大鼠少突膠質(zhì)前體細胞(OPCs) 純化培養(yǎng)及糖氧剝奪(OGD )模型的建立

付佩彩 黃珊珊 唐榮華 趙東明

(華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院:1神經(jīng)內(nèi)科;2骨科，武漢 430030)

少突膠質(zhì)前體細胞(OPCs)是近年來發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)膠質(zhì)前體細胞，約占成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中所有膠質(zhì)細胞的5%－8%。OPCs細胞形態(tài)為雙極、三級或多級，其特異性標(biāo)記物為 NG2+A2B5［1］。OPCs持續(xù)存在于成年CNS中，為處于早期分化的未成熟細胞，在缺血缺氧等導(dǎo)致的脫髓鞘損傷后，少突膠質(zhì)前體OPCs活化增殖，遷移至損傷處，分化形成少突膠質(zhì)細胞(OL)，進而形成髓鞘，完成髓鞘再生過程［2，3］。最新的研究證實少突膠質(zhì)細胞還具有供給神經(jīng)元能量的功能，在生理狀態(tài)下，少突膠質(zhì)細胞能代謝轉(zhuǎn)運乳酸為神經(jīng)元提供能量支持，幫助神經(jīng)元的存活［4，5］。因此，少突膠質(zhì)細胞的病理改變不僅可引起CNS廣泛的脫髓鞘病變，而且也極可能參與以神經(jīng)元軸突缺失和神經(jīng)性萎縮為特性的神經(jīng)退行性疾病的病理進程。

本實驗采用震搖、差速貼壁法培養(yǎng)高純度OPCs，并進一步觀察其分化為OL能力并建立OGD模型，以期為探討神經(jīng)退行性病變發(fā)病機制建立進一步試驗基礎(chǔ)。

材料和方法

1.動物與試劑

實驗用SD大鼠乳鼠購自華中科技大同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。胎牛血清、DMEM/HIGH GLUCOSE培養(yǎng)液、N2 supplement(100×)、胰蛋白酶、B27 supplement(50×)、DMEM/F12購自美國GIBCO公司;T3購自invitrogen公司;多聚賴氨酸(polylysine，PLL)、DAPI試劑購自美國 Sigma公司;Rat CNTF、Rat FGF Basic、Human PDGF－AA 購自 Peorotech公司。兔抗NG2購自美國neuromarker公司;鼠抗A2B5購自美國Millipore公司;Edu試劑盒購自上海銳博公司;CY3標(biāo)記羊抗兔IgG、FITC標(biāo)記羊抗小鼠IgG購自美國Jackson公司。

2.混合膠質(zhì)細胞培養(yǎng)

出生3d內(nèi)SD大鼠乳鼠經(jīng)75%乙醇消毒后，用眼科剪和眼科鑷取腦，在PBS液中充分漂洗;把腦剔除腦膜后，腦組織用眼科剪剪成小塊，置于37℃0.125%胰酶中消化10 min;含20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，用巴氏管反復(fù)吹打腦組織使其分散成細胞懸液，細胞懸液用200目的篩網(wǎng)過濾;過濾后的懸液置4℃的低溫離心機中以800 r/min的速度離心8 min。棄去上清液，用培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，接種于用多聚賴氨酸預(yù)包被的細胞培養(yǎng)瓶(T75)中;置于普通細胞培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2)中培養(yǎng)，培養(yǎng)第3天將培養(yǎng)基更換為含20%胎牛血清的DMEM/高糖培養(yǎng)基，之后每3－4天換液一次;直至混合膠質(zhì)細胞長滿培養(yǎng)瓶底(約10d)。

3.OPCs分離純化培養(yǎng)及鑒定

待混合膠質(zhì)細胞長滿培養(yǎng)瓶瓶底后，擰緊培養(yǎng)瓶瓶蓋，并用封口膠封閉瓶口。將培養(yǎng)瓶置于37℃恒溫搖床振搖，設(shè)參數(shù)為180 r/min，先預(yù)振搖2h，然后棄上清，更換新的培養(yǎng)基，繼續(xù)置于37℃恒溫搖床振搖，參數(shù)不變，振搖15－18h;后轉(zhuǎn)移振搖后的細胞上清，種于未包被的100 mm培養(yǎng)皿中，置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中，使其靜置貼壁1h，吸取上清，此步驟可進一步去除小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞;收集上清于離心管中離心(800 r/min×8 min)，棄去上清，用 OPCs培養(yǎng)基(含 10ng/ml PDGF－AA、10ng/ml FGF Basic、1×N2、1×B27的DMEM/F12培養(yǎng)基)重懸后，種于含有PLL預(yù)包被的蓋玻片的24孔板及96孔板中。

