TIM4在過敏性哮喘患者單核細(xì)胞和哮喘小鼠模型肺組織表達(dá)增高

蔡鵬程 魏 燕 胡麗華

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科，武漢 430022）

TIM4在過敏性哮喘患者單核細(xì)胞和哮喘小鼠模型肺組織表達(dá)增高

蔡鵬程 魏 燕 胡麗華*

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科，武漢 430022）

目的 探討 T細(xì)胞免疫球蛋白粘蛋白域4（T cell immunoglobulin domain and mucindomain 4，TIM4）在過敏性哮喘中的表達(dá)及與疾病之間的關(guān)系。方法 隨機(jī)選取了30例過敏性哮喘患者和30例健康對照的全血標(biāo)本，流式細(xì)胞術(shù)檢測了 TIM4在單核細(xì)胞的表達(dá)水平，庫爾特計(jì)數(shù)法檢測了嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞占白細(xì)胞的比例。免疫組織化學(xué)法檢測了哮喘小鼠模型和對照小鼠肺組織 TIM4的表達(dá)水平。結(jié)果 哮喘患者組 TIM4陽性細(xì)胞占外周血單核細(xì)胞的2.51%，顯著高于健康對照組的0.68%；哮喘患者組的嗜酸性粒細(xì)胞比例（3.88%）顯著高于健康對照組（1.23%）；但TIM4表達(dá)水平與嗜酸性粒細(xì)胞，單核細(xì)胞與淋巴細(xì)胞之間未見相關(guān)性。哮喘小鼠模型氣道上皮細(xì)胞TIM4的表達(dá)水平高于小鼠對照組。結(jié)論 TIM4在過敏哮喘中的表達(dá)水平升高，可能參與了過敏性哮喘的免疫失衡機(jī)制。

TIM4；過敏性哮喘；嗜酸性粒細(xì)胞；淋巴細(xì)胞

過敏性哮喘是一種以氣道高反應(yīng)性為特征的可逆性氣道阻塞性疾病，淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等參與了氣道的慢性炎癥。Th1／Th2淋巴細(xì)胞的失衡是過敏性哮喘發(fā)病機(jī)制的重要環(huán)節(jié)。T細(xì)胞免疫球蛋白粘蛋白域4（T cell immunoglobulin domain and mucindomain 4，TIM4）主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞［1］，樹突狀細(xì)胞等抗原遞呈細(xì)胞表面，與 TIM1結(jié)合后刺激 Th2細(xì)胞的活化，促進(jìn)Th1／Th2平衡向Th2細(xì)胞偏移。已有研究表明TIM4表達(dá)的升高與胃腸道過敏性疾病的發(fā)病有關(guān)［2］，而 TIM4在過敏性哮喘中的表達(dá)水平知之甚少。因此，我們采用流式細(xì)胞術(shù)及免疫組織化學(xué)染色分別檢測了哮喘患者外周血單個(gè)核細(xì)胞及小鼠哮喘模型肺組織 TIM4的表達(dá)水平，以明確其在過敏性哮喘發(fā)病機(jī)制中的作用。

材料和方法

1.材料

1.1 材料來源

過敏性哮喘患者30例，男16例，女14例，年齡12-60歲，均來自于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院門診部和住院部。過敏性哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)：（1）反復(fù)發(fā)作喘息、氣急、胸悶或咳嗽，多與接觸變應(yīng)原、冷空氣、物理、化學(xué)性刺激、病毒性上呼吸道感染，運(yùn)動(dòng)等有關(guān)。（2）發(fā)作時(shí)在雙肺可聞及散在或彌漫性，以呼氣相為主的哮鳴音，呼氣相延長。（3）上述癥狀可經(jīng)治療緩解或自行緩解。（4）除外其它疾病所引起的喘息、氣急、胸悶和咳嗽。（5）臨床表現(xiàn)不典型者應(yīng)至少具備以下一項(xiàng)試驗(yàn)陽性：①支氣管激發(fā)試驗(yàn)或運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)陽性；②支氣管舒張?jiān)囼?yàn)陽性［一秒鐘用力呼氣容積（FEV1）增加15%以上且 FEV1增加絕對值 ＞200 ml］；③最大呼氣流量（PEF）日內(nèi)變異率或晝夜波動(dòng)率≥20%。符合1～4條或 4、5條者可以診斷為支氣管哮喘；④最少一種變應(yīng)原特異 IgE陽性或血漿 IgE高于正常參考值。對照組為協(xié)和醫(yī)院體檢中心的健康體檢者30例，男12例，女18例，年齡10－60歲，均排除了心腦血管、肝腎疾病、自身免疫性疾病和變應(yīng)性疾病的癥狀和病史。采集哮喘患者用藥前及健康體檢者抗凝全血標(biāo)本，12h內(nèi)完成檢測。本研究獲得華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院倫理委員會的批準(zhǔn)，所有研究均經(jīng)研究對象知情同意。

