紫杉醇生物合成途徑中羥化酶的研究進(jìn)展

陳清浦，廖衛(wèi)芳，付春華,2，趙春芳,2，余龍江,2

1 華中科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 生物技術(shù)系，湖北 武漢 4300742 華中科技大學(xué) 分子生物物理教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，湖北 武漢 430074

?

紫杉醇生物合成途徑中羥化酶的研究進(jìn)展

陳清浦1，廖衛(wèi)芳1，付春華1,2，趙春芳1,2，余龍江1,2

1 華中科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 生物技術(shù)系，湖北 武漢 430074
2 華中科技大學(xué) 分子生物物理教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，湖北 武漢 430074

陳清浦, 廖衛(wèi)芳, 付春華, 等. 紫杉醇生物合成途徑中羥化酶的研究進(jìn)展. 生物工程學(xué)報, 2016, 32(5): 554–564.

Chen QP, Liao WF, Fu CH, et al. Research progress in hydroxylase in taxol biosynthetic pathway. Chin J Biotech, 2016, 32(5): 554–564.

摘 要:紫杉醇是一種從紅豆杉植物中提取的具有顯著抗癌效果的萜類化合物，但在紅豆杉中含量很低，難以滿足日益增長的臨床需求。近年來，利用合成生物學(xué)技術(shù)建立新的紫杉醇來源途徑已成為研究熱點(diǎn)。目前，紫杉醇合成相關(guān)酶基因大部分已被克隆和鑒定，但其中羥化酶基因的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用仍是目前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。本文對紫杉醇生物合成途徑研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，對其中羥化酶的克隆及功能研究體系進(jìn)行了重點(diǎn)深入分析，最后探討了本領(lǐng)域未來的研究方向并對其前景進(jìn)行展望，以期為紫杉醇合成途徑中未知羥化步驟的羥化酶基因克隆，以及利用合成生物學(xué)技術(shù)實(shí)現(xiàn)紫杉醇的大量生產(chǎn)提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞:紫杉醇，生物合成，羥化酶，研究進(jìn)展

Received: September 13, 2015; Accepted: November 13, 2015

Supported by: The Specialized Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education (No. 20120142130009), Independent Innovation Fund Project of Huazhong University of Science and Technology (No. 2013TS079).

高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項科研基金 (No. 20120142130009)，華中科技大學(xué)校自主創(chuàng)新基金 (No. 2013TS079) 資助。

紫杉醇是從紅豆杉中分離得到的一種萜類化合物，能促進(jìn)微管形成和穩(wěn)定，并阻止其解聚，從而達(dá)到阻止癌細(xì)胞分裂的目的，對乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤等都具有明顯療效[1]，市場供需矛盾突出。紫杉醇在紅豆杉樹皮中的含量最高，也僅為萬分之六左右，天然提取導(dǎo)致了紅豆杉資源的毀滅性破壞。因此，人們一直在致力于開發(fā)獲取紫杉醇的新途徑。目前，化學(xué)合成、化學(xué)半合成、植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)法、內(nèi)生真菌合成等新途徑的探索都相繼展開。其中，化學(xué)合成途徑較早打通，但因其步驟多且收率低沒有進(jìn)一步商業(yè)化意義；而化學(xué)半合成是以紅豆杉枝葉中的10-去乙?；涂ㄍあ?、巴卡亭Ⅲ等前體通過化學(xué)合成得到紫杉醇，由于該途徑的本質(zhì)依然要依賴紅豆杉資源，其發(fā)展同樣受限；紅豆杉細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)和內(nèi)生真菌發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇是人們一直致力于取得突破的途徑，但仍然未取得重大突破。

隨著代謝工程尤其是合成生物學(xué)新技術(shù)的蓬勃發(fā)展，青蒿素、人參皂甙等重要天然產(chǎn)物已成功實(shí)現(xiàn)異源大量合成[2-3]。Ajikumar等[4]通過多功能模塊優(yōu)化手段在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了紫杉醇重要前體紫杉二烯的高量表達(dá)，將利用合成生物學(xué)技術(shù)大量生產(chǎn)紫杉醇新途徑的實(shí)現(xiàn)推進(jìn)了一大步。同時指出紫杉二烯以后的有效羥化反應(yīng)的解析是當(dāng)今的研究難點(diǎn)，這也是限制利用合成生物學(xué)方式大量生產(chǎn)紫杉醇的瓶頸問題。隨著紫杉醇合成途徑中相關(guān)羥化酶基因的克隆與鑒定，利用合成生物學(xué)生產(chǎn)紫杉醇有望取得突破。

本文對紫杉醇合成途徑進(jìn)行了綜述，并對其中羥化酶的克隆及功能研究進(jìn)行了深入探討，以期為紫杉醇合成途徑中紫杉二烯后續(xù)的相關(guān)羥化酶基因克隆，以及利用合成生物學(xué)技術(shù)實(shí)現(xiàn)紫杉醇的大量生產(chǎn)提供依據(jù)。

