銅離子對混合菌群降解三氯乙烯的影響與機制分析

高艷輝，趙天濤，邢志林,，何芝，張麗杰，彭緒亞

1 重慶理工大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，重慶 4000542 重慶大學(xué) 城市建設(shè)與環(huán)境工程學(xué)院，重慶 400045

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銅離子對混合菌群降解三氯乙烯的影響與機制分析

高艷輝1，趙天濤1，邢志林1,2，何芝1，張麗杰1，彭緒亞2

1 重慶理工大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400054
2 重慶大學(xué) 城市建設(shè)與環(huán)境工程學(xué)院，重慶 400045

高艷輝, 趙天濤, 邢志林, 等. 銅離子對混合菌群降解三氯乙烯的影響與機制分析. 生物工程學(xué)報, 2016, 32(5): 621–634.

Gao YH, Zhao TT, Xing ZL, et al. Effects of copper on biodegradation mechanism of trichloroethylene by mixed microorganisms. Chin J Biotech, 2016, 32(5): 621–634.

摘 要:在三氯乙烯 (TCE) 脅迫條件下，從生活垃圾填埋場覆蓋土中富集得到了可高效降解TCE的混合菌群SWA1?？疾炝算~離子濃度0?15 μmol/L范圍內(nèi)混合菌群對TCE的降解，當(dāng)銅離子濃度為0.03 μmol/L時，降解速率最大為29.60 nmol/min，降解率達95.75%。此條件下的pmoA和mmoX表達量均達最大值，pmoA的相對表達量 (4.22 E-03) 比mmoX (9.30 E-06) 和LmpH (0) 高3個數(shù)量級。在0?0.75 μmol/L和1?15 μmol/L兩個銅離子濃度區(qū)間，分別出現(xiàn)了TCE降解峰值，高通量測序結(jié)果表明，甲基孢囊菌科Methylocystaceae的甲烷氧化菌為優(yōu)勢微生物。隨著銅離子濃度提高，混合菌群SWA1生物多樣性顯著降低。銅離子濃度的變化影響了混合菌群的結(jié)構(gòu)和活性，進而影響了TCE降解機制。當(dāng)銅離子濃度為0.03 μmol/L時，降解機制包括TCE直接降解和甲烷氧化菌共代謝降解。當(dāng)銅離子濃度為5 μmol/L時，降解率可達到84.75%。此時，降解機制包括TCE直接降解以及甲烷氧化菌和含苯酚羥化酶菌群的共代謝降解。

關(guān)鍵詞:混合菌群，三氯乙烯，關(guān)鍵酶，群落結(jié)構(gòu)，降解機制

Received: August 22, 2015; Accepted: November 30, 2015

Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 51378522, 41502328), Fundamental and Advanced Research Projects of Chongqing (No. cstc2015jcyjB0015).

國家自然科學(xué)基金 (Nos. 51378522, 41502328)，重慶市基礎(chǔ)科學(xué)與前沿技術(shù)研究項目 (No. cstc2015jcyjB0015) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-01-06 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20160106.1105.002.html

三氯乙烯 (Trichloroethylene，TCE) 是一種重要的有機溶劑和化工原料，但使用過程中的不當(dāng)處置會導(dǎo)致TCE泄露和直接排放，嚴(yán)重污染了水體、土壤和大氣環(huán)境。此外，作為重要的TCE人為源，生活垃圾填埋場在有機物降解過程也產(chǎn)生了大量的氯代烴污染物，并伴隨著生物氣直接排放至大氣中，對生態(tài)環(huán)境造成了嚴(yán)重威脅[1-3]。生物降解因具有高效性及低成本等特點，被認為是去除TCE等氯代烴類污染物的有效途徑[4-7]。而與純菌降解相比，有污染源富集的混合菌群因具有高耐受和互營養(yǎng)的生物特性，可通過共代謝、直接氧化等多種途徑更有效的降解氯代烴污染物[8-12]。

