轉(zhuǎn)基因大豆豆粕外源基因和蛋白在SD大鼠體內(nèi)消化吸收分析

袁建琴，常泓，趙江河，史宗勇，王俊東

1 山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 0308012 山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷 030801

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轉(zhuǎn)基因大豆豆粕外源基因和蛋白在SD大鼠體內(nèi)消化吸收分析

袁建琴1，常泓1，趙江河1，史宗勇1，王俊東2

1 山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801
2 山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷 030801

袁建琴, 常泓, 趙江河, 等. 轉(zhuǎn)基因大豆豆粕外源基因和蛋白在SD大鼠體內(nèi)消化吸收分析. 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(5): 657–668.

Yuan JQ, Chang H, Zhao JH, et al. Analysis of exogenous gene and protein digestion and absorption of SD rats (Rattus norvegicus) fed roundup ready soybean meal. Chin J Biotech, 2016, 32(5): 657–668.

摘 要:為了評(píng)估轉(zhuǎn)基因抗草甘膦除草劑大豆的食用安全性，以20%的比例將轉(zhuǎn)基因抗草甘膦除草劑大豆GTS40-3-2和其親本非轉(zhuǎn)基因大豆A5403豆粕分別添加到基礎(chǔ)飼料中喂養(yǎng)兩代Sprague-Dawley (SD) 大鼠，采用定性、定量PCR和ELISA方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆成分相關(guān)基因和蛋白在長(zhǎng)期飼喂的大鼠體內(nèi)代謝殘留狀況。結(jié)果表明，大鼠喂養(yǎng)轉(zhuǎn)基因大豆豆粕后，除了大鼠腸糞和盲腸內(nèi)容物檢測(cè)到有轉(zhuǎn)基因成分的殘留，腸道菌群和實(shí)質(zhì)臟器均未發(fā)現(xiàn)相關(guān)基因和蛋白。結(jié)果提示，長(zhǎng)期飼喂轉(zhuǎn)基因抗草甘膦除草劑大豆GTS40-3-2與親本A5403大豆豆粕對(duì)SD大鼠具有同樣的食用安全性。

關(guān)鍵詞:抗草甘膦除草劑，轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2，SD大鼠，外源基因和蛋白，消化吸收

Received: December 13, 2015; Accepted: March 16, 2016

Supported by: Key Projects in the National Science and Technology Pillar Program during the Twelfth Five-Year Plan Period of China (No. 2012BAD12B06-2), Science and Technology Key Program of Shanxi Province (No. 20140311025-3), Natural Science Foundation of Shanxi Province (No. 2013011028-2), Higher School Teaching Reform Project of Shanxi Province (No. J2012026).

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃 (No. 2012BAD12B06-2)，山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目 (No. 20140311025-3)，山西省自然科學(xué)基金 (No. 2013011028-2)，山西省高等學(xué)校教學(xué)改革項(xiàng)目 (No. J2012026) 資助。

