饑餓與冬眠期牛蛙肝臟糖原含量及主要酶的活性變化

張繼太 祝 雪 汪 煥 吳媛媛 彭 飛 張盛周

（安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物環(huán)境與生態(tài)安全省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蕪湖 241000）

饑餓與冬眠期牛蛙肝臟糖原含量及主要酶的活性變化

張繼太 祝 雪 汪 煥 吳媛媛 彭 飛 張盛周*

（安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物環(huán)境與生態(tài)安全省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蕪湖 241000）

目的 研究饑餓與冬眠期牛蛙肝臟糖原含量和非特異性酯酶（NSE）、堿性磷酸酶（ALP）、過(guò)氧化物酶（POX）、琥珀酸脫氫酶（SDH）的活性變化。方法 應(yīng)用冰凍切片、PAS染色法、酶組織化學(xué)技術(shù)及光密度定量分析。結(jié)果 饑餓期肝糖原含量顯著降低，冬眠期肝糖原含量與活動(dòng)期無(wú)顯著差異；NSE活性在活動(dòng)期最高，饑餓期顯著降低，冬眠期活性最低；ALP和 POX活性在饑餓期均顯著降低，冬眠期與活動(dòng)期無(wú)顯著差異；SDH活性在饑餓期和冬眠期均顯著降低，活動(dòng)期活性顯著較高。結(jié)論 饑餓和冬眠期牛蛙肝糖原含量變化不一致，其他酶類活性變化相一致，不同時(shí)期肝糖原含量和酶活性的變化與牛蛙生理狀態(tài)有著較好的適應(yīng)性。

牛蛙；肝臟；饑餓；冬眠；組織化學(xué)

肝臟不僅為動(dòng)物體內(nèi)最大的消化腺，還是重要的代謝器官，其可通過(guò)合成與分解肝糖原調(diào)節(jié)血糖濃度，通過(guò)多種酶的作用參與物質(zhì)的合成與轉(zhuǎn)化及解毒等多種代謝活動(dòng)［1-3］。研究表明，不同生理狀態(tài)下動(dòng)物肝臟的超微結(jié)構(gòu)、肝糖原含量和各種酶的活性會(huì)發(fā)生明顯變化以維持機(jī)體的能量平衡和代謝穩(wěn)定［3-7］。

牛蛙（Rana catesbiana）隸屬兩犧綱無(wú)尾目蛙科，體大肉肥，為常見(jiàn)的食用蛙類，因其繁殖快、適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)迅速，抗逆性強(qiáng)且其養(yǎng)殖飼料易取等優(yōu)點(diǎn)，牛蛙的人工養(yǎng)殖在我國(guó)得到了大規(guī)模推廣［8］。牛蛙飽食后可耐饑餓，冬季氣溫下降后進(jìn)入冬眠。目前，有關(guān)饑餓與冬眠期牛蛙肝臟糖原含量和酶活性變化方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，本文采用PAS糖原染色法和酶組織化學(xué)技術(shù)對(duì)饑餓與冬眠期牛蛙肝臟糖原含量及非特異性酯酶（NSE）、堿性磷酸酶（ALP）、過(guò)氧化物酶（POX）、琥珀酸脫氫酶（SDH）等4種酶的活性變化進(jìn)行了研究，旨在增進(jìn)對(duì)不同生理狀態(tài)下牛蛙肝臟生理機(jī)能的認(rèn)識(shí)，為牛蛙的人工養(yǎng)殖提供基礎(chǔ)資料。

材料和方法

1.實(shí)驗(yàn)材料

成體牛蛙購(gòu)自蕪湖黃山西路菜市場(chǎng)。9月份取活動(dòng)期飽食牛蛙 12只，隨機(jī)選取 6只穿刺毀髓，迅速解剖，取出肝臟置于 －70℃?zhèn)溆茫?只放入長(zhǎng)寬高分別為 100、50和50 cm玻璃飼養(yǎng)箱中，用紗布覆蓋容器上口，饑餓10 d，穿刺毀髓，解剖，取出肝臟置于 －70℃?zhèn)溆谩?2月份取源自與活動(dòng)期同一養(yǎng)殖場(chǎng)冬眠期成體牛蛙6只，實(shí)驗(yàn)室繼續(xù)冬眠 15 d，穿刺毀髓，解剖，取出肝臟。將肝臟切成約0.5 cm×0.5 cm ×0.5 cm的小塊，放在組織支撐器上，滴加冷凍包埋劑后放入冰凍切片機(jī)中低溫固化后切片，切片厚5 μm。

