GFER抑制四氯化碳對(duì) HepG2細(xì)胞的損傷

高 見 董凌月 安 威

（首都醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)系，肝臟保護(hù)與再生調(diào)節(jié)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069）

GFER抑制四氯化碳對(duì) HepG2細(xì)胞的損傷

高 見 董凌月 安 威*

（首都醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)系，肝臟保護(hù)與再生調(diào)節(jié)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069）

目的 探討 HepG2細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)因子 ERV1樣基因（growth factor Erv1-gene，GFER）表達(dá)降低后對(duì)四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的影響，以進(jìn)一步明確GFER對(duì)于肝細(xì)胞的保護(hù)作用。方法 首先將 GFER siRNA轉(zhuǎn)染入 HepG2細(xì)胞，72 h后收集細(xì)胞并通過Western Blot檢測(cè)GFER的表達(dá)以明確沉默效率。再次將GFER siRNA轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞72 h后，用CCl4處理細(xì)胞6 h和24 h，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi) ATP的含量，caspase-3的活性，并應(yīng)用MTS方法測(cè)定細(xì)胞的增殖能力以及 TUNEL方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果 Western blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染 GFER siRNA后細(xì)胞內(nèi) GFER的表達(dá)降低。CCl4處理細(xì)胞6 h后，GFER表達(dá)降低使細(xì)胞的增殖能力下降，細(xì)胞內(nèi) ATP含量增加，細(xì)胞凋亡更為明顯。CCl4處理 24 h后，GFER表達(dá)降低使細(xì)胞的增殖能力進(jìn)一步下降，Caspase 3活性進(jìn)一步升高，凋亡細(xì)胞數(shù)目顯著增多，而 ATP的含量明顯下降。結(jié)論 GFER表達(dá)降低促進(jìn) CCl4對(duì) HepG2細(xì)胞的損傷。

生長(zhǎng)因子樣基因；四氯化碳；HepG2；caspase-3；凋亡

肝臟是人體重要的器官，具有復(fù)雜的生物學(xué)功能。肝臟具有很強(qiáng)的再生功能，肝大部分切除或受到各種毒物、藥物損傷后均可以啟動(dòng)肝再生過程［1］。多種生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子參與肝再生進(jìn)程，其中肝臟自身產(chǎn)生的肝刺激因子（hepatic stimulator substance，HSS）因具有很強(qiáng)的促肝細(xì)胞增殖作用，一直備受關(guān)注。HSS最初是在1975年從初斷乳的大鼠肝臟中提取的一種可以刺激肝部分切除后再生的的活性物質(zhì)［2，3］。隨后對(duì) HSS基因及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究 發(fā)現(xiàn)，HSS與酵母ERV1（essential for respiration and viability）具有較高的同源性，屬于同一家族，因此又將HSS基因稱為生長(zhǎng)因子 ERV1樣基因（Growth Factor Erv1-Like gene，Gfer）［4］。Gfer主要定位于線粒體膜間隙中，具有巰基氧化酶和細(xì)胞色素c還原酶的活性，參與線粒體的氧化磷酸化過程［5-7］。同時(shí)，Gfer還可以穩(wěn)定線粒體膜電位，抑制線粒體途徑的細(xì)胞凋亡，是肝細(xì)胞內(nèi)至關(guān)重要的存活因子之一［8］。除此之外，還有研究表明 Gfer可以減輕 CCl4或氨基半乳糖對(duì)肝細(xì)胞的毒性損傷，具有很強(qiáng)的肝細(xì)胞保護(hù)作 用［9-10］。

有關(guān) Gfer在 CCl4對(duì)肝細(xì)胞損傷中的保護(hù)作用研究，多采用 Gfer過表達(dá)，而關(guān)于 Gfer沉默在CCl4對(duì)肝細(xì)胞損傷中作用則鮮少報(bào)道。RNAi是一種由雙鏈RNA引起的序列特異性基因沉默。它通過產(chǎn)生小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA），通過一系列反應(yīng)，使與siRNA有同源序列的mRNA降解，從而達(dá)到抑制目的基因表達(dá)的目的。因此本實(shí)驗(yàn)通過轉(zhuǎn)染 Gfer siRNA的方法使 HepG2細(xì)胞中Gfer的表達(dá)下調(diào)，隨后用CCl4處理細(xì)胞，探究Gfer表達(dá)下調(diào)后在 CCl4對(duì)肝細(xì)胞損傷中的作用，從而進(jìn)一步證實(shí)Gfer對(duì)肝臟具有重要的保護(hù)功能。