生物安全性問(wèn)題從轉(zhuǎn)基因作物誕生之日起就與之相伴，其爭(zhēng)論從未停止過(guò)[1]。譬如，受體的遺傳特性是否會(huì)受到外源目的基因?qū)氲牟僮鞫斐捎绊?；生物多態(tài)性、周?chē)鷳B(tài)環(huán)境、靶標(biāo)生物及與之相關(guān)聯(lián)的生物的種群是否會(huì)被廣泛種植的轉(zhuǎn)基因作物造成不良影響；轉(zhuǎn)基因作物是否改變了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)學(xué)特性和農(nóng)藝學(xué)特性；導(dǎo)入的目的基因及其表達(dá)產(chǎn)物是否會(huì)對(duì)人類(lèi)健康及動(dòng)物造成危害，農(nóng)畜產(chǎn)品中是否會(huì)殘留導(dǎo)入的目的基因及其表達(dá)產(chǎn)物；自然界中是否會(huì)有目的基因的漂移等一系列人們所疑問(wèn)和關(guān)心的問(wèn)題[2-6]。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用如當(dāng)今抗生素給人類(lèi)帶來(lái)的各種難題一樣，同樣也可能會(huì)給人類(lèi)帶來(lái)各種各樣的問(wèn)題，因轉(zhuǎn)基因作物畢竟不是通過(guò)自然進(jìn)化得來(lái)的[1-3]。如今，公眾對(duì)于轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品安全問(wèn)題的擔(dān)憂(yōu)和關(guān)注會(huì)隨著科學(xué)研究的不斷深入而更趨于科學(xué)和理性[7-9]。隨著越來(lái)越多的轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)品在人們?nèi)粘Ｉ钪械牟粩鄳?yīng)用，轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品的安全性也越來(lái)越受到人們的關(guān)注。目前，國(guó)內(nèi)外已有一系列的營(yíng)養(yǎng)研究報(bào)告表明動(dòng)物食用轉(zhuǎn)基因飼料對(duì)其健康和副產(chǎn)品沒(méi)有不良影響，但對(duì)其食用安全性的評(píng)估，大多為90 d實(shí)驗(yàn)，其毒理學(xué)研究屬于亞慢性的研究[5-12]，長(zhǎng)期的研究還較少。特別是轉(zhuǎn)基因飼料對(duì)兩代大鼠長(zhǎng)期系統(tǒng)的研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究參照“轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品大鼠90 d喂養(yǎng)試驗(yàn)”的設(shè)計(jì)原則[13]，通過(guò)以20%的比例將轉(zhuǎn)基因抗草甘膦除草劑大豆GTS40-3-2[6,9,14]和其親本非轉(zhuǎn)基因大豆A5403豆粕分別添加到基礎(chǔ)飼料中喂養(yǎng)兩代Sprague Dawley (SD) 大鼠，對(duì)大鼠腸道菌群和臟器組織等材料進(jìn)行定性、定量PCR和ELISA蛋白檢測(cè)，以研究轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的相關(guān)內(nèi)外源基因及蛋白在SD大鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)移情況，判定其食用安全性。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物

選用由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的24只出生后5周齡體重在80-100 g清潔級(jí)健康SD大鼠。首先，給予5 d的常規(guī)基礎(chǔ)飼料，后將其隨機(jī)分成4組 (按體重)：GMF組 (8只) 和GMM組 (4只) 分別為喂食轉(zhuǎn)基因大豆豆粕加工飼料的雌性大鼠組和雄性大鼠組；non-GMF 組 (8只) 和non-GMM (4只) 組分別為喂食非轉(zhuǎn)基因大豆豆粕加工飼料的雌性大鼠組和雄性大鼠組。試驗(yàn)期間，大鼠自由地?cái)z取飼料和水；動(dòng)物房?jī)?nèi)的光照時(shí)間為人工控制：12 h白天和12 h黑夜交替；房?jī)?nèi)維持溫度23 ℃±1 ℃，相對(duì)濕度維持55%±15%。喂食相應(yīng)組別的飼料6周，即大鼠3月齡時(shí)，在每晚8：00按雌性：雄性為2∶1比例進(jìn)行同籠，次日清晨進(jìn)行雌鼠陰道的檢查, 及時(shí)取出查到陰栓的雌鼠，后雌/雄大鼠分籠喂養(yǎng)，約21 d雌性大鼠先后產(chǎn)仔 (二代大鼠)。在二代大鼠長(zhǎng)到3周齡時(shí) (期間雌性母鼠一直喂食相應(yīng)組別的飼料) 離乳分籠。二周后(二代大鼠5周齡時(shí))，選用40只體重80-100 g健康二代大鼠，隨機(jī)分為4組 (每組10只，從離乳到分組也一直喂食相應(yīng)組別的飼料)，適應(yīng)1周后即大鼠6周齡時(shí)稱(chēng)重并開(kāi)始記錄數(shù)據(jù)，90 d后宰殺所有大鼠。