2.組織化學(xué)方法

肝糖原檢測(cè)采用 PAS染色法，參考張繼太等［9］的方法進(jìn)行；酶組織化學(xué)染色參考韋金鑫等［8］的方法進(jìn)行，略有改動(dòng)。

2.1 PAS染色法

冰凍切片入0.5%高碘酸氧化約7 min，流水沖洗5 min后再用蒸餾水浸洗2－3次；冰箱取出無(wú)色品紅待至室溫后避光染色15－20 min；用0.5%的偏重亞硫酸鈉漂洗兩次，每次約1 min，蒸餾水洗后蘇木精復(fù)染1 min，流水沖洗，蒸餾水浸洗。

2.2 非特異性酯酶（NSE）

NSE作用液成分為 10mg α-醋酸鈉酯、0.4ml丙酮、40 μl 0.1mol／L PBS（pH 7.4）、2.4 ml六偶氮化副品紅，混合后用 2mol／L NaOH溶液調(diào) pH至5.8，此溶液在 30min內(nèi)使用。將作用液滴加在組織冰凍切片材料上，室溫下反應(yīng) 10min，蒸餾水浸洗。

2.3 堿性磷酸酶（ALP）

ALP作用液成分為 0.1mol／L堿性磷酸酶緩沖液1.5ml、5%硝基藍(lán)四唑（NBT）溶液15 μl和5% 5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽（BCIP）溶液7.5 μl，混勻后需在30 min內(nèi)使用。將作用液滴加在冰凍切片材料上顯色20min，蒸餾水浸洗。

2.4 過(guò)氧化物酶（POX）

POX作用液成分0.06mol／L 3，3-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）溶液 50μl、3.6%H2O210μl、0.1mol／L Tris-HCl（pH 7.6）緩沖液1.0ml。將混合后的作用液滴加在冰凍切片上，于37℃恒溫箱中反應(yīng)20 min，蒸餾水浸洗。

2.5 琥珀酸脫氫酶（SDH）

SDH作用液成分為5%硝基藍(lán)四唑（NBT）溶液15 μl、0.1mol／L PBS（pH 7.4）1.5ml、30mg琥珀酸鈉鹽，將混勻后的作用液滴加在冰凍切片上，室溫顯色45min，蒸餾水浸洗。

3.光密度測(cè)定與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

在Olympus BX61型顯微鏡下觀察并拍照，采用Image-Pro Plus圖像分析軟件對(duì)染色陽(yáng)性部位進(jìn)行光密度分析，測(cè)出切片中陽(yáng)性部位的累積光密度（integrated optical density，IOD）和面積，算出平均光密度（mean optical density，MOD）。采用單因素方差分析（one-way ANOVA）進(jìn)行差異顯著性比較，P＜0.05為差異顯著。

結(jié) 果

光鏡下，牛蛙肝糖原及4種酶在肝組織中均呈現(xiàn)明顯的組織化學(xué)顏色反應(yīng)，經(jīng)光密度定量分析后，不同時(shí)期牛蛙肝臟糖原含量及非特異性酯酶（NSE）、堿性磷酸酶（ALP）、過(guò)氧化物酶（POX）、琥珀酸脫氫酶（SDH）的活性變化見(jiàn)表1。

表1 不同時(shí)期牛蛙肝臟糖原含量及4種酶的活性變化Table 1 The changes of the glycogen content and activities of four kinds of enzymes in the liver of bullfrog during different periods

1.肝糖原

染色后肝糖原呈紅色或紫紅色（圖1－圖3），主要位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，成顆粒狀分布?；顒?dòng)期糖原含量顯著較高（P＜0.05），顆粒較大且分布較均勻，冬眠期肝糖原含量與活動(dòng)期差異不顯著（P＞0.05），饑餓期肝糖原含量顯著降低（P＜0.05），顆粒較小且分布不均勻。