材料和方法

1.材料

1.1 細(xì)胞

HepG2細(xì)胞系（首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存）。

1.2 siRNA

Gfer siRNA和 scramble siRNA（與人和鼠基因序列沒有同源的 siRNA）合成于美國(guó) GE Dharmacon公司。

1.3 主要試劑

CellTiter-Glo?Luminescent Cell Viability Assay試劑盒（美國(guó)Promega公司）；Caspase-Glo?3／7Assay試劑盒（美國(guó)Promega公司）；CellTiter 96?Aqueous試劑盒（美國(guó)Promega公司）；In Situ Cell Death Detection Kit（瑞士 Roche公司）；BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒（美國(guó)Pierce公司）；Gfer多克隆抗體（本室制備）。

2.方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2細(xì)胞生 長(zhǎng)在含 10%胎 牛血 清 的 高糖 DMEM培養(yǎng)液中，在 37℃無(wú)菌條件下，于 95%的相對(duì)濕度、5%CO2恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每48至 72 h傳代 1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

按DharmaFECTTMtransfection reagent說(shuō)明書（美國(guó)GE Dharmacon公司）的操作方法將siRNA轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，收集細(xì)胞提取蛋白質(zhì)，用于Western Blot實(shí)驗(yàn)。

2.3 Western Blot

在4℃條件下，加入細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)后，依照 BCA Protein Assay試劑盒說(shuō)明書測(cè)定所提取樣品蛋白質(zhì)的含量。每個(gè)樣品取70 μg蛋白質(zhì)于100℃煮沸5 min后立即置于冰上5 min。將樣品置于12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳 2 h，采用濕轉(zhuǎn)的方法，恒壓 80 V，2 h將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，將膜放入含5%脫脂奶粉的 TBST溶液中封閉1 h，用抗體稀釋液將Gfer多克隆抗體按 1∶1000稀釋后與膜 4℃共同孵育過夜，羊抗兔二抗按 1∶5000稀釋后與膜室溫孵育1 h，于 X線片上曝光，常規(guī)顯影定影。洗膜液將 Gfer多克隆抗體洗去后，再次將膜與GAPDH單克隆抗體孵育，作為實(shí)驗(yàn)內(nèi)參。

2.4 CCl4處理 HepG2細(xì)胞

將 Gfer siRNA和 scramble siRNA分別轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞，72 h后換用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng) 6 h，加入含0.25%（v／v）DMSO的CCl4（1%v／v）或0.25%（v／v）DMSO，繼續(xù)孵育6 h或24 h。

2.5 MTS實(shí)驗(yàn)

依據(jù)CellTiter 96?Aqueous試劑盒（Promega）說(shuō)明書操作，步驟如下：CCl4處理細(xì)胞 6 h或 24 h后，棄培養(yǎng)基，加入100 μl新鮮的無(wú)血清、無(wú)雙抗的培養(yǎng)基。CellTiter 96?AQueous One Solution Reagent室溫靜置使其完全融化，取20 μl加入細(xì)胞培養(yǎng)基中。在37℃，5%CO2恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，在490nm讀取吸光度值并記錄。

2.6 ATP含量測(cè)定

根據(jù) CellTiter-Glo?Luminescent Cell Viability Assay試劑盒（Promega）說(shuō)明書操作，步驟如下：CCl4處理細(xì)胞6 h或24 h后，棄培養(yǎng)基，加入100 μl新鮮的無(wú)血清、無(wú)雙抗的培養(yǎng)基后，再加入等體積的Cell-Titer-Glo?試劑。定軌振蕩器上振蕩混合2 min，誘導(dǎo)細(xì)胞裂解。室溫繼續(xù)孵育10 min，使熒光信號(hào)值穩(wěn)定，在熒光檢測(cè)儀中檢測(cè)熒光信號(hào)。