1　紫杉醇生物合成途徑

紅豆杉中紫杉醇的生物合成途徑分為3個部分 (圖1)：一是合成萜類化合物的通用前體異戊烯焦磷酸 (IPP) 和甲基丙烯基焦磷酸(DMAPP)；二是以GGPPS為起點(diǎn)經(jīng)過約20步酶促反應(yīng)合成紫杉醇前體10-去乙?；涂ㄍあ?(10-deacety baccatin Ⅲ) 或巴卡亭Ⅲ (Baccatin Ⅲ)；三是C-13苯基異絲氨酸側(cè)鏈組裝至巴卡亭Ⅲ形成紫杉醇。以上3個部分中，第一部分和第三部分的合成過程及相關(guān)酶已基本解析，第二部分的具體過程還未完全清楚。第一部分中，IPP和DMAPP通常可認(rèn)為是由位于質(zhì)體的非甲羥戊酸途徑 (2-C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸，2-C-methyl-D-eythritol-4-phosphate, MEP) 和位于胞質(zhì)中的甲羥戊酸 (又名甲瓦龍酸，mevalonic acid, MVA) 途徑合成[5]。但對于紫杉醇合成前體的來源還沒有定論，僅有用上述2條途徑抑制劑分別處理紅豆杉細(xì)胞后紫杉醇合成均受到抑制的報道[6-7]。MEP和MVA途徑中的所有基因在植物中都已被克隆得到。第三部分中，C-13苯基異絲氨酸側(cè)鏈起源、側(cè)鏈的連結(jié)次序和方式、組裝至巴卡亭Ⅲ形成紫杉醇的路徑都已清楚，絕大部分相關(guān)酶也已被克隆[8-12]。此外，紫杉醇手性側(cè)鏈合成和紫杉醇的半合成技術(shù)已非常成熟[13]。第二部分中，首先是GGPP在紫杉二烯合成酶催化下環(huán)化形成紫杉醇的三環(huán)二萜骨架結(jié)構(gòu)紫杉4(5), 11(12) 二烯，接著在C1、C2、C4、C5、C7、C9、C10和C13位發(fā)生羥基化，羥基上再進(jìn)行?；?、酮基化，以及形成環(huán)氧丙烷，最終形成巴卡亭Ⅲ[14]。

圖1　紫杉醇生物合成途徑[15,18]Fig. 1 Taxol biosynthetic pathway[15,18]. TASY: taxadiene synthase; T5αH: cytochrome P450 taxadiene-5αhydroxylase; T13αH: taxoid 13α-hydroxylase; TDAT: taxadiene-5α-ol-o-acetyl transferase; T10βH: taxoid 10β-hydroxylase; DBT: 2α-O-benzoyl transferase; DBAT: 10-deacetyl-baccatin III-10-O-acetyl transferase; BAPT: C-13-phenylpropanoyl-CoA transferase; PAM: phenylalanine aminomutase; DBTNBT: 3’-N-debenzoyl-2’-deoxytaxol N-benzoyl transferase.

但紫杉醇的生物合成是一個復(fù)雜的代謝網(wǎng)絡(luò)而非線性途徑，第二部分反應(yīng)中的酶僅有部分已克隆，而且上述8個羥化位點(diǎn)的反應(yīng)次序以及參與酶的底物特異性仍不明確[15]?，F(xiàn)在比較清楚的是首先在C5位上由細(xì)胞色素P450單加氧酶催化引入羥基，并發(fā)生丙烯基重排，生成紫杉-4(20),11(12)-二烯-5α-醇[16]，接著有兩種推測反應(yīng)的報道：一是此萜烯中間體在5α羥基上發(fā)生乙?；磻?yīng)形成乙酸紫杉-4(20),11(12)-二烯-5α-酯，再在10位上發(fā)生羥化；二是此萜烯中間體在13位上發(fā)生羥化。對于其他位點(diǎn)C1、C2、C4、C7、C9位發(fā)生的羥基化作用，4,5-環(huán)氧丙烷環(huán)的形成，C2、C5、C10位羥基上的?；虲9位的酮基化，以及因中間產(chǎn)物在細(xì)胞器之間運(yùn)輸而被暫時?；腿ヵ；磻?yīng)發(fā)生的順序尚不明確[17-18]。且有三步反應(yīng)C1位、C4位和C9位的羥化酶基因至今尚未見報道[19]。因此，紫杉醇生物合成途徑中的細(xì)胞色素P450羥化酶的進(jìn)一步研究，將有助于利用合成生物學(xué)手段大量獲得紫杉醇的實(shí)現(xiàn)。

2　紫杉醇生物合成相關(guān)的羥化酶的鑒定及特征分析

細(xì)胞色素P450 (Cytochrome P450，P450s)是一類在動物、植物、細(xì)菌及真菌中擁有廣泛功能的含有血紅素的氧化酶類，其還原型與CO結(jié)合后在波長450 nm處有最大吸收峰，因此命名為細(xì)胞色素P450。P450自1969年首次發(fā)現(xiàn)至今，已有超過69 000篇關(guān)于其研究的文章發(fā)表，1 091個不同家族的基因被挖掘。細(xì)胞色素P450在植物體內(nèi)主要有兩大功能：參與次級代謝物(萜類、植物激素、甾醇、黃酮等) 的生物合成；降解外源有毒物質(zhì)如農(nóng)藥、除草劑等[20-22]。

紫杉醇合成過程中，其母核紫杉二烯需經(jīng)8個碳位的有效羥化，分別是C1位、C2位、C4位、C5位、C7位、C9位、C10位、C13位，其中部分碳位的羥化酶基因已被克隆驗證。Eisenreich等[23]證實(shí)紫杉烷環(huán)上的所有羥基化反應(yīng)均由依賴細(xì)胞色素P450的單加氧酶類催化完成。本文對這些羥化酶基因的克隆及功能研究進(jìn)行了綜述，以期為新的羥化酶基因的挖掘提供依據(jù)。