2.非特異性酯酶（NSE）

NSE活性部位呈棕褐色（圖4－圖6），主要位于肝臟細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，活動(dòng)期酶活性最高（P＜0.05），陽(yáng)性部位呈較大顆粒狀且在肝組織中均勻分布，饑餓期酶活性顯著降低（P＜0.05），冬眠期酶活性最低（P＜0.05），陽(yáng)性部位顆粒狀較小且分布不均勻。

3.堿性磷酸酶 （ALP）

ALP活性部位為藍(lán)紫色（圖7－圖9），主要位于細(xì)胞膜上，活動(dòng)期酶活性顯著較高，酶顆粒較大且較為密集，饑餓期酶活性顯著降低（P＜0.05），酶顆粒較小且較為疏散，冬眠期酶活性略有降低，但與活動(dòng)期無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

4.過(guò)氧化物酶 （POX）

POX活性部位呈棕黃色（圖10－圖12），主要位于肝細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)且呈較大顆粒狀分布，不同生理時(shí)期顆粒大小無(wú)明顯差別，但顏色深淺不同，饑餓期酶活性顯著降低，顏色較淺，冬眠期和活動(dòng)期酶活性顯著較高（P＜0.05），顏色較深，二者間酶活性無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

5.琥珀酸脫氫酶（SDH）

圖1 活動(dòng)期肝臟糖原；圖2 冬眠期肝臟糖原；圖3 饑餓期肝臟糖原；圖 4 活動(dòng)期非特異性酯酶；圖5 冬眠期非特異性酯酶；圖6 饑餓期非特異性酯酶；圖7 活動(dòng)期堿性磷酸酶；圖8 冬眠期堿性磷酸酶；圖9 饑餓期堿性磷酸酶；圖10 活動(dòng)期過(guò)氧化物酶；圖11 冬眠期過(guò)氧化物酶；圖12 饑餓期過(guò)氧化物酶；圖13 活動(dòng)期琥珀酸脫氫酶；圖 14 冬眠期琥珀酸脫氫酶；圖15 饑餓期琥珀酸脫氫酶；標(biāo)尺：50μmFig.1 liver glycogen during active period；Fig.2 liver glycogen during hibernation；Fig.3 liver glycogen during starvation；Fig.4 NSE during active period；Fig.5 NSE during hibernation；Fig.6 NSE during starvation；Fig.7 ALP during active period；Fig.8 ALP during hibernation；Fig.9 ALP during starvation；Fig.10 POX during active period；Fig.11 POX during hibernation；Fig.12 POX during starvation；Fig.13 SDH during active period；Fig.14 SDH during hibernation；Fig.15 SDH during starvation；Scale bar：50 μm

SDH活性部位呈藍(lán)紫色（圖13－圖15），主要位于肝細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)且呈顆粒狀分布，不同生理時(shí)期顆粒密集程度不同，活動(dòng)期 SDH活性顯著較高（P＜0.05），顆粒分布較為密集，顏色較深，饑餓期和冬眠期SDH活性顯著降低（P＜0.05），染色較淺，二者間酶活性無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

討 論

肝糖原是人和動(dòng)物體內(nèi)的貯備多糖，肝糖原在酶促作用下合成和分解以維持血糖濃度穩(wěn)定。本研究顯示，饑餓狀態(tài)下牛蛙肝糖原含量顯著降低，表明牛蛙饑餓時(shí)會(huì)分解肝糖原用于維持自身的生命活動(dòng)，與魚類、哺乳動(dòng)物等饑餓時(shí)肝糖原含量變化對(duì)于饑餓的適應(yīng)性相一致［6，7］；冬眠期牛蛙肝糖原含量與活動(dòng)期無(wú)顯著差異，表明冬眠前牛蛙會(huì)儲(chǔ)備較多肝糖原，這支持肝糖原是兩棲動(dòng)物冬眠期的主要儲(chǔ)能和抗凍保護(hù)物質(zhì)的觀點(diǎn)［2-5］，提示在牛蛙的養(yǎng)殖實(shí)踐中可根據(jù)肝糖原的含量來(lái)判斷牛蛙的營(yíng)養(yǎng)狀況從而合理飼喂以保證其安全越冬。

