藏雞THRSP基因的克隆及生物信息學分析

聶曉慶，徐亞歐，呂 明，左璐璐，李 想，林亞秋

(西南民族大學生命科學與技術(shù)學院，四川 成都 610041)

藏雞THRSP基因的克隆及生物信息學分析

聶曉慶，徐亞歐，呂 明，左璐璐，李 想，林亞秋

(西南民族大學生命科學與技術(shù)學院，四川 成都 610041)

對藏雞THRSP基因進行克隆、序列測定及生物信息學分析.結(jié)果表明:獲得的藏雞THRSP基因核苷酸序列為428 bp(GenBank登陸號:KT153607)，在50-258 bp處存在1個CpG島，ORF長度為390 bp，編碼129個氨基酸，其中Leu所占比例為10.9%.THRSP蛋白分子量為14.18 ku，等電點(pI)為4.61，屬于不穩(wěn)定酸性核蛋白，存在8個磷酸化位點和5個O糖基化位點.預(yù)測其二級結(jié)構(gòu)中α螺旋占51.2%，β折疊占3.1%，無規(guī)則卷曲占45.7%.同源性分析結(jié)果表明:藏雞與原雞THRSP基因核苷酸及預(yù)測的氨基酸序列同源性為100%，兩者親緣關(guān)系最近.

藏雞；THRSP；基因克??；生物信息學分析

甲狀腺激素應(yīng)答點14(Thyroid hormone responsive spot 14，THRSP)是參與控制脂肪合成代謝的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，該基因主要通過啟動子區(qū)的3個甲狀腺素應(yīng)答元件來對甲狀腺激素產(chǎn)生快速應(yīng)答反應(yīng)[1]. THRSP基因編碼的蛋白是一種小的酸性細胞核內(nèi)蛋白質(zhì)，又叫Spot 14[2]，在脂類代謝中起重要的調(diào)控作用[3].Spot14是1981年Seelig等[4]從小鼠肝臟中提取的mRNA中發(fā)現(xiàn)的，隨后Cogburn等[5]利用微陣列芯片技術(shù)在雞肝臟中分離并得到確定，被定位于雞1號染色體長臂41-44處(GGAlq41-44)[6]，隨后Wang等[7]進一步發(fā)現(xiàn)并電子克隆了2個THRSP同源cDNA序列.Wang等[8]研究發(fā)現(xiàn)THRSP mRNA主要在肝臟中存在高表達.閆文龍等[9]檢測杏花雞與隱性白洛克雞F2代12個家系共439只個體基因型及其與脂肪性狀的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，THRSPα基因與脂肪帶寬和腹脂重呈顯著相關(guān)(P＜0.05)，說明該基因與腹脂性狀密切相關(guān)[7].因此該基因可作為一個研究脂肪性狀的候選基因用于優(yōu)質(zhì)肉雞的輔助育種中.藏雞屬于肉蛋兼用型優(yōu)質(zhì)獨特地方雞種，具有肉質(zhì)鮮美、體型輕小、胸腿肌肉發(fā)達、活潑好動、耐粗放等特征[10-11].由于近年來外種雞及雜雞的引進，藏雞作為國家級畜禽品種遺傳資源保護品種有瀕臨滅絕的危險.因此，本研究對藏雞THRSP基因序列進行克隆與生物信息學分析，為藏雞地方良種保護和培育提供重要的基礎(chǔ)資料.

1 材料與方法

1.1 樣品采集

實驗所用藏雞(1只公雞)來自四川成都益生康健農(nóng)業(yè)有限公司，屠宰后立即取藏雞的肝臟組織，置于液氮中，帶回實驗室放于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?

1.2 主要試劑

Trizol(Invitrogen)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Scientific)；Taq酶及DH5α感受態(tài)細胞(天根生化科技有限公司)；凝膠回收試劑盒(Axygen)；pMD19-T載體(Takara)；其他均為國產(chǎn)分析純.