2.1紫杉烷5α-羥化酶

Jennewein等[24]基于PERF模體、血紅素結(jié)合元件、必有半胱氨酸等保守特征，采用同源克隆的方法從誘導(dǎo)過的紅豆杉細(xì)胞文庫中得到候選基因，并在釀酒酵母WAT11菌株中異源表達(dá)進(jìn)行功能研究。WAT11菌株擁有1個來源于擬南芥的CPR基因，完善了電子傳遞系統(tǒng)，可使植物P450高效表達(dá)并具有好的催化活性。通過體內(nèi)飼喂的方法添加系列外源底物研究酶活性，發(fā)現(xiàn)只有兩種紫杉烯異構(gòu)體底物轉(zhuǎn)化成了極性化合物，90%以上產(chǎn)物是5α-羥基-紫杉二烯。紫杉烷-5α-羥基化酶在紫杉醇母核骨架C5位置特異性地加入一個羥基，同時催化C4(5)的雙鍵轉(zhuǎn)移到C4(20) 位置上，從而將紫杉-4(5), 11(12)-二烯羥化為5α-羥基-紫杉-4(20),11(12)-二烯。

2.2紫杉烷10β-羥化酶與紫杉烷13α-羥化酶

由于反向基因克隆獲取P450基因的可行性有限，研究者們利用誘導(dǎo)處理的紅豆杉細(xì)胞為材料，發(fā)展了一種基于mRNA反轉(zhuǎn)錄PCR差異顯示 (DD-RT-PCR) 的方法，得到了13個與P450相關(guān)的特定全長序列[25]。將這些基因在酵母中異源表達(dá)，結(jié)合原位分光光度法和體內(nèi)飼喂紫杉烷類底物來研究酶活性，成功發(fā)掘了系列紫杉類代謝酶以及一個紫杉烷10β-羥化酶。在紫杉烷10β-羥化酶的研究中，候選基因酵母表達(dá)后飼喂5α-乙酰氧基-紫杉-4(20),11(12)-二烯，10β-羥化酶能將其轉(zhuǎn)化為5α-乙酰氧基-10β-羥基-紫杉-4(20),11(12)-二烯。

采取同樣的方法，酵母異源表達(dá)并未成功篩選出紫杉烷13α-羥化酶。研究者們改用草地夜蛾桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)，以5α-羥基-紫杉二烯及其乙酸酯為飼喂底物，據(jù)相應(yīng)的重組酶催化產(chǎn)品的色譜及光譜學(xué)特性成功鑒定到一個紫杉烷13α-羥化酶基因。該酶具有高度的區(qū)域特異性和立體結(jié)構(gòu)特異性，只催化5α-羥基-紫杉-4(20),11(12)-二烯反應(yīng)生成5α,13α-二羥基-紫杉-4(20),11(12)-二烯[26]。

2.3紫杉烷2α-羥化酶和紫杉烷7β-羥化酶

由于羥化順序尚未精確鑒定，使得紫杉醇生物合成中間羥化步驟難以解析，同時，高度官能團(tuán)化的紫杉烷底物較難獲取，阻礙了羥化酶的研究進(jìn)展。研究者選用支流紫杉烷作為替代底物，如紫杉素 (5α, 9α, 10β, 13α-四乙酰氧基-紫杉-4(20),11(12)-二烯)，用以研究紫杉烷2α-羥化酶和紫杉烷7β-羥化酶，具體研究方法類5α-羥化酶的研究體系[27-28]。

紫杉烷2α-羥化酶和紫杉烷7β-羥化酶兩者都能利用紫杉素作為底物，而且能互相將各自的羥基化物氧化，獲得同一個產(chǎn)物2α, 7β-二羥基-紫杉素。

2.4紫杉烷9α-羥化酶

紫杉烷9α-羥化酶候選基因曾在酵母中表達(dá)并以5a-乙酰氧基-紫杉-4(20),11(12)-二烯為底物進(jìn)行研究，但產(chǎn)物NMR檢測并未得陽性結(jié)果，當(dāng)時認(rèn)為是產(chǎn)物合成不足所致，也有可能是表達(dá)體系不當(dāng)或者酶底物特異性較高 (底物使用不準(zhǔn)確) 等原因。Dai等[29]發(fā)現(xiàn)銀杏懸浮細(xì)胞可催化2α, 5α,10β, 14β-四乙酰氧基-紫杉-4(20),11(12)-二烯 (Sinenxan A，縮寫SIA) 形成9α-羥基-SIA。2013年，Zhang等[30]從銀杏轉(zhuǎn)錄組中找到候選基因 (KF773141)，體外表達(dá)蛋白并以SIA為底物成功驗證出該酶具有上述的C-9位羥化活性，該基因全長1 458 bp，編碼485個氨基酸，蛋白分子量54.841 9 kDa，擁有細(xì)胞色素P450典型保守特征。