1.1.2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和大鼠飼料

陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)10%轉(zhuǎn)基因抗草甘膦除草劑大豆GTS40-3-2購(gòu)自歐盟委員會(huì)聯(lián)合研究中心標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與測(cè)量研究院 (IRMM) (Catalog Number：ERM-BF410GK)。所用豆粕 (轉(zhuǎn)基因抗草甘膦除草劑大豆GTS40-3-2 (孟山都公司)，對(duì)照組豆粕為其親本非轉(zhuǎn)基因大豆A5403) 經(jīng)農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物產(chǎn)品成分監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(太原) PCR方法檢測(cè)驗(yàn)證無(wú)誤，委托山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心根據(jù)大鼠的不同發(fā)育期按比例加工成大鼠飼料 (大豆豆粕含量為20%)[14]。

1.1.3主要試劑

磁珠法細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒購(gòu)自生工生物工程 (上海) 股份有限公司；TransTaq-T DNA Polymerase購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；TaKaRa MiniBest Universal Genomic DNA Extraction kit ver 5.0、Premix Ex TaqTM(Probe qPCR) 和DL2 000 DNA Marker購(gòu)自TaKaRa寶生物工程 (大連) 有限公司；ELISA CP4 EPSPS Roundup檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Agdia公司；定性、定量PCR引物及TaqMan探針：由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。

1.1.4菌種

大腸埃希氏桿菌菌種Escherichia coli ATCC 25922和嗜酸乳桿菌菌種Lactobacillus acidophilus ATCC 314，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)唐中偉老師惠贈(zèng)。

1.1.5檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆定性PCR相關(guān)引物

檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的定性PCR引物，見(jiàn)表1[15-16]。

1.1.6檢測(cè)大鼠腸道菌群相關(guān)引物

針對(duì)大鼠腸道內(nèi)總菌群16S rRNA和乳酸桿菌分別設(shè)計(jì)了檢測(cè)大鼠腸道菌群的特異性引物zx338f和rg7f (zx338f檢測(cè)總菌群，rg7f檢測(cè)乳酸桿菌)[17-19]，見(jiàn)表2。

表1　定性PCR引物序列Table 1 The qualitative PCR primers sequences

表2　檢測(cè)SD大鼠腸道菌群引物Table 2 The primers of detecting SD rat intestinal bacteria

1.1.7實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物與探針

檢測(cè)大鼠腸道菌群和臟器組織所用引物與探針序列[20]，見(jiàn)表3。

1.2方法

1.2.1SD大鼠腸道菌群轉(zhuǎn)基因成分相關(guān)基因的檢測(cè)

分別提起4組大鼠的尾巴，從肛門(mén)用鑷子夾取大鼠腸糞，電子天平準(zhǔn)確稱(chēng)取糞便5 g。將糞便溶解、梯度稀釋和接種涂布，之后進(jìn)行培養(yǎng)：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基37 ℃需氧恒溫培養(yǎng)48 h；LBS瓊脂培養(yǎng)基37 ℃厭氧恒溫培養(yǎng)48 h。針對(duì)每種培養(yǎng)基依次編號(hào)，LBS培養(yǎng)基用于培養(yǎng)腸糞中的乳酸桿菌 (1–4號(hào)，依次為GMM組、GMF組、non-GMM組和non-GMF 組)，牛肉膏蛋白胨用于培養(yǎng)腸糞中的腸道總菌群 (5–8號(hào)，依次為GMM組、GMF組、non-GMM組和non–GMF組)。腸糞菌群DNA提取和檢測(cè)分別參照磁珠法細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒和TransTaq-T DNA Polymerase說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.2大鼠臟器組織轉(zhuǎn)基因成分外源蛋白CP4-EPSPS ELISA測(cè)定 (酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))