1.3 藏雞THRSP基因克隆

1.3.1 引物的設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank中登陸的原雞THRSP基因序列(NM_213577)，用Premier5.0設(shè)計克隆引物，上游引物:5′-GAGGAGAGGCAAGGAGTGG-3′，下游引物: 5′-TCTCCGTGTGCAGGCTCA-3′，送上海生物工程股份有限公司合成.

1.3.2 藏雞肝臟總RNA提取

用Trizol法提取肝臟組織總RNA，溶解于30 μ LRNAase-free水中，用分光光度計檢測總RNA的濃度且達到后續(xù)實驗的要求.用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA.

1.3.3 PCR擴增

PCR擴增體系共25 μL:ddH2O 9.5 μL，cDNA1 μ L，Taq聚合酶12.5 μL，上下游引物各1 μL.PCR反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性(5 min)；94℃變性(30 s)，58℃退火(30 s)，72℃延伸(45 s)，共35個循環(huán)，72℃延伸(5 min).取5 μLPCR產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠進行檢測，將目的條帶用膠回收試劑盒進行純化、回收.

1.3.4 克隆與測序

取純化回收的PCR產(chǎn)物4.5 μL與pMD-19T載體0.5 μL在5 μL Solution連接液中16℃連接45 min，構(gòu)建pMD19T-THRSP克隆載體，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞中，菌落PCR鑒定，挑選5個陽性克隆，送上海生物工程股份有限公司雙向測序.

1.4 藏雞THRSP基因生物信息學分析

1.4.1 序列分析

通過NCBI網(wǎng)站中的ORF Finder尋找開放閱讀框(open reading frame，ORF).將獲得的cDNA序列和氨基酸序列在NCBI上進行Blast同源比對，采用MEGA5.0和clustalx1.83構(gòu)建系統(tǒng)進化樹.

1.4.2 Spot 14分析

通過ProtParam在線分析Spot14的理化性質(zhì)；采用NetPhos 2.0、NetOGlyc 4.0、NetNGlyc 1.0、NetPhosK 1.0、SignalP 4.1Server分別分析預(yù)測Spot14磷酸化位點、O糖基化位點、N糖基化位點、保守特異性蛋白激酶作用位點及信號肽；采用PHYRE2 Serve、Predict-Protein、SMART程序分析預(yù)測Spot14三級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)域.最后進行CpG島預(yù)測(http:// www.ebi.ac.uk/Tools/seqstats/emboss_cpgplot/).

2 結(jié)果與分析

2.1 生物信息學分析

克隆的藏雞THRSP基因序列片段長度為428 bp，包含390 bp的完整開放閱讀框，編碼129個氨基酸(圖1)，氨基酸組成如圖2.其中氨基酸殘基Leu所占頻率最高(10.9%)，且負電荷的氨基殘基數(shù)(Asp +Glu＝19)多于帶正電荷的氨基酸殘數(shù)(Arg+Lys＝10).Spot14蛋白無N端信號肽，說明該蛋白不屬于分泌型蛋白.進一步分析其堿基序列組成:A＝23.6%，C＝32.8%，G＝29.2%，T＝14.4%；G+C＝62%，高于(A+T)38%，說明THRSP基因CDS區(qū)DNA雙鏈較穩(wěn)定.編碼蛋白的理化性質(zhì):蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為14.18ku，等電點為4.61，說明該蛋白為酸性蛋白質(zhì)；消光系數(shù)(M-1cm-1γ＝280 nm)為7450，不穩(wěn)定系數(shù)為53.04，說明該蛋白屬于不穩(wěn)定性蛋白；Spot14磷酸化位點分別在第4、8、41、60、65、68、89、114位(圖3)；O糖基化位點分別在第60、62、65、67、68位(圖4)；保守特異性蛋白激酶作用位點最強在110殘基處(P＝0.89).Spot14二級結(jié)構(gòu)中α螺旋占51.2%，β折疊占3.1%，無規(guī)則卷曲占45.7%.由圖5可知Spot14還有1個209bp長度的CpG島.