研究表明發(fā)孢甲基彎菌Methylosinus trichosporium OB3b可以甲烷為碳源通過甲烷單加氧酶 (Methanemonooxygenase，MMO) 對TCE進行共代謝降解。在甲烷、甲醇等底物存在下，MMO經(jīng)環(huán)氧化過程可將TCE代謝為無機氯[9]。MMO有兩種存在形式：一種是與細胞膜結(jié)合的具有含銅活性中心的顆粒性甲烷單加氧酶 (Particulate methane monooxygenate，pMMO)，它存在于除甲基細胞菌屬Methylocella和Methyloferula以外的所有已發(fā)現(xiàn)的甲烷氧化菌中[13-14]，可在高銅離子濃度 (約4 μmol/L) 條件下表達[15-17]。pMMO由α、β和γ亞基以1∶1∶1的比例組成，以 (αβγ)3三聚體形式存在；編碼pMMO的基因簇pmmo由3個功能基因組成，按pmoCAB排列，pmoB、pmoA、pmoC分別編碼α亞基、β亞基、γ亞基[16,18-19]。Basu 等[20]從莢膜甲基球菌Methylococcus capsulatus Bath中分離純化得到pMMO的α (47 kDa)、β (27 kDa)、γ (23 kDa) 亞基和一個63 kDa的蛋白質(zhì)推測為還原酶 (pMMOR)，并明確指出這3個亞基組成的蛋白為羥基化酶 (pMMOH)。另一種是分泌在周質(zhì)空間中的可溶性甲烷單加氧酶(Soluble methane monooxygenase，sMMO)，只有少數(shù)Ⅰ型甲烷氧化菌和Ⅱ型甲烷氧化菌如甲基球菌屬Methylococcus、甲基單胞菌屬Methylomonas、甲基細胞菌屬Methylocella、甲基孢囊菌屬Methylocystis和甲基彎曲菌屬Methylosinus[19-21]，在銅離子缺乏 (<0.8 μmol/L)條件下可分泌產(chǎn)生[22]。編碼sMMO的基因位于由6個基因組成的操縱子上，形成了大約5.5 kb的基因簇，按mmoXYBZDC排列、分別編碼α (MMOHα) (60 kDa)、羥化酶亞基β (MMOHβ) (45 kDa)、調(diào)控蛋白B (MMOB)、羥化酶亞基γ (MMOHγ) (20 kDa)、MMOD和還原酶C (MMOR) (39 kDa)[19,23]。mmoX與pmoA分別作為編碼sMMO和pMMO的保守基因片段，常用來作為編碼sMMO和pMMO的功能標(biāo)志基因開展研究[19,24]。2013年Susanne等[24]利用mmoX基因的轉(zhuǎn)錄水平指示sMMO水平，證實了酸性泥炭生態(tài)系統(tǒng)中sMMO是一種活性酶。2013年Sheeja等[25]以pmoA為功能基因通過RT-qPCR技術(shù)證實了甲基孢囊菌屬Methylocystis strain SB2可以以甲醇作為生長基質(zhì)實現(xiàn)多種污染物降解。銅離子在MMOs催化降解過程中扮演了重要的角色[22]，研究表明銅是合成顆粒性甲烷單加氧酶pMMO的必需金屬元素，又是調(diào)控sMMO或pMMO表達的開關(guān)元件[22,26]，因此，銅對甲烷氧化菌酶活性、代謝控制具有重要意義。Mukherjee等[27]研究了多種輔酶因子對TCE降解酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)與其他輔酶因子(各種金屬元素) 相比，銅對TCE降解菌嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌Stenotrophomonas maltophilia PM102所產(chǎn)生的酶活性有顯著刺激作用。