2.5紫杉烷14β-羥化酶

Jennewein等[31]克隆驗證的紫杉烷14β-羥化酶能使5α-乙酰氧基-10β-羥基-紫杉-4(20),11(12)-二烯轉(zhuǎn)化生成5α-乙酰氧基-10β,14β-二羥-紫杉-4(20),11(12)-二烯，但對5α,13α-二羥基-紫杉-4(20),11(12)-二烯沒有作用。紫杉烷14β-羥化酶基因在紅豆杉誘導(dǎo)cDNA文庫中豐度較高 (1.5‰)，考慮到在紫杉烷的結(jié)構(gòu)中，14位并沒有被氧化，因此，推斷該酶并未參與紫杉醇生物合成，但參與紫杉烷類的支路合成途徑，作用于早期代謝分支流向14β-羥基-紫杉烷 (如云南紫杉烷C)，而這類紫杉烷在紅豆杉細(xì)胞紫杉烷提取物中占主要成分，抑制該酶活性或許可以增加紫杉醇代謝流。

綜上可以看出，紫杉醇生物合成過程中的羥化酶研究已取得一些進(jìn)展，已克隆了5位、2位、7位、10位、13位羥化酶基因，同時建立了體外表達(dá)細(xì)胞色素P450中的氧化酶并實(shí)現(xiàn)相應(yīng)底物的不同位點(diǎn)的羥基化的研究體系，為進(jìn)一步研究這些羥化酶的羥化順序及對應(yīng)的特異性羥化酶打下了基礎(chǔ)，同時為進(jìn)一步挖掘新的羥化酶提供了線索。但目前GenBank中登錄的紫杉烷羥化酶全長基因有18個，催化C5位的羥化酶有4個，C2位的2個，C7位的4個，C10位的4個，C13位的4個，但上述催化同一位點(diǎn)的羥化酶中哪個效率最高，未見系統(tǒng)研究。另外，關(guān)于紫杉醇合成過程中羥化酶基因的作用順序，比較肯定的是在紫杉二烯形成之后，首先C5位進(jìn)行羥化，之后的順序僅Wheeler等[32]根據(jù)紅豆杉細(xì)胞內(nèi)合成的紫杉烷的數(shù)量，推測紫杉烷母核發(fā)生羥化的可能順序是C10，接著是C2和C9，之后是C13，最后是C7和C1。因此，除C5位紫杉二烯羥化在其他各位點(diǎn)羥化之前已確定外，其他位點(diǎn)的羥化順序及對應(yīng)的特異性羥化酶尚不清楚，有待進(jìn)一步研究，而獲得全面的羥化酶序列是開展此研究的前提。

2.6紫杉醇生物合成相關(guān)的P450羥化酶特征分析

本課題組前期利用RNA-seq技術(shù)對紅豆杉細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，共發(fā)現(xiàn)了266個細(xì)胞色素P450酶基因序列，大部分植物中獨(dú)有的CYP亞家族均有發(fā)現(xiàn)。為從中篩選挖掘新的候選羥化酶，對已克隆的C2、C5、C7、C10和C13位羥化酶特征進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)這些羥化酶基因均存在細(xì)胞色素P450典型保守特征 (表1)，如：分子量約54–57 kDa，血紅素結(jié)合域PFG(第420個氨基酸左右)，氧化還原結(jié)合模體PERF或PSRF (第410個氨基酸左右)，必有半胱氨酸C (第440個氨基酸)，EXXR鹽橋 (第360個氨基酸左右)。據(jù)此，對266個片段進(jìn)行亞家族分類，共發(fā)現(xiàn)歸屬于CYP716和CYP725亞家族的基因片段共有35個，包括了GenBank中登錄的18個全長基因及17個未知功能的CYP450家族基因，為篩選紫杉醇母核有效羥化位點(diǎn)的特異羥化酶基因打下了基礎(chǔ)。

表1　已知紫杉烷羥化酶的保守特征Table 1 The conservative feature of known taxane hydroxylase

3　P450羥化酶功能研究體系

細(xì)胞色素P450羥化酶基因功能研究時，常用原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行異源表達(dá)獲得有活性蛋白，進(jìn)而采用體外反應(yīng)體系進(jìn)行功能驗證?，F(xiàn)對不同表達(dá)體系的特征、適應(yīng)性、注意事項綜述如下，為P450羥化酶基因的表達(dá)及功能研究提供依據(jù)。

3.1原核表達(dá)系統(tǒng)

原核表達(dá)宿主大腸桿菌的遺傳背景清楚，具有周期短、操作方便、表達(dá)水平高和成本較低等優(yōu)點(diǎn)，是表達(dá)外源蛋白使用最多的底盤細(xì)胞[33-34]。許多研究利用該系統(tǒng)成功對系列P450羥化酶進(jìn)行表達(dá)，獲得了有活性的蛋白。Barnes研究組首次成功用E. coli表達(dá)出有催化活性的CYP17A1，為P450在細(xì)菌中的表達(dá)奠定了基礎(chǔ)[35]；Sueyoshi等[36]在E. coli中成功表達(dá)出小鼠CYP2A4蛋白；此外，人類基因組中發(fā)現(xiàn)的57種P450酶中有接近一半 (26種) 在大腸桿菌中成功表達(dá)，部分蛋白已用X射線晶體學(xué)確定其三維結(jié)構(gòu)，該系列工作有利于指導(dǎo)異源表達(dá)策略的研究。但是原核表達(dá)系統(tǒng)的產(chǎn)物往往不能有效地加工和修飾，從而影響了表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)與功能，表達(dá)的蛋白活性降低甚至沒有活性。此外大腸桿菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素也會導(dǎo)致目標(biāo)蛋白表達(dá)不成功。研究者們通常對其cDNA進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎?，如：末端修飾，密碼子替換等，來避免這些缺點(diǎn)[37-39]。近年來，利用大腸桿菌生物合成紫杉醇的研究取得了一定進(jìn)展。通過優(yōu)化啟動子、增加相關(guān)基因的拷貝數(shù)、模塊多元化等策略，成功在大腸桿菌中過量表達(dá)紫杉二烯合成酶和紫杉烷5α-羥化酶，紫杉二烯和5α-羥基-紫杉二烯的產(chǎn)量分別達(dá)到1.02 g/L和58 mg/L[4]。