四組大鼠宰殺后分別取樣，見(jiàn)表4。依據(jù)ELISA CP4 EPSPS Roundup檢測(cè)試劑盒進(jìn)行大鼠臟器組織轉(zhuǎn)基因成分外源蛋白CP4-EPSPS的檢測(cè)。

表3　實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Table 3 Real-time PCR primer sequences

表4　樣品編號(hào)Table 4 Sample serial number

1.2.3SD大鼠臟器組織轉(zhuǎn)基因成分相關(guān)基因定性PCR檢測(cè)

試驗(yàn)所取大鼠臟器組織如表4所示。SD大鼠臟器組織的裂解、DNA提取和檢測(cè)依照TaKaRa MiniBest Universal Genomic DNA Extraction kit ver 5.0和TransTaq-T DNA Polymerase說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，之后對(duì)陽(yáng)性擴(kuò)增片段進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4SD大鼠的臟器轉(zhuǎn)基因成分相關(guān)基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

應(yīng)用1.2.3所獲得的DNA，依據(jù)Premix Ex TaqTM(Probe qPCR) 試劑盒，建立大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因lectin基因和轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2特異基因GTS40-3-2的標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得各樣本基因的相應(yīng)拷貝數(shù)，同時(shí)計(jì)算轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2轉(zhuǎn)化體含量。

2　結(jié)果與分析

2.1SD大鼠腸道菌群轉(zhuǎn)基因成分相關(guān)基因的檢測(cè)

提取SD大鼠腸道菌群DNA，獲得的DNA濃度為234.4-1346.3 μg/mL，所提DNA的質(zhì)量(OD260/280為1.89-2.00，OD260/230為2.02-2.92)較好。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2內(nèi)外源基因在SD大鼠腸道菌群DNA中的消化吸收代謝殘留檢測(cè)。

2.1.1大鼠腸道菌群DNA特異基因定性PCR檢測(cè)

對(duì)所提取的大鼠腸道菌群DNA進(jìn)行rg7f和zx338f基因檢測(cè)，zx338f的陽(yáng)性對(duì)照為標(biāo)準(zhǔn)大腸埃希氏桿菌菌種ATCC 25922，rg7f的陽(yáng)性對(duì)照為嗜酸乳酸桿菌ATCC 314，結(jié)果見(jiàn)圖1。圖1A結(jié)果表明，1–4號(hào)樣品，均擴(kuò)增出1.7 kb的腸道乳酸桿菌rg7f基因，5–8號(hào)樣品，均未擴(kuò)增出相應(yīng)大小的條帶。圖1B結(jié)果表明，所提取的8個(gè)DNA樣品，都擴(kuò)增出了171 bp的腸道總菌群zx338f 基因。圖1A和B每個(gè)圖都檢測(cè)8個(gè)樣品，每個(gè)樣品2次重復(fù)。以上結(jié)果說(shuō)明，無(wú)論是針對(duì)腸道乳酸桿菌DNA，還是腸道菌群DNA，均擴(kuò)增出相應(yīng)大小的條帶，表明所提取的DNA質(zhì)量可靠。

圖 1 rg7f和zx338f基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig. 1 The electrophoretogram of PCR products of rg7f and zx338f genes. The electrophoregram A and B respectively on behalf of detecting rg7f and zx338f genes. 1, 2, 9, 10 lanes: 1, 5 samples (GMM group); 3, 4, 11, 12 lanes: 2, 6 samples (GMF group); 5, 6, 17, 18 lanes: 3, 7 samples (non-GMM group); 7, 8, 19, 20 lanes: 4, 8 samples (non-GMF)); 13, 14, 29 and 30 lanes: positive control; 15, 16, 31 and 32 lanes: negative control; M: DL2 000 DNA marker (2 000 bp, 1 000 bp, 750 bp, 500 bp, 250 bp, 100 bp).