前期研究表明，生活垃圾填埋場覆蓋層在填埋氣長期馴化過程中富集出多種環(huán)境功能微生物，包括甲基孢囊菌、微桿菌、金黃桿菌、假單胞菌和芽胞桿菌等[28-31]。有氧條件下，填埋氣中高濃度揮發(fā)性氯代烴 (1 000?5 000 mg/L)可通過甲烷單加氧酶、苯酚羥化酶 (受苯酚羥化酶基因LmPHs控制)、甲苯加氧酶和一些直接氧化酶等催化降解[32-34]。實驗室發(fā)現(xiàn)從生活垃圾填埋場覆蓋土富集到的混合菌群可以有效降解TCE，且銅離子對混合菌群中非甲烷氧化菌及其群落結(jié)構(gòu)有特殊影響。目前，作為重要的輔酶因子，銅離子對混合菌群中非甲烷氧化菌的TCE降解影響并不清晰，對混合菌群酶活調(diào)節(jié)和TCE降解調(diào)控機制還鮮為報道?；诖?，本文全面解析了銅離子濃度對TCE生物降解的影響及其響應(yīng)機制，包括：1) 以甲烷為碳源，TCE脅迫下從生活垃圾填埋場覆蓋土中富集可高效降解TCE的混合菌群，初步分析混合菌群的生長特性；2) 分析TCE降解過程中銅離子對混合菌群生物特性、甲烷氧化及TCE降解的影響；3) 通過實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)分析銅離子對調(diào)控TCE降解關(guān)鍵酶保守基因片段轉(zhuǎn)錄表達豐度的影響；4) 利用高通量測序技術(shù)探究TCE降解過程不同濃度銅離子條件下微生物群落結(jié)構(gòu)，進而明晰混合菌群TCE降解機制。研究成果以期為深入認識混合菌群的共降解機制和生物強化有機物降解提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1混合菌群的富集馴化

以重慶長生橋生活垃圾填埋場覆蓋土為生物介質(zhì)，選取4 mm篩下和2 mm篩上覆蓋土顆粒100 g，置于500 mL血清瓶后具塞密封，用100 mL甲烷置換瓶中空氣，30 ℃密閉馴化2周實現(xiàn)甲烷氧化菌的復(fù)壯。稱取0.2 g已馴化過的土樣放入30 mL NMS[28]培養(yǎng)基中，在30 ℃、170 r/min搖床振蕩培養(yǎng)2 h。然后取1 mL培養(yǎng)液作為種子接入含30 mL NMS培養(yǎng)基的135 mL血清瓶中，加蓋密封。用已滅菌的醫(yī)用注射器抽取瓶內(nèi)一定體積的空氣，并注入相同體積的甲烷，使瓶中氧氣與甲烷的體積比為1∶1，在30 ℃、170 r/min搖床培養(yǎng)，得到混合菌群SWA1。

1.2色譜檢測條件

生物氣甲烷和氯代烴 (TCE) 濃度檢測均采用川儀SC-6000A氣相色譜。生物氣檢測條件：不銹鋼色譜柱TDX 8-12-25 2 m；進樣器溫度、柱溫和TCD檢測器溫度分別為120 ℃、90 ℃和120 ℃；氮氣為載氣，載氣流速為25 mL/min；進樣量0.5 mL。氯代烴檢測條件：不銹鋼色譜柱GDX-104 2 m；進樣器溫度、柱溫和ECD檢測器溫度分別為120 ℃、80 ℃和200 ℃；氮氣為載氣，載氣流速為40 mL/min；尾吹氣速為10 mL/min；進樣量：0.1 mL；基流補償0.00 nA。

1.3基因組DNA和RNA提取

取一定量菌液離心，棄去上清液，用購自天根生化科技有限公司 (北京) 的細菌基因組DNA提取試劑盒和RNAprep Pure培養(yǎng)細胞/細菌總RNA提取試劑盒提取樣品的基因組DNA和總RNA。使用超微量紫外分光光度計 (美國Denovix公司) 檢測基因組DNA和RNA濃度。

1.4目的基因轉(zhuǎn)錄表達

表1　引物及其核苷酸序列Table 1 Primer features

實驗所用引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物信息如表1所示。其中F27、R1429用于擴增16S rRNA基因上1 540 bp全序列；引物F-16S rRNA、R-16S rRNA用于擴增16S rRNA內(nèi)參基因上200 bp的核苷酸序列；引物F-pmoA、R-pmoA用于擴增pmoA目的基因上152 bp的核苷酸序列；引物F-mmoX、R-mmoX用于擴增mmoX目的基因上113 bp的核苷酸序列；引物F-LmpH、R-LmpH用于擴增LmpH目的基因上177 bp的核苷酸序列。RNA提取后，基因組DNA去除反應(yīng)及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參照PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)；qPCR反應(yīng)液配制參照SYBR?Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)試劑盒 (大連寶生物公司)。

