PTP1B基因?qū)θ宋赴┘?xì)胞株的增殖和遷移能力的影響

汪進(jìn)國，吳 佩，武 健，茆家定

皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院胃腸外科，安徽 蕪湖 241000

PTP1B基因?qū)θ宋赴┘?xì)胞株的增殖和遷移能力的影響

汪進(jìn)國，吳 佩，武 健，茆家定

皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院胃腸外科，安徽 蕪湖 241000

背景與目的：胃癌是我國常見的消化道惡性腫瘤，術(shù)后易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。前期研究發(fā)現(xiàn)，蛋白酪氨酸磷酸酶1B(protein tyrosine phosphatase 1B，PTP1B)基因與胃癌腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)。本研究通過RNA干擾技術(shù)和基因克隆技術(shù)分別沉默和上調(diào)胃癌細(xì)胞中PTP1B基因的表達(dá)，觀察PTP1B基因?qū)ξ赴┘?xì)胞增殖和遷移能力的影響。方法：將靶向沉默PTP1B基因的短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)序列和克隆人的PTP1B cDNA基因序列分別轉(zhuǎn)染MKN28和MKN45細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)定量PCR(quantitative realtime PCR，qRT-PCR)、蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)分別檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中PTP1B基因和蛋白的表達(dá)水平，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)、Transwell遷移試驗(yàn)和劃痕試驗(yàn)分別觀察PTP1B基因?qū)?xì)胞增殖和遷移能力的影響。結(jié)果：轉(zhuǎn)染shRNA后，MKN28細(xì)胞中PTP1B mRNA和蛋白表達(dá)量與空白對照組、陰性對照組相比抑制顯著(P＜0.05)。CCK-8增殖活性實(shí)驗(yàn)顯示，shRNA沉默PTP1B基因表達(dá)后能顯著抑制胃癌MKN28細(xì)胞在48、72和96 h的增殖活性(P＜0.05)。Transwell遷移試驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，PTP1B表達(dá)下調(diào)后胃癌MKN28細(xì)胞的遷移能力受到顯著抑制(P＜0.05)。而提高PTP1B在MKN45細(xì)胞中表達(dá)后，細(xì)胞的增殖和遷移能力則顯著提高(P＜0.05)。結(jié)論：PTP1B基因是胃癌細(xì)胞增殖和遷移的重要調(diào)控因子。

胃癌；蛋白酪氨酸磷酸酶1B；短發(fā)夾RNA；細(xì)胞增殖；細(xì)胞遷移

胃癌是我國常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多階段、多因素參與的復(fù)雜過程。蛋白質(zhì)酪氨酸殘基的可逆性磷酸化是細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要環(huán)節(jié)，它調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、增殖、分化、代謝和遷移等。蛋白質(zhì)酪氨酸殘基的磷酸化受到蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinases，PTKs)和蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatases，PTPs)的調(diào)控。PTKs負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)酪氨酸殘基的磷酸化，而PTPs負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)酪氨酸殘基的去磷酸化。因此，兩者的平衡對維持蛋白質(zhì)酪氨酸殘基的磷酸化狀態(tài)起到非常重要的作用。蛋白酪氨酸磷酸酶1B(protein tyrosine phosphatase 1B，PTP1B)屬于PTPs家族一員，是體內(nèi)廣泛表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)PTPs。近年來研究發(fā)現(xiàn)，PTP1B可能起著類似癌基因的作用［1］。PTP1B mRNA和蛋白在胃癌細(xì)胞和組織中均過度表達(dá)，并且在胃癌組織中，PTP1B的表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有明顯的相關(guān)性［2］。本實(shí)驗(yàn)通過RNA干擾和基因轉(zhuǎn)染技術(shù)分別特異性下調(diào)和上調(diào)胃癌細(xì)胞中的PTP1B表達(dá)水平，觀察PTP1B表達(dá)對胃癌細(xì)胞增殖和遷移能力的影響。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