2.1.2轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2內(nèi)外源基因的電泳檢測(cè)

采用PCR基因擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2內(nèi)外源基因在SD大鼠腸道菌群DNA中的轉(zhuǎn)移。檢測(cè)結(jié)果表明，所有8個(gè)樣品均未檢出轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2相關(guān)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因lectin、啟動(dòng)子CaMV35S、nos終止子、外源基因35s-ctp4和cp4-epsps (表5)。

2.1.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR

對(duì)所提取的8個(gè)腸道菌群DNA樣本進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因lectin 和特異基因GTS40-3-2實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，均未出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線 (表6)。

2.2SD大鼠臟器組織ELISA檢測(cè)結(jié)果

表5　轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2內(nèi)外源基因檢測(cè)電泳結(jié)果Table 5 Electrophoresis results of GM soybeans GTS40-3-2 internal and external source genes

表6　腸道菌群實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果Table 6 Real-time PCR detection results of intestinal flora

表7　結(jié)果分析參考對(duì)照Table 7 Result analyse contrast

根據(jù)ELISA CP4 EPSPS Roundup檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)所介紹的樣品陽(yáng)性與陰性的判定標(biāo)準(zhǔn)(表7)，通過(guò)酶標(biāo)儀在650 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的OD值，陽(yáng)性質(zhì)控物吸光度值為0.629±0.023，大于陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)0.3，呈陽(yáng)性，陰性質(zhì)控物吸光度值為0.069±0.012，小于陰性標(biāo)準(zhǔn)0.1，試驗(yàn)結(jié)果可靠，可進(jìn)行樣品數(shù)據(jù)的判定。最終樣品8號(hào)和9 號(hào) (腸糞和盲腸內(nèi)容物) 數(shù)值分別為0.237±0.010 和0.238±0.030，位于0.1和0.3之間，結(jié)果可疑，進(jìn)行以下相關(guān)基因檢測(cè)驗(yàn)證，其余樣品吸光度值均小于陰性標(biāo)準(zhǔn)0.1，未檢出轉(zhuǎn)基因大豆外源蛋白CP4-EPSPS殘留。

2.3SD大鼠臟器組織轉(zhuǎn)基因成分相關(guān)基因檢測(cè)

對(duì)提取的SD大鼠臟器組織DNA進(jìn)行定性與定量PCR檢測(cè)。

2.3.1SD大鼠臟器組織DNA定性PCR檢測(cè)

對(duì)提取的12個(gè)SD大鼠臟器DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)基因抗草甘膦除草劑大豆GTS40-3-2內(nèi)外源相關(guān)基因定性PCR檢測(cè)，每個(gè)樣品2次重復(fù)。除了大鼠腸糞和盲腸內(nèi)容物擴(kuò)增出了118 bp的大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)lectin基因、195 bp的CaMV35S啟動(dòng)子、180 bp 的nos終止子、498 bp的 cp4-epsps和171 bp 的35s-ctp4外源基因外，其他SD大鼠實(shí)質(zhì)臟器組織均未擴(kuò)增出相應(yīng)條帶 (圖2)。對(duì)上述腸糞和盲腸內(nèi)容物的PCR產(chǎn)物測(cè)序，5個(gè)基因的序列與文獻(xiàn)報(bào)道序列一致[15–16]。

圖2　Lectin、CaMV35S、nos、cp4-epsps和35s-ctp4擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig. 2 The electrophoretogram of PCR products of lectin, CaMV35S, nos, cp4-epsps and 35s-ctp4 genes. The electrophoregram A, B, C, D and E respectively on behalf of detecting lectin, CaMV35S, nos, cp4-epsps and 35s-ctp4 genes; 1-12 and 17-28 lanes: samples (1 and 2 lanes: spleen; 3 and 4 lanes: live; 5 and 6 lanes: heart; 7 and 8 lanes: stomach; 9 and 10 lanes: intestinal fecal; 11 and 12 lanes: cecum contents; 17 and 18 lanes: kidneys; 19 and 20 lanes: lung; 21 and 22 lanes: testis; 23 and 24 lanes: brain; 25 and 26 lanes: ovaries; 27 and 28 lanes: adrenal gland); 13, 14, 29 and 30 lanes: positive control; 15, 31 lanes: negative control; 16, 32 lanes: blank; M: DL2 000 DNA marker (2 000 bp, 1 000 bp, 750 bp, 500 bp, 250 bp, 100 bp).