運用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR (RT-qPCR)確定和量化不同生長條件下混合菌群目的基因轉(zhuǎn)錄表達情況。將提取的總RNA進行基因組DNA去除反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)錄 (RT-PCR) 合成第一鏈cDNA，以cDNA為模板通過SYBR染料法分別對16S rRNA內(nèi)參基因和pmoA、mmoX及LmpH目的基因進行qPCR反應(yīng)。

基因組DNA去除反應(yīng)條件：42 ℃，2 min，4 ℃保存。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37 ℃，15 min，85 ℃，5 s，4 ℃保存。qPCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃，30 s；變性95 ℃，5 s，退火/延伸62.4 ℃(16S rRNA、pmoA、LmpH)，30 s；58 ℃ (mmoX)，30 s，39個循環(huán)，以0.5 ℃頻率從65 ℃增加至95 ℃進行熔解。循環(huán)結(jié)束后熒光信號被收集，儀器記錄下每個樣品的最小循環(huán)閥值即Ct值，將Ct值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程來確定目標(biāo)基因的初始拷貝數(shù)，將每個基因溫度梯度優(yōu)化后的PCR產(chǎn)物作為標(biāo)準(zhǔn)品，使用超微量紫外分光光度計檢測其濃度來計算每個樣品DNA中的目標(biāo)基因的含量，將標(biāo)準(zhǔn)品以10倍的梯度進行稀釋作為qPCR標(biāo)線模板，來分別定量目的基因的初始拷貝數(shù)。每次PCR反應(yīng)結(jié)束后，通過分析熔解曲線來確定擴增的特異性。

標(biāo)準(zhǔn)曲線指標(biāo)均達到了可以量化目的基因的要求，各指標(biāo)如下，16S rRNA：R2=1.000，E=97.7%，最低檢測限為 (2.310E+4) copies/μL。pmoA： R2=0.999，E=97.8%，最低檢測限為 (3.96E+4) copies/μL。mmoX：R2=0.999，E=97.4%，最低檢測限為 (4.780E+2) copies/μL。LmpH：R2=0.991，E=93.9%，最低檢測限為 (3.44E+1) copies/μL。熱循環(huán)儀器的原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成每個樣品單位體積菌液的目的基因的拷貝數(shù)，然后用細菌中最保守的16S rRNA內(nèi)參基因來歸一化其他目的基因。每個樣品均設(shè)置3個復(fù)管。

1.5高通量測序數(shù)據(jù)處理

基于目前主流的MiSeq平臺對16S rRNA基因高變區(qū)序列進行測序，測序區(qū)域選擇V3+V4區(qū)，測序片段為468 bp，測序引物為338F-806R[37-38]，使用Trimmomatic、FLASH軟件對測序數(shù)據(jù)進行處理獲得干凈數(shù)據(jù)。在Usearch軟件平臺中使用uparse方法將序列按照彼此相似性為97%分歸為許多小組，一個小組為一個OTU，從而得到OTU的代表序列。然后，使用uchime檢測PCR擴增中產(chǎn)生的嵌合體序列并從OTU中去除，再用usearch_global方法將優(yōu)化序列map比對回OTU代表序列，最終得到OTU各樣品序列豐度統(tǒng)計表。

2　結(jié)果與分析

2.1混合菌群SWA1的生長特性

從垃圾填埋覆蓋土中富集得到了混合菌群，命名為SWA1，在銅離子濃度為10 μmol/L和無銅離子的對照條件下，以甲烷為碳源進行連續(xù)5次傳代培養(yǎng)，評估混合菌群在離位條件下的生長穩(wěn)定性，結(jié)果如圖1所示。在連續(xù)5次傳代過程中，混合菌群SWA1生長特性穩(wěn)定，經(jīng)過24 h培養(yǎng)后均達到指數(shù)生長期，pH值在7.0左右。因此，從垃圾填埋覆蓋土中富集的混合菌群SWA1能以甲烷為碳源，實現(xiàn)連續(xù)穩(wěn)定的離位培養(yǎng)。此外，由圖1可知，當(dāng)銅離子濃度為10 μmol/L時，穩(wěn)定期OD600維持在0.65左右，高于對照組的0.45，這說明添加銅離子有利于混合菌群的生長。