3.2真核表達(dá)系統(tǒng)

真核表達(dá)系統(tǒng)包括酵母、昆蟲和哺乳動物細(xì)胞等，具有翻譯后的加工修飾體系，表達(dá)的外源蛋白構(gòu)象上更接近天然蛋白質(zhì)，但又有蛋白表達(dá)成本高、操作復(fù)雜、表達(dá)量較低等缺點(diǎn)[40-43]。酵母具有十分完整的細(xì)胞、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu) (例如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等)，其內(nèi)源的CPR可以支持電子向P450傳送，對P450酶的功能鑒定具有十分重要的作用。此外，酵母有多個選擇標(biāo)記和營養(yǎng)缺陷型可供選擇[44-46]。目前已有小鼠、大鼠以及人的若干P450酶在酵母中表達(dá)；在已報道的紫杉醇生物合成細(xì)胞色素P450羥化酶中，大部分候選基因均通過酵母表達(dá)并具有酶活性；昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)具有能較為正確的進(jìn)行蛋白糖基化、分泌和組織定位表達(dá)、蛋白表達(dá)量較高等特點(diǎn)，如CYP2C9在昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)蛋白的活性比在人淋巴細(xì)胞中表達(dá)的活性提高7或8倍[47]。哺乳動物細(xì)胞的CYP本底含量高，重組蛋白表達(dá)量相對較低，但細(xì)胞中含有輔助因子CPR和細(xì)胞色素B5等，已被用于表達(dá)CYP蛋白的哺乳動物細(xì)胞系種類廣泛，如人細(xì)胞系、小鼠細(xì)胞系Hepalclc，BALB3T3等、大鼠細(xì)胞系RLE(肝上皮細(xì)胞系) 和PC-12 (腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞系) 等[48]。這些研究為新的細(xì)胞色素P450酶的克隆與表達(dá)提供了線索。

在紫杉醇生物合成相關(guān)的P450酶研究中，除了克隆驗證出5個碳位對應(yīng)的酶基因外，也有研究者對紫杉烯羥化物的異源合成進(jìn)行了探索。Dejong等[49]在酵母細(xì)胞中表達(dá)了紫杉醇生物合成相關(guān)的8個基因，紫杉烯的產(chǎn)量為1 mg/L，而5α-羥基紫杉二烯的產(chǎn)量僅可檢測，說明細(xì)胞色素P450 5α-羥基化酶活性為代謝瓶頸。Ajikuma等[4]在已構(gòu)建的產(chǎn)紫杉二烯大腸桿菌工程菌基礎(chǔ)上，通過多功能模塊工程手段構(gòu)建了紫杉烯 5α-羥基化酶和細(xì)胞色素P450-還原酶的融合基因，5α-羥基-紫杉二烯的產(chǎn)量達(dá)

58 mg/L，是酵母表達(dá)系統(tǒng)的2 400倍。近來，該實(shí)驗室開發(fā)了一種大腸桿菌與酵母工程菌共培養(yǎng)合成紫杉醇的技術(shù)，發(fā)現(xiàn)將含有紫杉烷5α-羥化酶及其還原酶基因CPR的酵母與含有紫杉二烯合成酶基因 (TS) 的大腸桿菌共培養(yǎng)72 h后，5α-羥基-紫杉二烯的產(chǎn)量為2 mg/L。他們對該共培養(yǎng)體系進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化，使得5α-羥基-紫杉二烯的產(chǎn)量提高到了33 mg/L。而再向該共培養(yǎng)體系的酵母工程菌中引入5α-羥基-紫杉二烯乙?；D(zhuǎn)移酶基因 (Taxadien-5α-olacetyltransferase gene) 和紫杉烷 10β-羥化酶基因共培養(yǎng)后，每升培養(yǎng)物中5α-乙酰氧基-10β-羥基-紫杉二烯 (Taxadien-5α-acetate-10β-ol) 的產(chǎn)量達(dá)到了30 mg/L[50]。這些研究為體外研究羥化酶的羥化順序及特異性提供了參考。

4　展望

不同碳位羥化酶的典型保守特征、底物特異性的差別、酶促形式和酶促活性的不同，反映出紫杉醇生物合成獨(dú)有羥化酶亞家族(CYP725) 的多面性。整個紫杉醇生物合成羥化酶的發(fā)掘歷程閃耀著研究者們的智慧光芒，同源克隆與mRNA差異顯示反轉(zhuǎn)錄PCR等基因克隆策略的運(yùn)用，酵母或草地夜蛾桿狀病毒等酶蛋白表達(dá)系統(tǒng)的利用，以及替代底物的使用，大大豐富了羥化酶研究的理念，亦為紫杉醇其余碳位羥化酶的克隆及功能驗證夯實(shí)了基礎(chǔ)。

