majus[J]. Plant Journal，1991，1（1）：37-49.

[8]Britsch L，Ruhnau-Brich B，F(xiàn)orkmann G. Molecular cloning，sequence analysis，and in vitro expression of flavanone 3 beta-hydroxylase from Petunia hybrida[J]. The Journal of Biological Chemistry，1992，267（8）：5380-5387.

[9]Deboog B，Albertsen M C，Taylor L P. Flavanone3-β-hydroxylase transcripts and flavonol accumulation are temporally coordinate in Maize anthers[J]. Plant Journal，1995，7（5）：703-713.

[10]Charrier B，Coronado C，Kondorosi A，et al. Molecular characterization and expression of alfalfa（Medicago sativa L.）flavanone-3-hydroxylase and dihydroflavonol-4-reductase encoding genes[J]. Plant Molecular Biology，1995，29（4）：773-786.

[11]Pelletier M K，Shirley B W. Analysis of flavanone 3-hydroxylase in Arabidopsis seedlings. Coordinate regulation with chalcone synthase and chalcone isomerase[J]. Plant Physiology，1996，111（1）：339-345.

[12]葛玉香，沈育杰，李曉紅，等. 山葡萄種質(zhì)資源評價與利用研究現(xiàn)狀[J]. 中外葡萄與葡萄酒，2000（4）：16-20.

[13]沈育杰，趙淑蘭，楊義明，等. 我國山葡萄種質(zhì)資源研究與利用現(xiàn)狀[J]. 特產(chǎn)研究，2006，28（3）：53-57.

[14]王 軍. 生物技術(shù)與葡萄遺傳育種[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，42（8）：2862-2874.

[15]Jin Z P，Grotewold E，Qu W Q，et al. Cloning and characterization of a flavanone 3-hydroxylase gene from Saussurea medusa[J]. DNA Sequence，2005，16（2）：121-129.

[16]Daldoul S，Chenenanoui S，Mliki A，et al. Improvement of an RNA purification method for grapevine（Vitis vinifera L.）suitable for cDNA library construction[J]. Acta Physiologiae Plantarum，2009，31（4）：871-875.

[17]Shen H X，Zhang J，Yao Y C，et al. Isolation and expression of McF3H gene in the leaves of crabapple[J]. Acta Physiologiae Plantarum，2012，34（4）：1353-1361.

[18]Sparvoli F，Martin C，Scienza A，et al. Cloning and molecular analysis of structural genes involved in flavonoid and stilbene biosynthesis in grape（Vitis vinifera L.）[J]. Plant Molecular Biology，1994，24（5）：743-755.

[19]Jeong S T，Goto-Yamamoto N，Kobayashi S，et al. Effects of plant hormones and shading on the accumulation of anthocyanins and the expression of anthocyanin biosynthetic genes in grape berry skins[J]. Plant Science，2004，167（2）：247-252.

[20]Waters D L，Holton T A，Ablett E M，et al. cDNA microarray analysis of developing grape（Vitis vinifera cv. Shiraz）berry skin[J]. Functional & Integrative Genomics，2005，5（1）：40-58.鄺良德，任永軍，謝曉紅，等. 家兔DGAT1基因的克隆及其組織表達(dá)譜分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（10）：41-44.