1.2 動(dòng)物模型

用卵清白蛋白（OVA）被動(dòng)致敏復(fù)制小鼠哮喘模型，1月齡大小 SPF級雄性小鼠，隨機(jī)分為正常對照組和哮喘組。于第1天對哮喘組每只左下腹腔注射含1mg Al（OH）3的0.5 ml 2%OVA，正常對照組注射0.5ml生理鹽水。于第9天第二次對哮喘組注射含1mg Al（OH）3的0.5 ml 2%OVA，正常對照組注射0.5ml生理鹽水。于第 14天開始每周 1，3，5哮喘組霧化2%OVA 100 ml，時(shí)間30 min；正常對照組霧化等量生理鹽水；兩組每次霧化前左腹腔注射0.2ml生理鹽水。2個(gè)月后留取肺組織標(biāo)本。

2.方法

2.1 流式細(xì)胞術(shù)

100μl人外周血加入5μlTIM4抗體，震蕩混勻后避光孵育30min，加500μl紅細(xì)胞裂解液，震蕩混勻避光裂解5min，待試管內(nèi)液體變?yōu)榧t色透明即可離心（1500r／min離心5min），輕棄上清后加入500μl PBS緩沖液洗滌一次，振蕩混勻后采用貝克曼流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，記錄 TIM4陽性細(xì)胞的百分比。

2.2 血常規(guī)檢測

用貝克曼血球儀對哮喘患者組與健康對照組的各個(gè)標(biāo)本進(jìn)行檢測，記錄淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞占白細(xì)胞的百分比。

2.3 TIM4表達(dá)的免疫組織化學(xué)檢測

小鼠新鮮肺組織標(biāo)本經(jīng) 10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片后按照說明書操作進(jìn)行免疫組化染色。經(jīng)脫蠟、脫水及水化后，相繼滴加抗 TIM4抗體、生物素標(biāo)記的二抗、鏈霉素蛋白 －過氧化物酶溶液及二氨基聯(lián)苯胺（DAB）溶液。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

TIM4百分比、淋巴細(xì)胞百分比、單核細(xì)胞百分比、嗜酸性粒細(xì)胞百分比采用非參數(shù)檢驗(yàn)（Mann Whitney test），相關(guān) 性分 析用斯 皮爾曼 秩檢 驗(yàn)（Pearman’s rank test），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.過敏性哮喘患者血 TIM4陽性單個(gè)核細(xì)胞比例高

過敏性哮喘患者組與健康對照組的年齡及性別構(gòu)成比例差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。過敏性哮喘組全血中 TIM4陽性的單個(gè)核細(xì)胞占總單個(gè)核細(xì)胞的2.51%，高于健康對照組的 0.68%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，哮喘組嗜酸性粒細(xì)胞百分比亦明顯高于健康對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞百分比在兩組間無明顯差異（圖1）。

2.TIM4的表達(dá)水平與嗜酸性粒細(xì)胞之間不具相關(guān)性

相關(guān)性分析顯示，在過敏性哮喘患者外周血中，單個(gè)核細(xì)胞TIM4的表達(dá)水平與嗜酸性粒細(xì)胞百分比之間的相關(guān)系數(shù)為0.373，P值為0.259，兩者不具相關(guān)性。TIM4表達(dá)水平與單核細(xì)胞百分比，淋巴細(xì)胞百分比之間亦無相關(guān)性（表1）。

表1 TIM4表達(dá)水平與外周血嗜酸性粒細(xì)胞，淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的相關(guān)性Table 1 Correlations between TIM4 expression level and percentages of eosinophils，monocytes，lymphocytes in peripheral blood

圖1 過敏性哮喘患者組和健康對照組外周血 TIM4表達(dá)水平及嗜酸性粒細(xì)胞，單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞百分比Fig.1 TIM4 expression level and percentages of eosinophils，monocytes，lymphocytes in peripheral blood of atopic asthma patient group and healthy control group