紫杉烷羥化酶的研究雖然已取得了一些進(jìn)展，但由于其分布廣泛性和功能多樣性，以及缺乏現(xiàn)成的反應(yīng)底物，使得徹底解析紫杉醇生物合成的羥化步驟仍然是一個巨大挑戰(zhàn)。在未來的研究中，我們可以從兩方面入手：1) 對釀酒酵母WAT11上游代謝途徑進(jìn)行改造，提高紫杉二烯的產(chǎn)量。然后在該酵母菌株中導(dǎo)入相關(guān)的羥化酶基因，誘導(dǎo)培養(yǎng)后，檢測產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，從而確定該羥化酶基因的功能。2) 將羥化酶基因在釀酒酵母WAT11中異源表達(dá)，喂食可獲得的紫杉烷類物質(zhì)，誘導(dǎo)培養(yǎng)，再通過液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)，核磁共振 (NMR) 檢測物質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化反映該基因的功能。

隨著轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的興起，生物信息學(xué)方法的日益成熟，酶學(xué)理念的完善以及其他相關(guān)生物學(xué)科的發(fā)展，將加速紫杉醇有效羥化步驟的解析。本課題組從紅豆杉細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組中篩選獲得了系列紫杉醇母核有效羥化的細(xì)胞色素P450氧化酶候選基因，并克隆獲得了4個新的候選基因[51]。課題組的下一步研究思路是利用無細(xì)胞體系對羥化酶功能及羥化順序進(jìn)行研究，具體是先將紫杉二烯合成酶與5-羥紫杉二烯酶基因共轉(zhuǎn)化酵母，體系中添加GGPP底物合成5-羥基-紫杉二烯；利用酵母分別構(gòu)建并表達(dá)其他羥化酶；再采用單獨(dú)或組合的羥化酶無細(xì)胞體系對5-羥基-紫杉二烯進(jìn)行催化，通過產(chǎn)物確認(rèn)位點(diǎn)特異性羥化酶及其催化順序；再進(jìn)一步優(yōu)化不同羥化酶組合模塊，在酵母中實(shí)現(xiàn)紫杉醇母核的有效羥化，為最終合成有效?；仙纪榈於▓詫?shí)基礎(chǔ)。相信在不久的將來，紫杉醇生物合成的整個途徑會得到徹底的攻破，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化不是夢。

REFERENCES

[1] De Furia MD. Paclitaxel (Taxol): a new natural product with major anticancer activity. Phytomedicine, 1997, 4(3): 273–282.

[2] Ro DK, Paradise EM, Ouellet M, et al. Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in engineered yeast. Nature, 2006, 440(7086): 940–943.

[3] Yan X, Fan Y, Wei W, et al. Production of bioactive ginsenoside compound K in metabolically engineered yeast. Cell Res, 2014, 24(6): 770–773.

[4] Ajikumar PK, Xiao WH, Tyo KEJ, et al. Isoprenoid pathway optimization for taxol precursor overproduction in Escherichia coli. Science, 2010, 330(6000): 70–74.

[5] Roberts SC. Production and engineering of terpenoids in plant cell culture. Nat Chem Biol, 2007, 3(7): 387–395.

[6] Liu Z, Yu LJ, Li CY, et al. Effects of fosmidomycin and lovastatin treatment on taxol biosynthesis in suspension culture cells of Taxus chinensis. J Plant Physiol Mol Biol, 2005, 31(2): 199–204 (in Chinese).劉智, 余龍江, 李春艷, 等. 磷甘霉素和洛伐它汀處理對中國紅豆杉懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生物合成紫杉醇的影響. 植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報, 2005, 31(2): 199–204.

[7] Malik S, Cusidó RM, Mirjalili MH, et al. Production of the anticancer drug taxol in Taxus baccata suspension cultures: a review. Process Biochem, 2011, 46(1): 23–34.

[8] Fleming PE, Mocek U, Floss HG. Biosynthesis of taxoids. Mode of formation of the taxol side chain. J Am Chem Soc, 1993, 115(2): 805–807.

[9] Walker KD, Floss HG. Detection of a phenylalanine aminomutase in cell-free extracts of Taxus brevifolia and preliminary characterization of its reaction. J Am Chem Soc, 1998, 120(21): 5333–5334.

[10] Miller RW. A brief survey of Taxus alkaloids and other taxane derivatives. J Nat Prod, 1980, 43(4): 425–437.

[11] Guéritte-Voegelein F, Guénard D, Potier P. Taxol and derivatives: a biogenetic hypothesis. J Nat Prod, 1987, 50(1): 9–18.

[12] Fleming PE, Knaggs AR, He XG. Biosynthesis of taxoids. Mode of attachment of the taxol side chain. J Am Chem Soc, 1994, 116(9): 4137–4138.

[13] Yan JQ. Chiral synthesis of the taxol side chain and semisynthesis of taxol. Fine Spec Chem, 2005, 13(18): 1–6 (in Chinese).閻家麒. 紫杉醇手性側(cè)鏈合成與紫杉醇半合成. 精細(xì)與專用化學(xué)品, 2005, 13(18): 1–6.