人胃癌MKN28和MKN45細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)液購自美國Gibco公司；真核表達(dá)載體pGPU6/ GFP/Neo購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；LipofectamineTM2000和G418購自美國Invitrogen公司；PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；PTP1B抗體購自美國Calbiochem公司；GAPDH單克隆抗體和HRP標(biāo)記的羊抗鼠的IgG單克隆二抗購自美國Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將人胃癌MKN28和MKN45細(xì)胞加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，以每孔1×105個(gè)細(xì)胞的密度分別接種于6孔培養(yǎng)板中，放入37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，選用處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)。取5×105個(gè)處于對數(shù)生長期的細(xì)胞鋪于6孔板的每個(gè)孔中，分別加入Opti-MEM溶液稀釋的pGPU6/GFP/Neo-shRNA、pGPU6/GFP/NeoshRNA NC、pcDNA3.1和pcDNA3.1-PTP1B，以LipofectamineTM2000為轉(zhuǎn)染介質(zhì)。轉(zhuǎn)染24 h后，用800 μmol/L的G418進(jìn)行篩選2周。挑選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆，將G418濃度改為400 μmol/L進(jìn)行維持。用實(shí)時(shí)定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)和蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染克隆的鑒定，并將轉(zhuǎn)染成功的穩(wěn)轉(zhuǎn)克隆進(jìn)一步培養(yǎng)和用于下一步試驗(yàn)。未做任何處理的細(xì)胞作為空白對照組。

1.2.2 qRT-PCR檢測

取1 μg總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明的方法行反轉(zhuǎn)錄。用Opticon qRT-PCR儀(MJ Research，美國)和SYBR Green染料混合物進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件為：94 ℃變性1 min，60 ℃退火45 s，72 ℃延長10 min，共28個(gè)循環(huán)，然后從65～95 ℃建立熔解曲線。用Opticon monitor software(Version 3.1，MJ Research，美國)讀取PCR結(jié)果。PTP1B為目的基因，順義鏈為：GAGTTCG AGCAGATCGACAAGTC；反義鏈為：TAGGAAGCTTGGCCACTCT ACAT。以GAPDH為內(nèi)參，順義鏈為：ACCACAGTCCATGCCATCAC；反義鏈為：TCCACCACCCTGTTGCTGTA。qRT-PCR結(jié)果以Ct值表示，△Ct為同一樣本中內(nèi)參與目的基因Ct值之差，樣本中目的基因的表達(dá)水平用2△Ct表示。

1.2.3 Western blot檢測

收集細(xì)胞，利用RIPA裂解液(購自美國Pierce公司)提取總蛋白，BCA法測定總蛋白濃度。每孔加入50 μg的蛋白樣品，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。加入一抗(PTP1B一抗的稀釋濃度為1 μg/mL)，4 ℃搖床上溫育過夜。TBST漂洗3次，每次10 min。加入TBS液稀釋的二抗(稀釋濃度為1∶2 000)，室溫下水平搖床上溫育2 h。TBST漂洗3次，每次10 min。配置ECL工作液，根據(jù)膜的大小，按每10 cm2的膜上加1 mL ECL工作液的比例，滴加ECL工作液到膜上，確保工作液均勻覆蓋在膜上，放置1～2 min。取膜，棄ECL工作液，用濾紙吸掉過多的液體。將膜放在兩片保鮮膜中間，隨后將膜放置到熒光成像儀內(nèi)，參照儀器說明書進(jìn)行檢測。

1.2.4 細(xì)胞增殖活性實(shí)驗(yàn)