OPCs隔天換液，培養(yǎng)3d后換用OL分化培養(yǎng)基(含 10ng/ml CNTF、50ng/ml T3、1 × N2、1 × B27 的DMEM/F12培養(yǎng)基)以分化培養(yǎng)OL及進行MTT及EdU檢測。

4.OGD干預(yù)

OPCs純化培養(yǎng)3d后，將細胞分為Control組及OGD組進行實驗。其中Control組在實驗開始時換用新鮮培養(yǎng)液，OGD組換用無糖培養(yǎng)液，OGD在含1%O2，5%CO2，37℃條件下培養(yǎng) 0.5h、1h、2h 及 4h。

5.免疫熒光染色

將24孔板中細胞爬片在干預(yù)各時間點吸除原培養(yǎng)基，用PBS漂洗3次，后用預(yù)冷的4%多聚甲醛固定30min，吸除固定液，PBS漂洗3次，用含0.2%triton－X100的PBS室溫破膜15min，吸除破膜液后PBS漂洗3次，BSA封閉1h后，加入預(yù)先用抗體稀釋液稀釋的對應(yīng)一抗(anti－NG2、anti－A2B5 和 anti－MBP)4℃封閉過夜。PBS清洗，加入對應(yīng)二抗(FITC羊抗鼠IgG、CY3羊抗兔IgG)避光條件下室溫孵育1h。棄二抗，漂洗后DAPI染核8min，PBS漂洗3次，用50%甘油封片，各爬片在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

6.MTT測定細胞活力

震搖純化后 OPCs離心重懸，調(diào)整密度至1×106/ml，每孔加入 200μl至 96孔板中，培養(yǎng) 3d后，按照實驗分組設(shè)計分別換成相應(yīng)培養(yǎng)基，每組分別設(shè)8個平行孔，在各時間點吸除上清，每孔分別加入 50μL MTT(5mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)，4h后吸除MTT，每孔加入DMSO 100μl，充分振蕩，使紫色結(jié)晶物溶解，最后在酶標(biāo)儀上以490nm波長測取每孔的吸光度值(OD490)。

7.EdU檢測細胞增殖

將OPCs調(diào)整密度至1×106/m l，接種于含有PLL預(yù)包被的蓋玻片的24孔板，每孔500μl，培養(yǎng)3d后，按照實驗分組設(shè)計分別換成相應(yīng)培養(yǎng)基。在各時間點前2小時加入50μM EdU培養(yǎng)基，分別在各設(shè)定時間點漂洗細胞后加入細胞固定液。按EdU試劑盒說明書進行染色，染色成功后照相。

8.統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準差()表示，組間比較采用方差分析。檢驗水準 α=0.05，以P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.OPCs的鑒定及分化

原代培養(yǎng)的OPCs細胞多為雙極性，少數(shù)為3極或多極。將OPCs做NG2+A2B5免疫熒光染色，結(jié)果顯示原代培養(yǎng)的OPCs 95%以上表達OPCs特異性標(biāo)記物NG2+A2B5(圖1A)。進一步分化試驗顯示，原代培養(yǎng)的OPCs可分化為MBP陽性的OL細胞(圖1B)。

2.M TT檢測OPCs的活力

與Control組相比，OGD組細胞活力在0.5h無明顯改變，在干預(yù)1h及2h時細胞活力降低;其中在干預(yù)2h時細胞活力降低明顯，干預(yù)4h時細胞活力降低更加顯著(P＜0.05)(圖2)

3.EdU檢測OGD不同時間點OPCs增殖

OGD組干預(yù)后1h，2h及4h時EdU陽性率較對照組顯著降低(P＜0.05)，干預(yù)0.5h時各組間無統(tǒng)計學(xué)差異(圖3)。

圖1 OPCs特異性鑒定分化:A1為NG2染色陽性，A2為細胞核A2B5染色陽性，A3為A1與A2及DAPI的合成圖;B1為MBP染色陽性，B2為細胞核DAPI染色，B3為B1與B2的合成圖。Bar=25μmFig.1 The specific identification of OPCs and OL:A1:NG2 positive staining，A2:A2B5 positive nuclear staining，A3:DAPIstainingmerged with A1 and A2;B1:MBP positive staining，B2:DAPIstaining，B3:B1 and B2 merged figure

圖2 不同干預(yù)組OPCs的MTT檢測統(tǒng)計圖.*P＜0.05Fig.2 The statistical figure of MTT test of OPCs by different intervention.*P＜0.05

圖3 不同干預(yù)組EdU陽性率檢測結(jié)果 A為Control組EdU陽性率(A1為EdU著色，A2為DAPI，A3為合成圖);B為OGD2h組EdU陽性率(B1為EdU著色，B2為DAPI，B3為合成圖);C各組EdU陽性細胞率的統(tǒng)計圖(*P＜0.05)Fig.3 Results of EdU positive staining rate in different groups A:EdU positive staining in the Control group(A1:EdU staining，A2:DAPIstaining，A3:A1 and A2 merged);B:EdU positive staining in 2h OGD group(B1:EdU staining，B2:DAPIstaining，B3:A1 and A2 merged;C:The statistical figure of EdU positive rate by different intervention(*P＜0.05)