2.7 Caspase-3活性檢測(cè)

根據(jù) Caspase-Glo?3／7Assay試劑盒（Promega）說(shuō)明書操作，步驟如下：CCl4處理細(xì)胞 6 h或24 h后，棄培養(yǎng)基，加入 100 μl新鮮的無(wú)血清、無(wú)雙抗的培養(yǎng)基后，再加入等體積的 Caspase-Glo?3／7試劑。定軌振蕩器上振蕩混合30 sec，室溫繼續(xù)孵育1h，在熒光檢測(cè)儀中檢測(cè)熒光信號(hào)。

2.8 TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)

根據(jù) In Situ Cell Death Detection Kit試劑盒（Roche）說(shuō)明書操作，步驟如下：CCl4處理細(xì)胞 6 h或24 h后，棄培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定細(xì)胞 60 min后，加入含 0.1%Triton X-100的 0.1%檸檬酸鈉溶液，冰上孵育2 min；加入 TUNEL reaction mixture避光37℃孵育60 min，PBS洗滌細(xì)胞后，置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用 student’t檢驗(yàn)。P＜0.05被認(rèn)為有顯著性差異，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次。

結(jié) 果

1.Gfer siRNA明顯降低 HepG2細(xì)胞內(nèi) Gfer的表達(dá)

將Gfer siRNA和 scramble siRNA分別轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞，72 h收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，并利用 Western Blot方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi) Gfer的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染scramble siRNA相比，轉(zhuǎn)染 Gfer siRNA后細(xì)胞內(nèi) Gfer的表達(dá)明顯降低，下降約60%，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1）。說(shuō)明選擇的Gfer siRNA能有效的降低 Gfer的表達(dá)，可以應(yīng)用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中。

圖1 Gfer siRNA轉(zhuǎn)染 HepG2細(xì)胞后 Gfer表達(dá)降低，*與scramble組相比，P＜0.05Fig.1 The expression of Gfer is inhibited by Gfer siRNA. *P＜0.05，compared with the scramble-treated group

2.Gfer表達(dá)降低增強(qiáng)了CCl4對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用

將Gfer siRNA和 scramble siRNA分別轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞，72 h后分別用DMSO或 CCl4處理細(xì)胞 6 h和24 h，隨后利用 MTS試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。如圖2所示，細(xì)胞轉(zhuǎn)染 Gfer siRNA后，即使只加入DMSO，細(xì)胞增殖也受到了明顯地抑制。CCl4處理6 h后，無(wú)論scramble siRNA組還是Gfer siRNA組細(xì)胞增殖能力均明顯下降，其中 Gfer表達(dá)下調(diào)后細(xì)胞增殖能力抑制則更為明顯。CCl4處理24 h后，兩組細(xì)胞活力進(jìn)一步下降，尤以 Gfer siRNA組下降更為明顯。

圖2 Gfer表達(dá)降低增強(qiáng)了 CCl4對(duì) HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用。*P＜0.05Fig.2 The inhibition of Gfer expression potentiate the growth inhibition of HepG2 cells induced by CCl4.*P＜0.05

3.Gfer表達(dá)降低加劇 CCl4處理 HepG2細(xì)胞后ATP水平的改變

脂溶性的CCl4除可以通過直接膜溶解作用對(duì)肝細(xì)胞造成損傷外，還可以損傷線粒體，引起線粒體的功能紊亂，影響氧化磷酸化，從而改變細(xì)胞內(nèi) ATP的水平［11］。細(xì)胞轉(zhuǎn)染Gfer siRNA后，與scramble組相比，細(xì)胞內(nèi) ATP的含量并沒有明顯的變化（圖 3）。CCl4處理6 h后，無(wú)論 scramble組還是Gfer siRNA組細(xì)胞內(nèi)的ATP含量均明顯增加，但 Gfer siRNA組增加更為明顯。而CCl4處理24 h后，兩組細(xì)胞內(nèi) ATP的含量均顯著下降，且Gfer siRNA組降低更為明顯（圖3）。