圖1 藏雞THRSP基因核苷酸及預(yù)測的氨基酸序列Fig.1 Sequences of THRSP nucleotide and predicted amino acid of Tibetan chicken

圖2 藏雞Spot14蛋白氨基酸組成Fig.2 The amino acid composition of Spot14 protein of Tibetan chicken

圖3 藏雞Spot14蛋白預(yù)測磷酸化位點Fig.3 Predicted phosphorylation sites of Spot14 protein of Tibetan chicken

圖4 藏雞Spot14蛋白預(yù)測O糖基化位點Fig.4 Predicted O-glycosylation sites of Spot14 protein of Tibetan chicken

圖5 藏雞Spot14蛋白CpG島預(yù)測Fig.6 Predicted CpG Island of Spot14 protein of Tibetan chicken

由圖5可知，50～258bp共有209 bp，(C+G)%＞50%，CpG的觀察值/預(yù)測值比例高于0.6，說明該核苷酸序列中存在1個CpG島.

2.2 同源性分析

將克隆得到的藏雞THRSP基因序列、氨基酸序列與原雞等物種進行同源性分析(表1)，并以核苷酸的同源性構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖6).由圖7可知，在THRSP基因進化的過程中，藏雞、原雞、鴨、白頭海雕、褐雨燕、烏鴉處于同一進化枝，其中藏雞和原雞親緣關(guān)系最近，其核苷酸、氨基酸同源性100%.日本冠鹮與企鵝處于同一進化枝，原鴿單獨處于一枝.

表1 藏雞THRSP基因與其他已知物種的核苷酸、氨基酸序列比對結(jié)果Table 1 Comparison of nucleotide and amino acid sequences between Tibetan chicken THRSP gene and other known species

圖6 藏雞THRSP基因系統(tǒng)進化樹Fig.6 The phylogenetic tree of THRSP of Tibetan chicken

3 討論

本研究利用RT-PCR方法成功克隆藏雞THRSP基因，獲得完整的CDS區(qū)390 bp，共編碼129個氨基酸，其中氨基酸殘基Leu所占頻率最高(10.9%).在DNAMAN上將藏雞與原雞的THRSP基因CDS區(qū)進行比對發(fā)現(xiàn)，從第240 bp到249 bp間藏雞缺失GATGGCATA 9 bp連續(xù)的堿基，編碼氨基酸為GID，其余位置沒有發(fā)現(xiàn)堿基的突變.閆文龍[12]發(fā)現(xiàn)在雞THRSPα基因編碼區(qū)267 bp處存在9 bp的插入/缺失突變，其多態(tài)性在不同品種中的分布各不相同.根據(jù)核苷酸及氨基酸序列同源性比較結(jié)果可以看出，藏雞與原雞同源性為100%.從系統(tǒng)進化樹也可發(fā)現(xiàn)，藏雞和原雞親緣關(guān)系最近，其次是鴨，最后是原鴿.而王叢梅等[13]克隆豬的THRSP基因核苷酸(GenBank登陸號:JF_951726)與雞的同源性比較發(fā)現(xiàn)，雞共有54個堿基的缺失導(dǎo)致移碼突變，使兩者同源性最遠.說明，藏雞缺失的堿基沒有產(chǎn)生移碼突變，但可能會影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，其內(nèi)部9bp的缺失突變是否可以作為與脂肪性狀連鎖的標記用于優(yōu)質(zhì)雞的選擇育中值得深入研究.

藏雞的Spot14蛋白預(yù)測磷酸化位點發(fā)現(xiàn)共存在8個磷酸化位點:分別在第60、65、68、89、114位氨基酸序列共5個絲氨酸(Ser)磷酸化位點，第8位1個蘇氨酸(Thr)磷酸化位點，第4和41位共2個酪氨酸(Tyr)磷酸化位點.Spot14蛋白無N糖基化位點，但在第60、62、65、67、68位氨基酸序列存在5個O糖基化位點.翻譯后修飾是蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)功能的重要方式，它與信號傳導(dǎo)、細胞周期、生長發(fā)育等諸多生物學問題有密切關(guān)系[14].并且發(fā)現(xiàn)該基因CDS區(qū)含有一個CpG島.高等真核細胞通常對DNA分子上5’-CpCr -3’序列的胞嘧啶進行甲基化修飾，同時也是最重要的表觀遺傳學修飾之一.研究發(fā)現(xiàn)，CpG島甲基化水平與癌變密切相關(guān)[15].推測藏雞連續(xù)9 bp的缺失與CpG島有關(guān)，具體該位點CpG島的甲基化狀態(tài)及其與缺失堿基的關(guān)系、對蛋白功能的影響需要深入研究.