2.3.2 SD大鼠臟器組織DNA 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

對(duì)上述所提取的12個(gè)SD大鼠臟器組織DNA進(jìn)行了大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因lectin實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，得到lectin基因標(biāo)準(zhǔn)曲線和擴(kuò)增曲線圖 (圖3)。由圖3可知，標(biāo)準(zhǔn)品的lectin基因具有典型的擴(kuò)增曲線，其擴(kuò)增效率為97.4%，R2為0.991>0.98，標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3.385 (>-3.6，<-3.1)，而以鮭魚(yú)精子DNA作為陰性對(duì)照和以水作為空白對(duì)照的lectin基因擴(kuò)增均無(wú)典型的擴(kuò)增曲線，說(shuō)明擴(kuò)增體系正確，可以進(jìn)行大鼠臟器組織樣品的判定。最終，從生成的擴(kuò)增曲線可知，SD大鼠腸糞和盲腸內(nèi)容物DNA的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因lectin有典型擴(kuò)增曲線，腸糞Ct值平均為35.70，拷貝數(shù)平均為401/2 μL；盲腸內(nèi)容物Ct值平均為37.02，拷貝數(shù)平均為97/2 μL；其他10個(gè)大鼠臟器組織未出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線。

圖3　Lectin基因標(biāo)準(zhǔn)曲線圖和擴(kuò)增曲線圖Fig. 3 The standard and amplification curves of lectin gene. The curve A and B respectively on behalf of the standard and amplification curves of lectin gene.

圖4　GTS40-3-2基因標(biāo)準(zhǔn)曲線圖和擴(kuò)增曲線圖Fig. 4 The standard and amplification curves of GTS40-3-2 gene. The curve A and B respectively on behalf of the standard and amplification curves of GTS40-3-2 gene.

試驗(yàn)對(duì)上述所提取的12個(gè)SD大鼠臟器DNA進(jìn)行了GTS40-3-2基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，所得GTS40-3-2基因標(biāo)準(zhǔn)曲線和擴(kuò)增曲線圖，見(jiàn)圖4。由圖4可知，標(biāo)準(zhǔn)品的GTS40-3-2基因具有典型擴(kuò)增曲線，其擴(kuò)增效率為99.5%，R2為0.989>0.98，標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率-3.333 (>-3.6，<-3.1)，以鮭魚(yú)精子DNA作為陰性對(duì)照和以水作為空白對(duì)照的GTS40-3-2基因擴(kuò)增均無(wú)典型的擴(kuò)增曲線，說(shuō)明擴(kuò)增體系正確，可以進(jìn)行大鼠臟器組織樣品的判定。從生成的擴(kuò)增曲線可知，SD大鼠腸糞和盲腸內(nèi)容物DNA的GTS40-3-2基因有典型擴(kuò)增曲線，腸糞的Ct值平均為36.05，拷貝數(shù)平均為222/2 μL；盲腸內(nèi)容物的Ct值平均為38.11，拷貝數(shù)平均為53.9/2 μL；其他10個(gè)SD大鼠臟器組織未出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線。

SD大鼠臟器中GTS40-3-2轉(zhuǎn)化體的含量按下列公式計(jì)算：代表樣品中所含轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2基因的拷貝數(shù)，nlectin代表樣品中所含大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)lectin基因的拷貝數(shù))。通過(guò)上述公式計(jì)算，可得SD大鼠腸糞中GTS40-3-2轉(zhuǎn)化體含量 (拷貝數(shù)的比值) 為55.4%，盲腸內(nèi)容物中GTS40-3-2轉(zhuǎn)化體含量 (拷貝數(shù)的比值) 為55.6%。