圖3 Gfer表達(dá)降低對(duì)CCl4處理的HepG2細(xì)胞內(nèi)ATP水平的影響。*P＜0.05，**P＜0.01Fig.3 The effect of decreased Gfer on intracellular ATP level in HepG2 cells after CCl4treatment.*P＜0.05，**P＜0.01

4.Gfer表達(dá)降低使CCl4誘導(dǎo)的 HepG2細(xì)胞凋亡增加

CCl4對(duì)肝細(xì)胞的急性損傷，可以誘發(fā)細(xì)胞凋亡，激活細(xì)胞內(nèi) Caspase-3。細(xì)胞轉(zhuǎn)染 Gfer siRNA后，與scramble組相比，細(xì)胞內(nèi) Caspase-3活性并沒有發(fā)生明顯的變化（圖4）。CCl4處理6 h后，無(wú)論 scramble組還是Gfer siRNA組細(xì)胞內(nèi)的 Caspase-3活性均明顯增加。而 Gfer siRNA組使Caspase-3活性增加更為明顯。CCl4處理24 h后，兩組細(xì)胞內(nèi)Caspase-3活性進(jìn)一步增加，且Gfer siRNA組明顯高于 scramble組（圖4）。

TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞轉(zhuǎn)染Gfer siRNA后，與 scramble組相比，出現(xiàn)凋亡細(xì)胞，但數(shù)目較少。而 CCl4處理 24 h后，scramble組及Gfer siRNA組的凋亡細(xì)胞數(shù)目均有所增多，且Gfer siRNA組的凋亡細(xì)胞數(shù)顯著多于 scramble組（圖5）。

圖4 Gfer表達(dá)降低促進(jìn)了 CCl4所誘導(dǎo)的 HepG2細(xì)胞內(nèi)Caspase-3活性的增強(qiáng)。*P＜0.05，**P＜0.01Fig.4 Downregulation ofGfer enhance the activation of Caspase-3 in HepG2 cells induced by CCl4.*P＜0.05，**P＜0.01

圖5 CCl4處理 HepG2細(xì)胞24h后，觀察Gfer表達(dá)量降低對(duì)細(xì)胞凋亡的影響Fig.5 The effects of decreased Gfer expression on the HepG2 cells apoptosis intoxicated by CCl4for 24h.A，DMSO＋scramble siRNA；B，DMSO＋Gfer siRNA；C，CCl4＋scramble siRNA；D，CCl4＋Gfer siRNA

討 論

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用轉(zhuǎn)染siRNA的方法下調(diào)細(xì)胞內(nèi) Gfer的表達(dá)。為避免選用的 siRNA發(fā)生脫靶現(xiàn)象，我們選擇四個(gè)具有不同靶序列的 siRNA組合在一起，一同轉(zhuǎn)染入 HepG2細(xì)胞，72 h后檢測(cè)沉默效率。三次不同實(shí)驗(yàn)均顯示 Gfer siRNA轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞內(nèi)的Gfer表達(dá)明顯下降，說(shuō)明選擇的Gfer siRNA組合有效，可以用于研究Gfer表達(dá)下調(diào)對(duì)細(xì)胞的影響。