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，0.25%胰酶消化后計(jì)數(shù)，96孔板中每孔鋪2×103個(gè)細(xì)胞及200 μL的含10%小牛血清的培養(yǎng)液，每組5個(gè)復(fù)孔，平推搖勻后置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于細(xì)胞加入96孔板后的0、24、48、72和96 h進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。細(xì)胞的數(shù)目是通過吸光度(D)值來表示。具體操作步驟為：在相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)，每孔中加入20 μL的細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8，購自日本Dojindo公司)并且平推搖勻，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，用酶標(biāo)儀檢測。在450 nm的波長下讀取相應(yīng)組的D值，取平均值繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.2.5 針對PTP1B基因序列的RNA干擾載體的構(gòu)建

根據(jù)PTP1B基因的mRNA序列，設(shè)計(jì)shRNA#1和shRNA#2兩對RNA干擾序列，具體序列分別為5’-CACCGCCTCATTCTTGAACTTTCT TTCAAGAGAAGAAGTTCAAGAATGA GTTTTTTG-3’和5’-CACCGAGGACCATG CACTGAGTTTCAAGAGAACTCAGT GCATGGTCCTCTTTTTTG-3’；此外，設(shè)計(jì)一段與人類基因組無同源性的RNA干擾序列短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)作為對照：5’-CACCGTTCTCCGAACGTGTC ACGTCAAGAGATTACGTGACACCGT TCGGAGAATTTTTTG-3’。將合成的序列插入表達(dá)載體pGPU6/GFP/Neo中的BamHⅠ和BbsⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)之間。測序確認(rèn)序列正確后，將純化的產(chǎn)物轉(zhuǎn)至DH5α感受態(tài)細(xì)菌，挑選陽性克隆，搖菌后抽提質(zhì)粒DNA，再行測序，保存測序正確克隆的菌液。每組取菌液100 μL加入到5 mL的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床上搖菌18 h(225×g)，然后用質(zhì)粒DNA的大抽提試劑盒抽提質(zhì)粒DNA。抽提后的DNA測定其濃度后保存在-20 ℃冰箱中待用。

1.2.6 PTP1B基因克隆和pcDNA3.1-hPTP1B載體構(gòu)建

引物設(shè)計(jì)：根據(jù)GenBank中人PTP1B cDNA序列(NM-002827)設(shè)計(jì)引物并且加入帶有限制性酶切位點(diǎn)的序列，上游為CTAAGGATCC AAGAAGCAGCAGCGGCTAGG；下游為CAG TGAATTCTGGAGGAGGGTCAGGCTATG。產(chǎn)物的長度為1 318 bp。取胃癌組織標(biāo)本(經(jīng)病理證實(shí))，按TRIzol試劑說明書提取總RNA，參照RT試劑盒說明書合成cDNA第一條鏈，然后以其為模板，加入PTP1B全長引物和高保真Taq DNA聚合酶進(jìn)行PCR。反應(yīng)條件為94 ℃變性1 min，68 ℃退火1.5 min，72 ℃延長10 min，共40個(gè)循環(huán)。

pcDNA3.1-hPTP1B載體構(gòu)建：將PTP1B目的片段及pcDNA3.1載體用BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切，瓊脂糖電泳切膠回收，定量后按載體和克隆片段1∶6的比例用T4DNA連接酶16 ℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，涂板保存，挑菌培養(yǎng)，用質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒進(jìn)行DNA測序。雙酶切重組質(zhì)粒，0.2%瓊脂糖電泳鑒定。

1.2.7 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，于實(shí)驗(yàn)開始前1 d換成無血清的培養(yǎng)液饑餓細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組和對照組的每孔下室中加入含10%小牛血清的培養(yǎng)液500 μL。在上室中加入用無血清的培養(yǎng)液稀釋至4×105個(gè)/mL的細(xì)胞500 μL，平推搖勻后放置

于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出小室，棄除培養(yǎng)液，用PBS洗3次，每次3 min。用干棉簽擦去小室內(nèi)殘留細(xì)胞。在4%多聚甲醛中固定15 min，PBS洗3次。將小室放置于預(yù)先加有0.1%結(jié)晶紫的溶液中，室溫下作用30 min。PBS漂洗后，于倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)(隨機(jī)選5個(gè)視野)和拍照。