王叢梅等[13]檢測了豬THRSP基因在14個組織的表達情況，發(fā)現(xiàn)在肝臟、脂肪等組織中表達水平最高，在腦、脾臟、胃等組織中表達量相對較低，在腎臟、肌肉中不表達.Wang等[8]也發(fā)現(xiàn)，雞THRSP基因在肝臟中高表達.肝臟是脂肪代謝的重要的器官.說明，該基因及其編碼的蛋白spot14確實在肝臟等脂肪組織代謝中發(fā)揮著重要的作用，并能有效的調(diào)控脂肪合成酶系基因的表達且已被廣泛研究[16].Cao[17]等研究表明，雞THRSPα基因9 bp插入/缺失和A213C突變與體重相關(guān)，說明該基因與雞的生長具有重要的遺傳效應(yīng).趙春平等[18]利用Agilent基因芯片對牛背最長肌組織樣品進行差異表達基因分析發(fā)現(xiàn)，THRSP可能是影響牛肉質(zhì)性狀的重要基因.詹凱[19]經(jīng)選擇性Z檢驗表明，THRSP基因在雞基因組上的選擇作用的概率值P＝0.02＜0.05.說明THRSP基因是影響動物脂肪生成的重要候選基因且在雞育種中具有較強的選擇作用.下一步，可從基因表達與肌內(nèi)脂肪含量相關(guān)性進行分析，為優(yōu)質(zhì)雞的育種提供新思路.

4 結(jié)論

本研究成功克隆得到藏雞THRSP基因序列，并預(yù)測了編碼蛋白的結(jié)構(gòu)，為下一步進行組織表達情況及該基因生物學功能研究奠定了基礎(chǔ)，為最終闡明藏雞優(yōu)良肉質(zhì)形成的分子機制提供依據(jù).

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(責任編輯:李建忠，付強，張陽，羅敏；英文編輯:周序林，鄭玉才)

Cloning and bioinformatics analysis of THRSP in Tibetan chicken

NIE Xiao-qing，XU Ya-ou，LU Ming，ZUO Lu-lu，LI Xiang，LIN Ya-qiu

(School of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，P.R.C.)

Cloning，sequencing and bioinformatics analysis of THRSP gene of Tibetan chicken were carried out.The results showed that the cDNA length of THRSP gene was 428 bp(GenBank accession number:KT153607)with a CpG island located in 50-258 bp.The ORF of THRSP gene with a length of 390 bp encoded a protein of 129 amino acids in which Leu residue had a high proportion of 10.9%.The molecular weight was 14.18 ku，and its theoretical isoelectric point was 4.61.The protein belongs to unconventional and acidity nucleoproteins with 8 phosphorylation sites and 5 O-glycosylation sites.The predicted secondary structure of the protein was composed of α helix(51.2%)，β sheet(3.1%)and random coil(45.7%).The sequence homology analysis showed that the nucleotide sequence and the deduced amino acids sequence of Tibetan chicken shared 100% homology with Gallus gallus.They have a close genetic relationship.

Tibetan chicken；THRSP；gene cloning；sequence analysis

S813；S831

A

2095-4271(2015)04-0397-06

10.11920/xnmdzk.2015.04.001

2015-04-23

林亞秋(1976-)，女，漢族，內(nèi)蒙古人，副教授，博士，研究方向:動物遺傳育種，Email:linyq1999＠163.com.

四川應(yīng)用基礎(chǔ)項目(2013JY0044)；四川省畜禽育種攻關(guān)項目(2011NZ0099-6)；西南民族大學項目(2012NFW001)