CCl4可以損傷肝細(xì)胞，其損傷機(jī)制是 CCl4作用肝細(xì)胞后，經(jīng)肝細(xì)胞微粒體細(xì)胞色素氧化酶系統(tǒng)代謝、激活后生成 CCl3，CCl3攻擊肝細(xì)胞膜或激活膜上的磷酸化酶，引起細(xì)胞膜和細(xì)胞器質(zhì)膜過氧化損傷［12］。多項(xiàng)研究證實(shí)在肝細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)Gfer后，可通過保護(hù)線粒體，避免細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)肝細(xì)胞免受 CCl4的損傷。而我們的實(shí)驗(yàn)則通過下調(diào)Gfer表達(dá)，觀察 CCl4處理細(xì)胞細(xì)胞增殖能力、ATP含量和Caspase-3活性。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞消耗ATP的主動(dòng)死亡形式，當(dāng)毒物作用于細(xì)胞較短時(shí)間時(shí)，細(xì)胞處于凋亡早期階段，這時(shí)細(xì)胞內(nèi)需要大量合成ATP，以誘導(dǎo)并推進(jìn)細(xì)胞完成凋亡［13-14］。但當(dāng) CCl4處理細(xì)胞24 h后，活細(xì)胞數(shù)目大量減少，此時(shí)細(xì)胞內(nèi)ATP含量明顯減少，說(shuō)明細(xì)胞已處于凋亡晚期。證明 Gfer的降低和CCl4類似，同樣也是造成細(xì)胞損傷的一種因素。有文獻(xiàn)報(bào)道 Gfer定位于線粒體膜間隙，其可以還原細(xì)胞色素 c，具備細(xì)胞色素 c還原酶的活性，并參與組成二硫鍵傳遞系統(tǒng)來(lái)介導(dǎo)蛋白向線粒體膜間腔的轉(zhuǎn)運(yùn)，可以增加線粒體氧化磷酸化活性［15］。轉(zhuǎn)染 Gfer的肝細(xì)胞其抵抗自由基損傷的能力大大提高，這與Gfer保護(hù)線粒體功能，穩(wěn)定線粒體膜電位，抑制細(xì)胞線粒體途徑的細(xì)胞凋亡密切相關(guān)［8］。Gfer還可以通過抑制線粒體膜電位通透性轉(zhuǎn)換孔的開放，減少細(xì)胞色素C的泄露，上調(diào)抗凋亡基因 Bcl-2的表達(dá)從而減輕毒性物質(zhì)對(duì)肝細(xì)胞的損傷［16］。在本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)降低 Gfer的表達(dá)可以加重CCl4對(duì) HepG2細(xì)胞的損傷，CCl4誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡更為明顯。其機(jī)制可能和 Gfer的下調(diào)導(dǎo)致細(xì)胞線粒體功能失調(diào)有關(guān)，有待我們進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中也有文獻(xiàn)報(bào)道稱 Gfer表達(dá)降低可以延緩小鼠肝大部分切除術(shù)后的肝臟再生以及 CCl4損傷后的肝臟修復(fù)［17］，證明 Gfer對(duì)肝臟具有重要的保護(hù)作用。

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GFER Restrains Injury Induced by CCl4in HepG2 Cells

Gao Jian，Dong Lingyue，An Wei*
（Department of Cell Biology，Municipal Key laboratory for Liver Protection and Regulation of Regeneration，Capital Medical University，Beijing 100069，China）

Objective To explore the effects of downregulation of GFER gene expression on cell injury induced by CCl4in HepG2 cells so as to elucidate the protective effect of GFER on hepatocytes.Methods GFER siRNA was transfected into HepG2 cells for 72 h，and western blot was used to detect the protein level of GFER in order to assess transfection efficiency.After 72 h of GFER siRNA interference，the HepG2 cells were treated with CCl4for 6 h and 24 h.ATP levels and caspase-3 activity were measured.MTS assay was used to measure cell proliferation.TUNEL was used to detect and quantify apoptotic cell death.Results Western blot analysis showed that the protein level of GFER was decreased after GFER siRNA transfectioin.Cell proliferation of HepG2 cells was inhibited by GFER siRNA interference，while the ATP levels and the number of apoptotic cells were both increased after 6 h of CCl4treatment in the siRNA intervention group as compared to the controls.When cells were treated with CCl4for 24 h，proliferation of HepG2 cells was further inhibited after siRNA intervention，and the caspase-3 activity and the number of apoptotic cells were further increased compared to the results obtained at 6 h after CCl4treatment.However，the ATP levels in HepG2 cells were markedly decreased.Conclutsion Downregulation of GFER gene expression aggravates HepG2 cell injury induced by CCl4.

GFER（growth factor Erv1-gene）；CCl4；HepG2；Caspase-3；Apoptosis

R735.7

A

10.16705／j.cnki.1004-1850.2015.05.015

2015-07-08

2015-09-28

國(guó)家自然科學(xué)基金（31371169）

高見，男（1989年），漢族，碩士研究生

*通訊作者（To whom correspondence should be addressed）：anwei＠ccmu.edu.cn