[14] Croteau R, Hefner J, Hezari M. Phytochemicals and health. Curr Top Plant Physiol, 1995, 15: 95–104. [15] Croteau R, Ketchum REB, Long RM, et al. Taxol biosynthesis and molecular genetics. Phytochem Rev, 2006, 5(1): 75–97.

[16] Hefner J, Rubenstein SM, Ketchum REB, et al. Cytochrome P450-catalyzed hydroxylation of taxa-4(5), 11(12)-diene to taxa-4(20), 11(12)-dien-5α-ol: the first oxygenation step in taxol biosynthesis. Chem Biol, 1996, 3(6): 479–489.

[17] Walker K, Ketchum REB, Hezari M, et al. Partial purification and charaterization of acetyl coenzyme A: taxa-4 (20), 11(12)-dien-5α-ol-O-acetyl transferase that catalyzes the first acytation step of taxol biosynthesis. Arch Biochem Biophys, 1999, 364: 273–279.

[18] Howat S, Park B, Oh IS, et al. Paclitaxel: biosynthesis, production and future prospects. New Biotechnol, 2014, 31(3): 242–245.

[19] Qiu DY, Zhang B, Yang YF, et al. History, current status and the prospects of taxol biosynthesis research. Biotechnol Bull, 2015, 31(4): 56–64 (in Chinese).邱德有, 張彬, 楊艷芳, 等. 紫杉醇生物合成研究歷史、現(xiàn)狀及展望. 生物技術(shù)通報, 2015, 31(4): 56–64.

[20] Omura T. Forty years of cytochrome P450. Biochem Biophys Res Commun, 1999, 266(3): 690–698.

[21] Schuler MA, Werck-Reichhart D. Functionalgenomics of P450s. Annu Rev Plant Biol, 2003, 54(1): 629–667.

[22] Nelson DR, Ming R, Alam M, et al. Comparison of cytochrome P450 genes from six plant genomes. Trop Plant Biol, 2008, 1(3/4): 216–235.

[23] Eisenreich W, Menhard B, Lee MS. Multiple oxygenase reactions in the biosynthesis of taxoids. J Am Chem Soc, 1998, 120(37): 9694–9695.

[24] Jennewein S, Long RM, Williams RM, et al. Cytochrome P450 taxadiene 5α-hydroxylase, a mechanistically unusual monooxygenase catalyzing the first oxygenation step of taxol biosynthesis. Chem Biol, 2004, 11(3): 379–387.

[25] Schoendorf A, Rithner CD, Williams RM, et al. Molecular cloning of a cytochrome P450 taxane 10β-hydroxylase cDNA from Taxus and functional expression in yeast. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98(4): 1501–1506.

[26] Jennewein S, Rithner CD, Williams RM, et al. Taxol biosynthesis: taxane 13α-hydroxylase is a cytochrome P450-dependent monooxygenase. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98(24): 13595–13600.

[27] Chau M, Croteau R. Molecular cloning and characterization of a cytochrome P450 taxoid 2α-hydroxylase involved in taxol biosynthesis. Arch Biochem Biophys, 2004, 427(1): 48–57.

[28] Chau M, Jennewein S, Walker K, et al. Taxol biosynthesis: molecular cloning and characterization of a cytochrome P450 taxoid 7β-hydroxylase. Chem Biol, 2004, 11(5): 663–672.

[29] Dai JG, Guo HZ, Lu DD, et al. Biotransformation of 2α, 5α, 10β, 14β-tetra-acetoxy-4(20), 11-taxadiene by Ginkgo cell suspension cultures. Tetrahedron Lett, 2001, 42(28): 4677–4679.

[30] Zhang N, Han ZT, Sun GL, et al. Molecular cloning and characterization of a cytochrome P450 taxoid 9α-hydroxylase in Ginkgo biloba cells. Biochem Biophys Res Commun, 2014, 443(3): 938–943.

[31] Jennewein S, Rither CD, Williams RM, et al. Taxoid metabolism: taxoid 14β-hydroxylase is a cytochrome P450-dependent monooxygenase. Arch Biochem Biophys, 2003, 413(2): 262–270.

[32] Wheeler AL, Long RM, Ketchum REB, et al. Taxol biosynthesis: differential transformations of taxadien-5α-ol and its acetate ester by cytochrome P450 hydroxylases from Taxus suspension cells. Arch Biochem Biophys, 2001, 390(2): 265–278.

[33] Friedberg T, Pritchard MP, Bandera M, et al. Merits and limitations of recombinant models for the study of human P450-mediated drug metabolism and toxicity: an intra-laboratory comparison. Drug Metab Rev, 1999, 31(2): 523–544.

[34] Wang JM, Liu W, Xu X, et al. Progress in engineering Escherichia coli for production of high-value added organic acids and alcohols. Chin J Biotech, 2013, 29(10): 1363?1373 (in Chinese).王紀(jì)明, 劉煒, 徐鑫, 等. 工程大腸桿菌生產(chǎn)高附加值有機(jī)酸、醇研究進(jìn)展. 生物工程學(xué)報, 2013, 29(10): 1363–1373.

[35] Barnes HJ, Arlotto MP, Waterman MR. Expression and enzymatic activity of recombinant cytochrome P450 17 alpha-hydroxylase in Escherichia coli. Proc Natl Acad USA, 1991, 88(13): 5597-5601.