討 論

顱腦缺血性損傷(卒中)、脊髓損傷、腦室周圍白質(zhì)軟化以及多發(fā)性硬化等多種CNS疾病均可導(dǎo)致OL大量死亡，引發(fā)廣泛的脫髓鞘病變，造成神經(jīng)功能損傷［6－8］。目前諸多研究已證實少突膠質(zhì)細胞功能失調(diào)參與了許多神經(jīng)退行性疾病的致病，以肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)為代表的遺傳性運動神經(jīng)元退變疾病中，少突膠質(zhì)細胞的形態(tài)異常改變遠早于疾病的發(fā)生并且疾病的發(fā)展最終導(dǎo)致少突膠質(zhì)細胞的死亡［9］。成熟的OL自身不可再生修復(fù)，其再生依賴于OPCs的增殖分化［10］。OPCs在鼠類胚胎期E 14.5d出現(xiàn)，在成熟中樞神系統(tǒng)中持續(xù)存在，在脫髓鞘損傷后，OPCs可遷移并分化為成熟OL，促進髓鞘修復(fù)。因此，OPCs的體外培養(yǎng)對研究脫髓鞘疾病及神經(jīng)退行性病變具有重要價值。

目前報道的OPCs培養(yǎng)方法包括切片培養(yǎng)法、免疫抗體包被篩選法、振搖法、神經(jīng)球誘導(dǎo)分化法等［11－13］。上述方法像切片培養(yǎng)法主要用于原位研究OPCs細胞行為學(xué)，不是以擴增和純化為目的的培養(yǎng);免疫抗體包被篩選法耗費抗體多，實驗成本大;而神經(jīng)球誘導(dǎo)分化法容易出現(xiàn)星形膠質(zhì)細胞及神經(jīng)元等雜細胞。本實驗采用改良振搖法可避免上述耗費成本高等缺陷，且一次培養(yǎng)混合細胞可振搖后重新培養(yǎng)，可重復(fù)振搖2－3次，細胞純度達到95%以上，且可同時得到純度較高的小膠質(zhì)細胞，可用于需要大量細胞的試驗。然而，在分離培養(yǎng)OPCs過程中，有下列幾點需要注意:(1)取材需把標(biāo)本置于冰上進行，這樣可最大限度保持細胞的活性。(2)控制好胰酶消化的時間，限定在10min左右。(3)振搖法的過程設(shè)計的選擇是根據(jù)細胞貼壁牢固程度確定的，懸液中各種細胞貼壁牢固程度從大到小排序為星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)前體細胞、小膠質(zhì)細胞。預(yù)搖2h首先可將部分小膠質(zhì)細胞去除，振搖15－18h后OPCs可從貼壁的混合膠質(zhì)細胞層搖下，此時收集細胞上清，再行貼壁培養(yǎng)1h，然后取細胞上清，此步驟可進一步去除殘留的星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞，這是因為三種細胞中，OPCs的貼壁時間最長。(4)振搖時封閉培養(yǎng)瓶瓶口的目的是創(chuàng)造缺氧環(huán)境，該環(huán)境有利于OPCs分離進入懸液中。(5)振搖和貼壁要嚴格把握參數(shù)和時間，否則影響OPCs的純度和獲得細胞量。

近年來，神經(jīng)細胞體外缺氧培養(yǎng)的同時合并培養(yǎng)基缺糖已被公認為模擬體內(nèi)氧化應(yīng)激損傷合適的模型。關(guān)于OPCs缺血缺氧損傷的體外試驗較少，文獻中OGD干預(yù)時間及氧濃度不等，其中干預(yù)時間主要為 0.5 －2h［14－16］。本試驗中，我們通過對 OPCs 糖氧剝奪后，使用MTT檢測細胞活力以及EdU試劑盒檢測細胞增殖。結(jié)果顯示，OGD干預(yù)0.5h后，與對照組相比，細胞活力及細胞增殖均無明顯差別。干預(yù)1h、2h及4h后，與對照組相比，OPCs細胞活力及細胞增殖均有下降(P＜0.05)，其中干預(yù)2h時，MTT下降明顯，細胞增殖減低約為40－50%，故我們考慮2h可作為OPCs體外糖氧剝奪模型合適的試驗損傷時間，干預(yù)4h時，細胞損傷明顯，故不再延長干預(yù)時間。

綜上所述，本文中我們采用震搖、差速貼壁法培養(yǎng)出高純度的OPCs，且培養(yǎng)的OPCs具有分化成為OL的能力。2h可作為OPCs體外OGD模型建立的合適時間。

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