1.2.8 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

取對數(shù)生長期細(xì)胞，按每孔1×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)48 h后細(xì)胞鋪滿6孔板時(shí)，利用槍頭尖在細(xì)胞培養(yǎng)液表面劃一條痕跡(長約2 cm)，繼續(xù)培養(yǎng)12和24 h后，在顯微鏡下觀察各組胃癌細(xì)胞遷移變化情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，實(shí)驗(yàn)組和對照組之間的比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 采用qRT-PCR和Western blot檢測PTP1B基因及蛋白的表達(dá)

采用qRT-PCR和Western blot檢測pGPU6/ GFP/Neo-shRNA NC和pGPU6/GFP/Neo-shRNA轉(zhuǎn)染MKN28細(xì)胞后PTP1B基因及蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與空白組和shRNA NC組相比，shRNA#1和shRNA#2組PTP1B的表達(dá)明顯受抑制(mRNA：F=180.62，P=0.00；蛋白：F=55.46，P＜0.05)。shRNA#1和shRNA#2組PTP1B mRNA表達(dá)分別下降了85%和69% (圖1)。shRNA#1和shRNA#2組PTP1B蛋白的表達(dá)分別減少了82.5%和61.2%(圖2)。為了減少干擾的脫靶效應(yīng)，我們選擇了這兩個(gè)不同PTP1B表達(dá)水平的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。此外，我們還選擇了PTP1B表達(dá)水平相對較低的MKN45胃癌細(xì)胞株，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PTP1B以提高M(jìn)KN45細(xì)胞內(nèi)PTP1B表達(dá)水平用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，采用qRT-PCR和Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)PTP1B基因和蛋白表達(dá)水平(圖3)。

2.2 PTP1B表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖活性

為了明確PTP1B在細(xì)胞增殖活性中的作用，將得到的不同PTP1B表達(dá)水平的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞用于體外增殖活性實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞分別接種在96孔板中，在0、24、48、72和96 h等不同時(shí)間段測定細(xì)胞增殖活性(以D值來表示，D值越高細(xì)胞的增殖速度就越快)，繪制細(xì)胞增殖曲線(圖4)。結(jié)果顯示，與空白組和shRNA NC組相比，shRNA#1和shRNA#2組在48、72和96 h時(shí)細(xì)胞的增殖活性明顯下降，D值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(48 h：F=20.005，P=0.002；72 h：F=277.01，P=0.000；96 h：F=173.436，P=0.000)。而提高PTP1B的表達(dá)，MKN45細(xì)胞增殖活性在72和96 h后明顯增高(72 h：F=22.028，P=0.009；96 h：F=38.227，P=0.003，圖5)。

圖 1 qRT-PCR檢測PTP1B shRNA轉(zhuǎn)染MKN28細(xì)胞后PTP1B mRNA的表達(dá)水平Fig. 1 qRT-PCR analysis of PTP1B mRNA expression in MKN28 cells transfected with shRNA

圖 2 Western blot檢測PTP1B shRNA轉(zhuǎn)染MKN28細(xì)胞后PTP1B蛋白表達(dá)水平Fig. 2 Western blot analysis of PTP1B protein expression in MKN28 cells transfected with shRNA

圖 3 pcDNA3.1-hPTP1B重組載體轉(zhuǎn)染MKN45細(xì)胞后PTP1B的表達(dá)Fig. 3 The expression of PTP1B in MKN45 cells transfected with pcDNA3.1-hPTP1B vector

圖 4 下調(diào)PTP1B在MKN28細(xì)胞中的表達(dá)明顯抑制了細(xì)胞的增殖活性Fig. 4 Significant inhibition of cell proliferation after downregulation of PTP1B expression in MKN28 cells

圖 5 上調(diào)PTP1B在MKN45細(xì)胞中的表達(dá)明顯增強(qiáng)了細(xì)胞的增殖活性Fig. 5 Significant enhancement of cell proliferation after up-regulation of PTP1B expression in MKN45 cells