2.2銅離子濃度對混合菌群SWA1降解TCE的影響

共代謝條件 (甲烷濃度為20%) 下，銅離子對混合菌群SWA1降解TCE的影響如圖2所示。銅離子添加量的不同導(dǎo)致了TCE降解率和降解速率的變化。當(dāng)銅離子濃度為0.03、3、5 μmol/L時，在反應(yīng)的第3天，TCE降解率就分別達到了89.21%、70.15%和80.85% (圖2A)。96 h時，隨銅離子濃度的增加出現(xiàn)了兩個TCE降解峰值。當(dāng)c (Cu2+)=0.03 μmol/L時，TCE降解率達到最高95.75%，其TCE降解速率為29.60 nmol/min，是其他實驗組的1.2?1.6倍。在銅離子濃度為1?15 μmol/L范圍內(nèi)，當(dāng)銅離子濃度為5 μmol/L時，TCE降解率達到最高的84.75% (圖2B)。由Dong等[39]關(guān)于pMMO及pMMO-NADH的研究顯示隨著銅離子濃度的提高，Methylococcus capsulatus Bath甲烷消耗速率逐漸提高?？梢猿醪酵茢啵~離子濃度變化影響了混合菌群SWA1中非甲烷氧化菌群的活性，繼而影響了整個體系降解TCE的活性。為了更好地理解銅離子對混合菌群SWA1共代謝降解TCE的規(guī)律，繼續(xù)考察了降解過程碳源消耗、關(guān)鍵酶定量分析以及群落結(jié)構(gòu)變化。

圖1　混合菌群SWA1生長穩(wěn)定性Fig. 1 Growth stability of the mixed microbial consortium SWA1.

圖2　銅離子對混合菌群SWA1生物降解TCE的影響Fig. 2 The effect of copper ion on TCE biodegradation by SWA1.

2.3銅離子對混合菌群SWA1共代謝降解TCE過程甲烷消耗的影響

不同濃度銅離子條件下，TCE降解過程中混合菌群對甲烷的消耗過程如圖3所示?？瞻讓φ战M和銅離子濃度較低 (0.03 μmol/L和0.20 μmol/L)的實驗組甲烷消耗速率較低，在反應(yīng)的第4天甲烷基本完全消耗，比其他實驗組延遲了近1 d(圖3A)。

考察了各時間段甲烷消耗速率隨銅離子濃度變化情況，由圖3B可知，隨著銅離子濃度的變化，甲烷氧化速率存在著顯著差異。反應(yīng)時間為0?24 h，隨銅離子濃度的增加，甲烷氧化速率先增后減，在0.75 μmol/L時，甲烷氧化速率達到最大124.52 mmol/(L·min)，當(dāng)銅離子濃度大于0.75 μmol/L時，銅離子對甲烷氧化的刺激效果逐漸減弱，說明由于短時間內(nèi)初始高銅離子濃度毒性而產(chǎn)生了不利效果[40]。反應(yīng)時間為0?48 h和0?72 h，銅離子濃度越大，甲烷氧化速率越快，銅離子的添加顯著刺激甲烷的氧化，實驗組的甲烷氧化速率是空白對照組的1?2.6倍。這一刺激最可能是由于混合菌群細胞特殊活性的增加引起的，且TCE降解過程中不同銅離子濃度對混合菌群SWA1生長情況的影響也證實了這一點。由圖4可知，單位時間內(nèi)混合菌群細胞濃度隨銅離子濃度的增加而增加，同時，穩(wěn)定期細胞濃度亦與銅離子濃度呈正相關(guān)，該現(xiàn)象與Methylococcus capsulatus Bath細胞的濃度及活性隨銅離子濃度增加而增加結(jié)論相符[39]。此外，72 h平均甲烷氧化速率整體都低于前48 h，但整體趨勢一致。這說明隨著甲烷逐漸消耗，TCE和甲烷共同競爭關(guān)鍵酶，亦或是TCE氧化產(chǎn)物和酶出現(xiàn)不可逆鍵合或反應(yīng)過程還原型輔酶NADH逐漸被消耗。

圖3　TCE降解過程中銅離子對甲烷氧化的影響Fig. 3 The effect of copper ion on methane oxidation in the progress of TCE biodegradation by SWA1.