3.小鼠哮喘模型大氣道和中等氣道上皮細(xì)胞 TIM4表達(dá)增高

為了研究 TIM4在肺部的表達(dá)情況，我們建立了OVA被動(dòng)致敏的小鼠哮喘模型，采用免疫組織化學(xué)技術(shù)對小鼠肺組織的 TIM4進(jìn)行了染色，以出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)。在小鼠哮喘模型中，氣道內(nèi)分泌物增多，平滑肌層增厚，TIM4陽性表達(dá)主要集中于氣道的表層，以氣道上皮細(xì)胞最為顯著，TIM4的表達(dá)分布于胞膜及胞漿，以胞膜更為明顯；同時(shí)在肺結(jié)締組織也觀察到一部分表達(dá)TIM4的細(xì)胞，TIM4的表達(dá)亦分布于胞膜及胞漿。與對照組小鼠相比，哮喘模型大氣道和中等氣道上皮細(xì)胞 TIM4的表達(dá)程度明顯增強(qiáng)；但小氣道上皮細(xì)胞 TIM4的表達(dá)與對照組差別并不明顯（圖2）。

圖2 小鼠哮喘模型肺組織 TIM4的表達(dá)分布。a.對照組大氣道；b.哮喘組大氣道；c.對照組中氣道；d.哮喘組中氣道；e.對照組小氣道；f.哮喘組小氣道；箭頭指示為氣道上皮Fig.2 Expression and distribution of TIM4 in asthmatic mice model.a.Large airway of control group；b.Large airway of asthmatic group；c.Medium airway of control group；d.Medium airway of asthmatic group；e.Small airway of control group；f.Small airway of asthmatic group；The arrow indicates airway epithelium

討 論

TIM基因家族是2001年 McIntire發(fā)現(xiàn)的一個(gè)參與了對T細(xì)胞免疫功能調(diào)節(jié)的基因家族［3］，其所在區(qū)域5q31-33是哮喘的遺傳易感區(qū)。人類 TIM基因家族包含TIM1，TIM3，TIM4三個(gè)分子，主要調(diào)節(jié)Th0細(xì)胞向Th1／Th2細(xì)胞的分化發(fā)育，調(diào)節(jié)Thl／Th2免疫平衡的偏移，從而影響過敏性哮喘、器官移植免疫耐受等疾病的進(jìn)展。TIM1高表達(dá)于活化的 Th2細(xì)胞，TIM4是 TIM1的受體之一，TIM4與 TIM1結(jié)合后促進(jìn) Th2細(xì)胞的激活［4］。因此，TIM4表達(dá)水平的變化很可能影響Th1／Th2淋巴細(xì)胞的平衡。已有多文獻(xiàn)報(bào)道了 TIM4基因的遺傳變異與過敏性哮喘的發(fā)病存在關(guān)聯(lián)性［5-7］，且 TIM4表達(dá)增高可能是食物過敏，過敏性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病因素之一［8-9］。

本研究結(jié)果顯示，過敏性哮喘患者外周血單個(gè)核細(xì)胞 TIM4陽性率高于健康對照組，提示 TIM4表達(dá)的升高可能與哮喘的發(fā)病有關(guān)。研究表明，阻斷樹突狀細(xì)胞上 TIM4與 TIM1的相互作用，能抑制Th2細(xì)胞的活化，該功能已在過敏性腸炎、腎缺血再灌注損傷中得到證實(shí)［10-11］。TIM4表達(dá)的升高可激活更多的 TIM1分子，導(dǎo)致 T細(xì)胞平衡向 Th2細(xì)胞偏移，引發(fā)Th2細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。此外，過敏性哮喘患者嗜酸性粒細(xì)胞百分比也高于健康對照，該結(jié)果與馬萍等的報(bào)道一致［12］，但淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞百分比在兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。嗜酸性粒細(xì)胞主要抑制嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞合成與釋放活性物質(zhì)，吞噬其釋出顆粒，并分泌組胺酶破壞組胺，從而限制過敏反應(yīng)，因此嗜酸性粒細(xì)胞水平的增高與是機(jī)體應(yīng)對過敏性哮喘的自我保護(hù)機(jī)制。在哮喘患者中，TIM4表達(dá)水平與嗜酸性粒細(xì)胞百分比并無相關(guān)性，可能與它們在過敏性哮喘發(fā)病機(jī)中不同的作用有關(guān)，提示多種因素參與了對嗜酸性粒細(xì)胞水平的調(diào)控。