3　討論

腸道微生物群落與宿主個(gè)體的健康和疾病狀況息息相關(guān)。腸道微生物群落不僅能降解食物中不易消化的營(yíng)養(yǎng)成分，提供給宿主氨基酸和維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還能夠調(diào)節(jié)宿主能量存儲(chǔ)與代謝、激活腸道免疫系統(tǒng)以及促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞的分化與成熟[7]。腸道中微生物菌群對(duì)動(dòng)物機(jī)體的健康和疾病具有重要的影響，越來(lái)越受到人們的關(guān)注[21-22]。由于在動(dòng)物糞便中便于非損傷型取樣，且含有大量的腸道菌群相關(guān)信息，是較好的分子生物學(xué)研究材料[17-19,23]。目前，已有許多研究人員開(kāi)展了從不同動(dòng)物的糞便樣品中提取DNA并進(jìn)行相關(guān)方面的研究[17-19]。本研究中，從定性和定量PCR基因檢測(cè)結(jié)果看，大鼠腸道菌群如期檢測(cè)到了相關(guān)菌群的特異性基因，說(shuō)明所提取的DNA質(zhì)量可靠，但SD大鼠腸道菌群未檢測(cè)到轉(zhuǎn)基因豆粕的相關(guān)內(nèi)外源基因，即相關(guān)豆粕轉(zhuǎn)基因成分在大鼠腸道菌群無(wú)殘留。

近些年，有關(guān)轉(zhuǎn)基因作物毒理學(xué)方面的評(píng)價(jià)越來(lái)越多。2004年Alexander等使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和常規(guī)PCR評(píng)估了抗農(nóng)達(dá)油菜cp4 epsps基因在綿羊腸道、瘤胃、糞便內(nèi)容物中的穩(wěn)定性，研究表明，消化的植物材料所釋放的轉(zhuǎn)基因DNA可以在綿羊小腸中發(fā)現(xiàn)。然而, 在中性pH中DNA迅速降解，從而減少了完整轉(zhuǎn)基因DNA通過(guò)綿羊集合淋巴結(jié)的補(bǔ)丁回腸末端吸收的可能性[24]。2008年Bakke-McKellep等通過(guò)對(duì)西洋鮭魚(yú)喂食抗農(nóng)達(dá)轉(zhuǎn)基因全脂大豆粉和轉(zhuǎn)基因玉米，發(fā)現(xiàn)在商業(yè)化的飼料中含有約6%轉(zhuǎn)基因玉米和大豆是安全的[25]。2009年，Sissener等研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因大豆未造成任何不利大西洋鮭魚(yú)器官形態(tài)或應(yīng)激反應(yīng)的現(xiàn)象[26]。2011年，譚建莊等應(yīng)用蘇木素伊紅染色法和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因大豆豆粕對(duì)肉仔腸載膜免疫屏障產(chǎn)生不良影響[8]。2012年，Chukwudebe等喂食含轉(zhuǎn)基因大豆CV127飼料的大鼠，通過(guò)91 d的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CV127大豆與其傳統(tǒng)對(duì)照大豆在系統(tǒng)性影響和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值方面具有等同性[27]。本研究也得到上述文獻(xiàn)類(lèi)似的結(jié)論。在ELISA CP4-EPSPS蛋白檢測(cè)中，大鼠的實(shí)質(zhì)臟器組織未檢測(cè)到含有CP4-EPSPS蛋白。但大鼠的腸糞和盲腸內(nèi)容物無(wú)論是肉眼觀察還是酶標(biāo)儀檢測(cè)，都顯示含有轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2外源CP4-EPSPS蛋白 (大鼠腸糞OD630檢測(cè)數(shù)值為0.237±0.010，盲腸內(nèi)容物OD630檢測(cè)數(shù)值為0.238±0.030) 殘留。2個(gè)樣品的OD630檢測(cè)數(shù)值都小于0.3，但大于0.1，研究采用定性與定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的內(nèi)外源基因在SD大鼠體內(nèi)的消化吸收情況，進(jìn)行了相關(guān)基因檢測(cè)進(jìn)一步驗(yàn)證。定性PCR檢測(cè)中，只有大鼠的腸糞和盲腸內(nèi)容物檢測(cè)出了大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因lectin、啟動(dòng)子CaMV35S、nos終止子、外源基因35s-ctp4和cp4-epsps 5個(gè)基因(定性PCR檢出cp4-epsps基因與ELISA蛋白檢測(cè)含有CP4-EPSPS蛋白相吻合)，其余大鼠臟器組織均未檢測(cè)到相關(guān)基因。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)也只有大鼠的腸糞和盲腸內(nèi)容物lectin、GTS40-3-2有典型擴(kuò)增曲線(GTS40-3-2轉(zhuǎn)化體含量分別為55.4%和55.6%)，其余樣品均無(wú)典型擴(kuò)增曲線。大鼠腸糞和盲腸內(nèi)容物中檢測(cè)到轉(zhuǎn)基因成分很正常，因飼料經(jīng)過(guò)大鼠消化系統(tǒng)的消化與吸收，會(huì)有一部分飼料未完全被消化，因而會(huì)有殘留，但大鼠的實(shí)質(zhì)臟器組織均未檢出有轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2成分相關(guān)基因的轉(zhuǎn)移。