由圖3B分析可知，反應(yīng)時間為0?72 h的區(qū)間內(nèi)，實驗組銅離子對甲烷氧化刺激作用總體上均隨銅離子濃度增加而增加，平均為對照組的1?1.8倍。以上結(jié)果充分說明了銅離子添加促進了甲烷氧化速率的提高，且隨反應(yīng)時間延長銅離子對微生物毒性作用減弱。但與不同銅離子濃度對SWA1生物降解TCE的影響結(jié)果(圖2) 對比發(fā)現(xiàn)，甲烷氧化活性與TCE的降解活性并非正相關(guān)，推測和混合菌群中其他微生物菌群的活性存在關(guān)聯(lián)。

圖4　TCE降解過程中銅離子對SWA1生長情況的影響Fig. 4 The growth of SWA1 in the progress of TCE biodegradation by copper ion.

2.4銅離子對混合菌群SWA1關(guān)鍵基因表達豐度的影響

混合菌群對TCE的降解是在sMMO和pMMO等關(guān)鍵酶的催化作用下完成的，TCE降解過程中，不同濃度銅離子條件下混合菌群降解關(guān)鍵酶調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄表達豐度如圖5所示。經(jīng)內(nèi)參16S rRNA基因歸一化后，隨銅離子濃度的增加，pmoA和mmoX基因相對表達豐度存在差異，在銅離子濃度為0.03 μmol/L時，pmoA 和mmoX基因表達豐度均出現(xiàn)峰值，而pmoA基因的相對表達量 (4.22E-03±4.98E-05) 比mmoX基因 (9.30E-06±4.89E-7) 高3個數(shù)量級，且隨銅離子濃度的增加pmoA與mmoX基因相對表達豐度的差異越大，說明該混合菌群富含的甲烷氧化菌主要表達pmoA基因。銅離子在0?0.75 μmol/L濃度區(qū)間時mmoX基因的整體表達水平要高于1?15 μmol/L濃度。

Choi等[17]對Methylococcus capsulatus Bath的研究發(fā)現(xiàn)，其pmoA基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的濃度隨生長培養(yǎng)基中銅離子濃度 (0?55 μmol/L) 的增加而增加。即銅離子濃度越大，越有利于pmoA基因的表達。而由圖5可知，這一規(guī)律對于混合菌群SWA1降解TCE的過程并不適用。對照不同銅離子濃度對SWA1生物降解TCE的影響結(jié)果 (圖2) 也可以發(fā)現(xiàn)，TCE的降解并不和MMO豐度呈正相關(guān)。以上結(jié)果說明隨著銅離子濃度變化，混合菌群中非甲烷氧化菌群的活性受到了影響，而這些菌群在TCE降解過程中也起到了關(guān)鍵作用。

圖5　TCE降解過程中不同銅離子濃度對關(guān)鍵基因相對表達豐度的影響Fig. 5 Relative expression abundance of target genes in the progress of TCE biodegradation by copper ion (pmoA/16S: copies of pmoA genes/copies of 16S rRNA genes; mmoX/16S: copies of mmoX genes/copies of 16S rRNA genes; LmpH/16S: copies of LmpH genes/copies of 16S rRNA genes).