病毒感染、吸入冷空氣、運(yùn)動(dòng)等是哮喘常見的誘發(fā)因素，它們可上調(diào)氣道炎癥的主要細(xì)胞—?dú)獾郎掀ぜ?xì)胞的反應(yīng)性。上皮細(xì)胞反應(yīng)性增高表現(xiàn)為通透性增加、炎癥因子的表達(dá)分泌增強(qiáng)等，從而引起黏液分泌增多、氣道阻塞及鄰近的支氣管平滑肌痙攣，最后導(dǎo)致哮喘的發(fā)作。此外，因免疫失衡導(dǎo)致哮喘相關(guān)的細(xì)胞因子如 IL-4、IL-5、IL-13、TNF-α等分泌增加，這些細(xì)胞因子可作用于局部上皮細(xì)胞及免疫細(xì)胞，介導(dǎo)炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，從而改變局部的免疫微環(huán)境參與哮喘長期慢性炎癥的形成。前期研究結(jié)果顯示TIM4可表達(dá)于人的氣道上皮細(xì)胞株16HBE。為了研究 TIM4在過敏性哮喘中的致病機(jī)理，我們建立了小鼠哮喘模型，并用免疫組化的方法對肺部TIM4的表達(dá)進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示 TIM4陽性分布區(qū)域包括氣道表層及結(jié)締組織，主要位于氣道表層，其中以氣道上皮細(xì)胞表面最為明顯，小鼠哮喘模型的大氣道及中氣道的 TIM4陽性率高于對照組。Backer等在小鼠實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)［13］，外來抗原進(jìn)入呼吸道后被樹突狀細(xì)胞轉(zhuǎn)移到縱隔淋巴結(jié)，在淋巴結(jié)髓質(zhì)區(qū)巨噬細(xì)胞大量表達(dá) TIM4。當(dāng) TIM4敲除后，淋巴結(jié)髓質(zhì)巨噬細(xì)胞對抗原特異 T細(xì)胞的吞噬減少，降低了呼吸系統(tǒng)的免疫耐受［14］。TIM4可表達(dá)于氣道及肺結(jié)締組織內(nèi)的抗原遞呈細(xì)胞，如樹突狀細(xì)胞，單核細(xì)胞表面等，TIM4表達(dá)的升高可增強(qiáng)這些細(xì)胞的抗原遞呈功能，促進(jìn)Th2細(xì)胞的激活，最終導(dǎo)致過敏性哮喘的發(fā)生。TIM4除了可以與 TIM1結(jié)合，還能與磷脂酰絲氨酸結(jié)合促進(jìn)細(xì)胞對凋亡體的吞噬。位于氣道表層的上皮細(xì)胞 TIM4的高表達(dá)可增強(qiáng)上皮細(xì)胞對凋亡體的吞噬，從而參與局部免疫微環(huán)境及免疫炎癥的調(diào)控。

綜合本研究結(jié)果，在哮喘患者及小鼠哮喘模型中，均觀察到TIM4的表達(dá)上調(diào)，位于肺部的樹突狀細(xì)胞，巨噬細(xì)胞胞膜表面TIM4可與 TIM1結(jié)合促進(jìn)Th2細(xì)胞的活化，導(dǎo)致 T細(xì)胞平衡向 Th2細(xì)胞偏移，最終導(dǎo)致過敏性哮喘的發(fā)生。而血液中及氣道表層的 TIM4的表達(dá)上調(diào)，則可能通過介導(dǎo)單核細(xì)胞，上皮細(xì)胞等對磷脂酰絲氨酸的吞噬來調(diào)控免疫炎癥，影響相關(guān)細(xì)胞的功能的發(fā)揮，如粘液分泌，氣道反應(yīng)增強(qiáng)等來參與哮喘的發(fā)病。因此，TIM4在過敏性哮喘的發(fā)生發(fā)展中可能起著重要作用，但鑒于 TIM4生物學(xué)功能的多樣性及免疫微環(huán)境的復(fù)雜性，TIM4在哮喘免疫發(fā)病機(jī)制中的具體作用有待進(jìn)一步深入研究。

［1］Meyers JH，Chakravarti S，Sehlesinger D，et a1.TIM-4 is the ligand for TIM-1and the TIM-1-TIM-4 interaction regulates Tcell proliferation.Nat Immunol，2005，6（5）：455-464

［2］Feng BS，Chen X，He SH，et al.Disruption of T-cell immunoglobulin and mucin domain molecule（TIM）-1／TIM4 interaction as a therapeutic strategy in a dendritic cell-induced pea-nut allergy model.J Allergy Clin Immunol，2008，122（1）：55-61

［3］McIntire JJ，Umet su SE，Akbari O，et al.Identification of Tapr（an airway hyperreactivity regulatory locus）and the linked Tim gene family.Nat Immunol，2001，2（12）：1109-1116

［4］Zhao CQ，Li TL，He SH，et al.Specific immunotherapy suppresses Th2 responses via modulating TIM1／TIM4 interaction on dendritic cells.Allergy.2010，65（8）：986-995

［5］夏義平，崔天盆，吳健民.TIM4基因多態(tài)性與湖北漢族變應(yīng)性哮喘的相關(guān)性研究 .中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2007，24（2）：213-216