[36] Sueyoshi T, Park LJ, Moore R, et al. Molecular engineering of microsomal P450 2a-4 to a stable, water-soluble enzyme. Arch Biochem Biophys, 1995, 322(1): 265?271.

[37] Zhu LQ, Lou JS. Resent studies on cytochrome P450 and drug metabolism. Chin J Clin Pharmacol Ther, 2004, 9(10): 1081–1086 (in Chinese).朱立勤, 婁建石. 細(xì)胞色素P450與藥物代謝的研究現(xiàn)狀. 中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué), 2004, 9(10): 1081–1086.

[38] Sandhu P, Baba T, Guengerich FP. Expression of modified cytochrome P450 2C10 (2C9) in Echerichia coli, purification, and reconstitution of catalytic activity. Arch Biochem Biophys, 1993, 306(2): 443–450.

[39] Larson JR, Coon MJ, Porter TD. Alcohol-inducible cytochrome P-450IIE1lacking the hydrophobic NH2-terminal segment retains catalytic activity and is membrane-bound when expressed in Escherichia coli. J Biol Chem, 1991, 266(12): 7321–7324.

[40] Gellissen G, Janowicz ZA, Merkelbach A. Heterologous gene expression in Hansenula polymopha: efficient secretion glucoamylase. Nat Biotechnol, 1991, 9(3): 291–295.

[41] Li XY, Zhang JB, Ren WZ, et al. Application of yeast two-hybrid system in protein interaction. J Tradit Chin Vet Med, 2011, 30(1): 26–28 (in Chinese).李向陽, 張嘉保, 任文郅, 等. 酵母雙雜交系統(tǒng)在蛋白質(zhì)相互作用中的應(yīng)用. 中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志, 2011, 30(1): 26–28. .

[42] Hitchman RB, Possee RD, Crombie AT, et al. Genetic modification of a baculovirus vector for increased expression in insect cells. Cell Biol Toxicol, 2010, 26(1): 57–68.

[43] Soler E, Saux AL, Guinut F, et al. Production of two vaccinating recombinant rotavirus proteins in the milk of transgenic rabbits. Transgenic Res, 2005, 14(6): 833–844.

[44] Julsing MK, Koulman A, Woerdenbag HJ, et al. Combinatorial biosynthesis of medicinal plant secondary metabolites. Biomol Eng, 2006, 23(6): 265–279.

[45] Chemler JA, Yan YJ, Koffas MA. Biosynthesis of isoprenoids, polyunsaturated fatty acids and flavonoids in Saccharomyces cerevisiae. Microb Cell Fact, 2006, 5(1): 20–28.

[46] Wang W, Meng C, Zhu P, et al. Preliminary study on metabolic engineering of yeast for producing taxadiene. China Biotechnol, 2005, 25(8): 103–108 (in Chinese).王偉, 孟超, 朱平, 等. 代謝工程酵母菌合成紫杉烯的研究. 中國生物工程雜志, 2005, 25(8): 103–108.

[47] Grogan J, Shou MG, Andrusiak EA, et al. Cytochrome P450 2A1, 2E1, and 2C9 cDNA-expression by insect cells and partial purification using hydrophobic chromatography. Biochem Pharmacol, 1995, 50(9): 1509–1515.

[48] Sawada M, Kamataki T. Genetically engineered cells stably expressing cytochrome P450 and their application to mutagen assays. Mutat Res, 1998, 411(1): 19–43.

[49] Dejong JM, Liu YL, Bollon AP, et al. Genetic engineering of taxol biosynthetic genes in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol Bioeng, 2006, 93(2): 212–224.

[50] Zhou K, Qiao KJ, Edgar S, et al. Distributing a metabolic pathway among a microbial consortium enhances production of natural products. Nat Biotechnol, 2015, 33(4): 377–383.

[51] Chen QP. Cloning and function analysis of new hydroxylase in Taxus chinensis[D]. Wuhan: Huazhong University of Science and Technology, 2015 (in Chinese).陳清浦. 中國紅豆杉中新的羥化酶基因克隆與功能分析[D]. 武漢: 華中科技大學(xué), 2015.

(本文責(zé)編 郝麗芳)

Research progress in hydroxylase in taxol biosynthetic pathway

Qingpu Chen1, Weifang Liao1, Chunhua Fu1,2, Chunfang Zhao1,2, and Longjiang Yu1,2
1 Department of Biotechnology, College of Life Science and Technology, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430074, Hubei, China
2 Key Laboratory of Molecular Biophysics Ministry of Education, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430074, Hubei, China

Abstract:Taxol is a secondary metabolite with prominent anti-tumor activity, but the yield cannot meet the growing clinical demand due to lower content in yew. Now, most enzyme genes involved in taxol biosynthesis have been cloned andidentified, so that obtaining this drug by using synthetic biology method has become a hotspot in recent years. However, most hydroxylases involved in taxol biosynthetic pathway have not been explored. Here, we reviewed the progress on the biosynthesis pathway of taxol, especially concerning hydroxylase. The future research areas of taxol biosynthesis through synthetic biology were also discussed to provide basis for the discovery of uncharacterized hydroxylase genes and the mass taxol production by synthetic biology technology.

Keywords:taxol, biosynthesis, hydroxylase, research progress

Corresponding author:Longjiang Yu. Tel: +86-27-87792264; Fax: +86-27-87792265; E-mail: yulongjiang@hust.edu.cn