已有研究證實苯酚羥化酶等共代謝脫鹵酶也可以催化降解TCE[34]。如圖5所示，在銅離子濃度為 (0?0.75 μmol/L) 時并未檢測到LmpH基因的表達，而當(dāng)銅離子濃度大于1 μmol/L時該基因開始表達，整體表達水平基本穩(wěn)定，與mmoX差異不明顯，但是與pmoA的表達水平相差2?3個數(shù)量級。說明銅離子有利于LmpH基因的表達。而由圖2可知，當(dāng)銅離子濃度為5 μmol/L時，出現(xiàn)了一個TCE降解峰值，這說明在高濃度銅離子區(qū)間內(nèi)，苯酚羥化酶等非甲烷氧化菌的共代謝作用對TCE降解同樣起到了關(guān)鍵作用。

2.5銅離子對混合菌群SWA1微生物多樣性的影響

TCE降解過程中，在低銅離子濃度和高銅離子濃度范圍內(nèi)分別出現(xiàn)了兩個TCE降解峰值，選取該樣本進行高通量測序，分析微生物群落結(jié)構(gòu)的變化。銅離子濃度為0.03 μmol/L和5 μmol/L時的混合菌群序列信息和多樣性指數(shù)如表2所示。兩個樣品序列數(shù)分別為10 799和11 964條，測序的覆蓋度基本達到100%，說明對混合菌群中的微生物序列有足夠的測序深度，測序結(jié)果充分反映了混合菌群中微生物數(shù)量和種類的真實情況。

銅離子濃度為0.03 μmol/L和5 μmol/L時的混合菌群微生物群落結(jié)構(gòu)如表3所示，兩個樣本中優(yōu)勢微生物均為甲基孢囊菌科Methylocystaceae (Ⅱ型甲烷氧化菌) 的甲烷氧化菌。除甲烷氧化菌外，還含有乳球菌屬Lactococcus、芽胞桿菌屬Bacillus、鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas、假單胞菌屬Pseudomonas和嗜甲基菌屬Methylophilus等多種環(huán)境功能微生物。隨著銅離子濃度的增加，Methylocystaceae 的OTU數(shù)量 (3 899到9 018) 和百分含量(36.10%到75.42%) 顯著增大，其他微生物的OTU數(shù)量和百分比都顯著降低，甚至消失。說明銅離子濃度的增加刺激Ⅱ型甲烷氧化菌的生長，同時對其他非甲烷氧化菌的抑制作用使得高銅離子濃度范圍混合菌群的微生物多樣性降低，證實了銅離子濃度的變化改變了混合菌群的群落結(jié)構(gòu)。

經(jīng)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，該混合菌群中非甲烷氧化菌類型的多種微生物都能夠進行TCE降解，其OTU數(shù)量和生物特性如表3所示。其中乳球菌屬Lactococcus、鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas能夠有效去除TCE，芽胞桿菌屬Bacillus能直接以TCE為碳源，節(jié)細菌屬Arthrobacter和假單胞菌屬Pseudomonas含有苯酚羥化酶 (與前面所提到的LmpH的結(jié)果相符)，能共代謝降解TCE。因此混合菌群SWA1降解TCE是多種途徑的協(xié)同作用，包括含有MMOs (sMMO和pMMO) 或苯酚羥化酶微生物的共代謝催化氧化，以及芽胞桿菌屬、乳球菌屬、鞘氨醇單胞菌屬等微生物的直接氧化。

由不同銅離子濃度對SWA1生物降解TCE的影響結(jié)果 (圖2) 可知，銅離子濃度為0.03 μmol/L時，TCE降解率為95.75%，高于另一降解峰值的84.75%。對照不同銅離子濃度對混合菌群SWA1中微生物特性的影響結(jié)果(表3)，該樣本中乳球菌屬、鞘氨醇單胞菌屬及芽胞桿菌屬豐度為13.08%、2.82%和7.94%高于另一峰值樣本中的6.29%、1.54%和4.28%。這一結(jié)果有力地證明了低濃度銅離子區(qū)間，除了共代謝降解作用，直接氧化作用對TCE降解也起到了關(guān)鍵作用。這些微生物之間存在共營養(yǎng)，共代謝等互利共生關(guān)系。研究表明Ⅱ型甲烷氧化菌利用絲氨酸途徑代謝碳，主要含18-C磷酸脂肪酸，胞內(nèi)膜分布于細胞壁周圍[18]，在甲烷氧化菌MMO代謝甲烷及TCE的過程中產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物如甲醇、甲醛等可能為其他非甲烷氧化菌提供了碳源等，維持了非甲烷氧化菌的存在，共存的非甲烷氧化菌在獲得碳源后，產(chǎn)生的一些酶進而可以促進TCE的代謝降解。