4　結(jié)論

通過(guò)添加含有20%的轉(zhuǎn)基因抗草甘膦除草劑GTS40-3-2大豆豆粕作為飼料喂養(yǎng)二代SD大鼠，針對(duì)大鼠的腸道菌群和實(shí)質(zhì)臟器進(jìn)行了與飼料相關(guān)基因和蛋白的定性、定量PCR和ELISA檢測(cè)，均未發(fā)現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因成分的轉(zhuǎn)移和殘留，表明轉(zhuǎn)基因抗草甘膦除草劑GTS40-3-2大豆與其親本A5403具有實(shí)質(zhì)性的等同。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

醫(yī)學(xué)與免疫生物技術(shù)

Analysis of exogenous gene and protein digestion and absorption of SD rats (Rattus norvegicus) fed roundup ready soybean meal

Jianqin Yuan1, Hong Chang1, Jianghe Zhao1, Zongyong Shi1, and Jundong Wang2
1 College of Life Science, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi, China
2 College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi, China

Abstract:Metabolism and deposition of exogenous gene and protein from transgenic glyphosate herbicide-tolerant soybean meal in SD rats were studied in the experiment. The transgenic soybean GTS40-3-2 meal and its non-transgenic counterpart (parent A5403) were fed to the generation and the second generation Sprague-Dawley (SD) rats (Rattus norvegicus). The study added the genetically modified (GM) soybean meal and its non-transgenic control soybean meal (parent A5403) in a ratio of 20% respectively to the feeds. By using qualitative, quantitative PCR and ELISA methods to detect transgenic soybean residues of metabolism ingredients in rats, the safety and influence of GM soybean were evaluated. The results showed that the intestinal fecal and cecum contents of rats were detected with residues of GM ingredients, intestinal flora and organs were not found related genes and protein. These results indicated that transgenic glyphosate herbicide-tolerant soybean GTS40-3-2 meal was as safe as its non-GM soybean meal in long-term feeding study.

Keywords:glyphosate-resistance herbicide, GM soybeans GTS40-3-2, SD rats, exogenous gene and protein, digestion and absorption

Corresponding author:Jundong Wang. Tel: +86-354-6288206; fax: +86-354-6222942; E-mail: wangjd53@outlook.com