NSE是一種水解酶，主要參與酯類物質(zhì)的水解［10］。本研究顯示，活動(dòng)期牛蛙肝臟NSE活性最高，饑餓期NSE活性顯著降低，這可能是對(duì)饑餓期肝細(xì)胞內(nèi)酯類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少的適應(yīng)。冬眠期NSE活性最低，表明冬眠期牛蛙肝細(xì)胞對(duì)酯類利用較少，可能與肝細(xì)胞中儲(chǔ)存有大量肝糖原，機(jī)體主要通過(guò)分解肝糖原獲取能源物質(zhì)有關(guān)，這也進(jìn)一步表明蛙類冬眠期主要通過(guò)消耗肝糖原來(lái)維持機(jī)體代謝活動(dòng)。

ALP為磷酸酶的一種，結(jié)合于細(xì)胞膜上，主要參與脂類、葡萄糖、鈣和無(wú)機(jī)磷酸鹽等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收［11］。本研究顯示，活動(dòng)期牛蛙肝臟 ALP活性顯著高于其他時(shí)期，饑餓期牛蛙肝臟ALP活性最低，這一結(jié)果與泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）在饑餓狀態(tài)下肝臟ALP活性的變化相一致［6］，表明饑餓狀態(tài)下牛蛙肝細(xì)胞的物質(zhì)代謝活動(dòng)明顯變?nèi)?。冬眠?ALP活性仍較高，與活動(dòng)期無(wú)顯著差異，表明冬眠期牛蛙肝細(xì)胞仍具有較強(qiáng)的吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力。

POX存在于細(xì)胞的過(guò)氧化物酶體中，可以降低或消除細(xì)胞代謝過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)氧化氫、酚類和胺類等毒性物質(zhì)，對(duì)機(jī)體起著保護(hù)作用［12］。本研究顯示，活動(dòng)期牛蛙肝臟POX活性顯著較高，活動(dòng)期牛蛙肝細(xì)胞代謝較為旺盛，會(huì)產(chǎn)生較多代謝毒物，較高的 POX活性可清除機(jī)體代謝產(chǎn)生的有毒物質(zhì)，更好地起到保護(hù)作用。饑餓期POX活性最低，這與饑餓狀態(tài)下牛蛙肝臟代謝活動(dòng)較弱，產(chǎn)生的代謝有毒物質(zhì)較少相適應(yīng)。冬眠期牛蛙肝臟POX活性保持較高水平，與活動(dòng)期無(wú)顯著差異。有研究表明，蛙類冬眠期處于缺氧狀態(tài)，會(huì)產(chǎn)生較多自由基物質(zhì)［13，14］，可見(jiàn)，冬眠期肝臟 POX活性保持較高水平有利于保護(hù)機(jī)體免受由缺氧引起的自由基損傷。

SDH是線粒體三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶，SDH的活性常作為判定三羧酸循環(huán)運(yùn)行強(qiáng)弱的指標(biāo)［15］，本研究顯示，饑餓期與冬眠期牛蛙肝臟SDH活性均顯著降低，這與小白鼠肝臟 SDH活性變化對(duì)饑餓與寒冷的適應(yīng)性基本一致［7］?；顒?dòng)期SDH活性較高，表明正常生理?xiàng)l件下肝細(xì)胞需要通過(guò)三羧酸循環(huán)產(chǎn)生足夠多的 ATP以維持機(jī)體正常的代謝活動(dòng)，而饑餓期體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少，SDH的活性降低可減少能量消耗；冬眠期動(dòng)物的基礎(chǔ)代謝率降低，SDH活性降低可使三羧酸循環(huán)運(yùn)行減慢以適應(yīng)冬眠期較低的能量消耗。張建萍等［16］對(duì)虎斑頸槽蛇（Rhabdophis tigrinus lateralis）肝臟 SDH活性受溫度影響的研究顯示，5～15℃范圍內(nèi) SDH表現(xiàn)出較低活性，可見(jiàn)，冬季氣溫過(guò)低也是造成冬眠期肝臟SDH活性降低的原因。

總之，饑餓和冬眠期牛蛙肝糖原含量及各種酶活性的變化與肝臟生理功能及個(gè)體生命活動(dòng)狀態(tài)是相適應(yīng)的。冬眠期肝糖原含量及4種酶活性的變化與饑餓期有相似之處，亦存在明顯差異，反映出冬眠與饑餓后的生理變化既有相似性又存在差異。