表2　典型樣品的高通量測序序列信息和多樣性指數(shù)Table 2 Diversity indices and sequence information of high throughput sequencing for experimental samples

表3　不同銅離子濃度對混合菌群SWA1中微生物特性的影響Table 3 Biological characteristics and number of sequences in genus level of mixed communities under different copper ion concentration

3　結(jié)論

以甲烷為碳源，在生活垃圾填埋覆蓋土中分離得到了能穩(wěn)定生長的混合菌群SWA1。該混合菌群對TCE有較強的降解作用，銅離子能夠促進其混合菌群生長和TCE降解。pMMO是TCE降解過程中的關(guān)建酶，在銅離子濃度為0.03 μmol/L時，pmoA基因和mmoX基因的轉(zhuǎn)錄表達豐度出現(xiàn)峰值，添加銅離子有利于LmpH基因的表達。

混合菌群SWA1中優(yōu)勢微生物為甲基孢囊菌科Methylocystaceae的甲烷氧化菌，此外還有乳球菌屬Lactococcus和芽胞桿菌屬Bacillus等可降解TCE的微生物。銅離子能夠改變混合菌群微生物群落結(jié)構(gòu)，由0.03 μmol/L增加到5 μmol/L時，Methylocystaceae比例提高了39.32%，但菌群的生物多樣性顯著降低。

隨著銅離子濃度的變化，混合菌群對TCE的降解存在多種機制。在低濃度區(qū) (0?0.75 μmol/L)主要是MMO的共代謝降解和以TCE作為碳源的直接降解；在高濃度區(qū) (1?15 μmol/L)，主要是甲烷氧化菌群和含苯酚羥化酶菌群的共代謝降解。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

農(nóng)業(yè)生物技術(shù)

Effects of copper on biodegradation mechanism of trichloroethylene by mixed microorganisms

Yanhui Gao1, Tiantao Zhao1, Zhilin Xing1,2, Zhi He1, Lijie Zhang1, and Xuya Peng2
1 College of Chemistry and Chemical Engineering, Chongqing University of Technology, Chongqing, 400054, China
2 College of Urban Construction and Environmental Engineering, Chongqing University, Chongqing 400045, China

Abstract:We isolated and enriched mixed microorganisms SWA1 from landfill cover soils supplemented with trichloroethylene (TCE). The microbial mixture could degrade TCE effectively under aerobic conditions. Then, we investigated the effect of copper ion (0 to 15 μmol/L) on TCE biodegradation. Results show that the maximum TCE degradation speed was 29.60 nmol/min with 95.75% degradation when copper ion was at 0.03 μmol/L. In addition, genes encoding key enzymes during biodegradation were analyzed by Real-time quantitative reverse transcription PCR (RT-qPCR). The relative expression abundance of pmoA gene (4.22E-03) and mmoX gene (9.30E-06) was the highest when copper ion was at 0.03 μmol/L. Finally, we also used MiSeq pyrosequencing to investigate the diversity of microbial community. Methylocystaceae that can co-metabolic degrade TCE were the dominant microorganisms; other microorganisms with the function of direct oxidation of TCE were also included in SWA1 and the microbial diversity decreased significantly along with increasing of copper ion concentration. Based on the above results, variation of copper ion concentration affected the composition of SWA1 and degradation mechanism of TCE. The degradation mechanism of TCE included co-metabolism degradation of methanotrophs and oxidation metabolism directly at copper ion of 0.03 μmol/L. When copper ion at 5 μmol/L (biodegradation was 84.75%), the degradation mechanism of TCE included direct-degradation and co-metabolism degradation of methanotrophs and microorganisms containing phenol hydroxylase. Therefore, biodegradation of TCE by microorganisms was a complicated process, the degradation mechanism included co-metabolism degradation of methanotrophs and bio-oxidation of non-methanotrophs.

Keywords:mixed microorganisms, trichloroethylene, key enzymes, community structure, degradation mechanism

Corresponding author:Tiantao Zhao. Tel: +86-23-62563617; Fax: +86-23-62563221; E-mail: zhaott@cqut.edu.cn