［6］Cai PC，Hu LH，Cui TP，et al.Association of TIM4 promoter polymorphism-1419G＞A with childhood asthma in a Chinese Han population.Tissue Antigens，2009，74（1）：11-16

［7］Cai P，Wu Q，Wang L，et al.Distribution characteristics and linkage disequilibrium of TIM4 promoter polymorphisms in asthma patients of Chinese Han population.J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2008，28（4）：447-450

［8］Albacker LA，Yu S，Bedoret D，et al.TIM4，expressed by POD酶的細(xì)胞化學(xué)定位.水生生物學(xué)報(bào)，2010，34（2）：402-409

［13］Stewart ER，Reese SA，Ultsch GR.The physiology of hibernation in Canadian leopard frogs（Rana pipiens）and bullfrogs（Rana catesbeiana）.Physiol Biochem Zool，2004，77（1）：65-73

［14］Steiner AA，Branco LG.Hypoxia-induced anapyrexia：implications and putative mediators.Annu Rev Physiol，2002，64：263-288

［15］Rutter J，Winge DR，Schiffman JD.Succinate dehydrogenase-Assembly，regulation and role in human disease.Mitochondrion，2010，10（4）：393-401

［16］張建萍，侯天德，賈凌云，等.溫度對虎斑頸槽蛇3種組織 SDH和 LDH活性的影響.四川動(dòng)物，2007，26（2）：287-290 medullarymacrophages，regulates respiratory tolerance by mediatingphagocytosis of antigen-specific T cells.Mucosal Immunol，2013，6（3）：580-559

［9］Qi X，Suo L，Zhao C，et al.Investigation on the role of TIM4 in the pathogenesis of allergic rhinitis in mice.Zhonghua Er Bi Yan Hou Tou Jing Wai Ke Za Zhi，2014，49（4）：283-287

［10］Qiu S，Du Y，Duan X，et al.B cell immunity in allergic nasal mucosa induces T helper 2 cell differentiation.J Clin Immunol，2012，32（4）：886-895

［11］Nishi C，Toda S，Segawa K，et al.Tim4-and MerTK-mediated engulfment of apoptotic cells by mouse resident peritoneal macrophages.Mol Cell Biol.2014，34（8）：1512-1520

［12］馬萍，于劍，王成艷，等.蠕蟲感染影響過敏性哮喘的免疫學(xué)機(jī)制.中國病原生物學(xué)雜志，2013，（05）：476-479

［13］Backer RA，Helbig C，Gentek R，et al.A central role for Notch in effector CD8（＋）T cell differentiation.Nat Immunol，2014，15（12）：1143-1151

［14］Li L，Mo L，Hao H，et al.Flagellin modulates TIM4 expression in mast cells.Cell Biol Int，2014，38（11）：1330-1336

High expression of T cell immunoglobulin domain and mucindomain 4 in monocytes of atopic asthma patients and lung tissue of asthmatic mouse model

Cai Pengcheng，Wei Yan，Hu Lihua*
（Clinical Laboratory Department of Union Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science＆Technology，Wuhan 430022，China）

Objective To investigate the expression of T cell immunoglobulin domain and mucindomain 4（TIM4）in atopic asthma and the relationship between TIM4 and atopic asthma.Methods The peripheral blood of 30 atopic astnma patients and 30 healthy controls were randomly selected.The expression level of human TIM4 was detected by flow cytometry.The percentages of eosinophils，monocytes and lymphocytes in peripheral blood were measured by Kurt count method.The TIM4 expression level in asthmatic model and control mice was analyzed by immunohistochemistry.Results The percentage of TIM4 positive cells in peripheral blood mononuclear cells of asthmatic patients was 2.51%，significantly higher than in the healthy group（0.68%）.The percentage of eosinophils was also higher in asthmatic patients（3.88%）than in the healthy group（1.23%）.However，there was no correlation between the expression level of TIM4 and the percentages of eosinophils，monocytes or lymphocytes.The TIM4 expression in bronchial airway cells of asthmatic mice was higher than that in control mice.Conclusion The expression of TIM4 is increased in atopic asthma，which indicates that TIM4 may play a role in the immune imbalance mechanism of atopic asthma.

TIM4；Atopic asthma；Eosinophile；Lymphocyte

R562.25

A

10.16705／j.cnki.1004-1850.2015.05.014

2015-06-01

2015-09-11

國家自然科學(xué)基金資助（81200020）

蔡鵬程，男（1982年），漢族，博士研究生

*通訊作者（To whom correspondence should be addressed）：xhhulh＠126.com