［1］梁擴(kuò)寰，李紹白.肝臟病學(xué).北京：人民衛(wèi)生出版社，2006

［2］Jenkins JL，Swanson DL.Liver glycogen，glucose mobilization and freezing survival in chorus frogs Pseudacris triseriata.J. Therm Biol，2005，30：485-494

［3］馮照軍，季麗萍，施雯，等.中華蟾蜍糖原含量的季節(jié)變化.動(dòng)物學(xué)報(bào)，2007，53（6）：1048-1053

［4］米志平，蘇學(xué)輝，代慶陽(yáng).中華大蟾蜍冬眠前與出眠初期肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察.四川師范學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2000，21（1）：98-101

［5］Steiner AA，Petenusci SO，Brentegani LG，et al.The importance of glucose for the freezing tolerance／intolerance of the anuran amphibians Rana catesbeiana and Buffo paracnemis. Rev Bras Biol，2000，60：321-328

［6］杜啟艷，王萍，王友利，等.長(zhǎng)期饑餓和再投喂對(duì)泥鰍不同組織糖原、酸性磷酸酶和堿性磷酸酶的影響.江西師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2008，32（4）：488-493

［7］許曉利，張艷，熊希凱.驟冷與饑餓對(duì)小鼠肝臟影響的實(shí)驗(yàn)研究.中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，1997，6（3）：284-288

［8］韋金鑫，郭慧，宋華，等.牛蛙消化道黏膜5種酶的分布.中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2011，20（4）：316-319

［9］張繼太，祝雪，張盛周.兩種切片方法檢測(cè)肝糖原染色效果的比較.中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2014，23（6）：548-550

［10］Krugmann J，Neuenfeld M，Krautschick I.Peroxide treatment changes activity of non-specific esterase in vascular endothelium of isolated pig aorta in vitro.Experimental and Toxicologic Pathology，1997，49（5）：355-359

［11］Lallès JP.Intestinal alkaline phosphatase：multiple biological roles in maintenance of intestinal homeostasis and modulation by diet.Nutr Rev，2010，68（6）：323-332

［12］許燕，楊潔，孫靜秋，等.凡納濱對(duì)蝦不同組織內(nèi) SOD、

Changes in glycogen content and activities of some key enzymes in the liver of Rana catesbiana during starvation and hibernation

Zhang Jitai，Zhu Xue，Wang Huan，Wu Yuanyuan，Peng Fei，Zhang Shengzhou*
（Key Laboratory of Biotic Environment and Ecological Safety in Anhui Province，College of Life Sciences，Anhui Normal University，Wuhu 241000，China）

Objective To investigate changes in the glycogen content and the activities of non-specific esterase（NSE），alkaline phosphatase（ALP），peroxidase（POX）and succinate dehydrogenase（SDH）in the liver of Rana catesbiana during starvation and hibernation.Methods Frozen sectioning，PAS staining，enzyme-histochemical technique and optical density analysis were used.Results The glycogen content wass significantly decreased during starvation，while there was no significant difference between hibernation and the active period.The activity of NSE was highest during the active period，lower during starvation，and lowest during hibernation.The activities of ALP and POX were significantly decreased during starvation，while there was no significant difference between hibernation and the active period.The activity of SDH was significantly decreased during starvation and hibernation，but higher during the active period.Conclusion The change of hepatic glycogen content is inconsistent during starvation and hibernation，while the changes of other enzymatic activities are consistent.The changes of glycogen content and enzymatic activities in the liver of Rana catesbiana during starvation and hibernation are rational adaptive responses to the changes of the physiological status.

Rana catesbiana；Liver；Starvation；Hibernation；Histochemistry

Q959

A

10.16705／j.cnki.1004-1850.2015.05.016

2015-06-29

2015-09-16

安徽省自然科學(xué)基金（11040606M75）；國(guó)家級(jí)大學(xué)生校外實(shí)踐教育基地大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目；本科生優(yōu)秀畢業(yè)論文培育計(jì)劃項(xiàng)目（pyjh2013206）；生物環(huán)境與生態(tài)安全省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)基金

張繼太，男（1991年），漢族，本科生

*通訊作者（To whom correspondence should be addressed）：

szzhang＠m(xù)ail.ahnu.edu.cn