2.3 PTP1B表達(dá)增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的克隆形成能力

將不同PTP1B表達(dá)水平的胃癌細(xì)胞分別接種在預(yù)先鋪有1.2%瓊脂糖的6孔板中培養(yǎng)2周，觀察PTP1B的表達(dá)對胃癌細(xì)胞克隆形成的影響，并在倒置顯微鏡下進(jìn)行克隆計(jì)數(shù)，比較不同PTP1B表達(dá)水平的同樣類型胃癌細(xì)胞的克隆形成率。結(jié)果顯示，在MKN28胃癌細(xì)胞中，PTP1B表達(dá)下調(diào)shRNA#1和shRNA#2組的胃癌細(xì)胞克隆形成率較MKN28細(xì)胞和對照組細(xì)胞要明顯降低，并且所形成的克隆體積也明顯減小(圖6)，MKN28、shRNA NC、shRNA#1和shRNA#2四組胃癌細(xì)胞的克隆形成率分別為(48.6±5.6)%、(42.7±5.0)%、(12.1±4.4)%和(22.8±3.1)%(F=85.427，P=0.000)。而提高PTP1B表達(dá)后，胃癌細(xì)胞克隆形成率明顯增加、形成的克隆體積也較大(圖7)，MKN45/ PTP1B、MKN45/pcDNA3.1和MKN45組胃癌細(xì)胞的克隆形成率分別為(80.5±9.2)%、(38.6±6.5)%和(28.9±5.4)%(F=76.24，P=0.000)。

2.4 PTP1B表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移能力

將實(shí)驗(yàn)組和對照組胃癌細(xì)胞分別接種在Transwell小室中，用含10%小牛血清培養(yǎng)液作為細(xì)胞趨向運(yùn)動(dòng)的誘導(dǎo)劑，24 h后對穿過基底膜的胃癌細(xì)胞用0.1%的結(jié)晶紫進(jìn)行染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。結(jié)果顯示，空白組、shRNA NC、shRNA#1和shRNA#2組在24 h穿過基底膜的細(xì)胞數(shù)分別是(135.8±20.7)、(142.5±23.0)、(35.3±6.7)和(43.1±8.4)個(gè)/視野(空白組和shRNA NC組 vs shRNA#1和shRNA#2組：F=88.138，P=0.000，圖8)。與之相反，上調(diào)PTP1B在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)后，24 h穿過基底膜的細(xì)胞明顯增加(空白組和pcDNA3.1組 vs MKN45/pcDNA3.1組：F=36.932，P=0.000，圖9)。為了進(jìn)一步明確PTP1B的表達(dá)對MKN28胃癌細(xì)胞遷移的影響，本研究同時(shí)進(jìn)行了細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，隨著時(shí)間推移，空白組和shRNA NC組細(xì)胞愈合速度較shRNA#1、shRNA#2組的愈合速度快(F=10.833，P=0.003)。因此，RNA沉默PTP1B表達(dá)后可以有效抑制MKN28細(xì)胞遷移能力(圖10)。

圖 6 下調(diào)PTP1B的表達(dá)抑制MKN28細(xì)胞的克隆形成Fig. 6 Inhibition of colony formation after down-regulation of PTP1B expression in MKN28 cells

圖 7 上調(diào)PTP1B的表達(dá)促進(jìn)MKN45細(xì)胞的克隆形成Fig. 7 Promotion of colony formation after up-regulation of PTP1B expression in MKN45 cells

圖 8 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染shRNA后MKN28細(xì)胞遷移能力Fig. 8 Cell migration of MKN28 cells transfected with shRNA detected by Transwell assay

圖 9 上調(diào)PTP1B的表達(dá)增強(qiáng)MKN45細(xì)胞的遷移能力Fig. 9 Enhancement of cell migration after up-regulation of PTP1B expression in MKN45 cells

圖 10 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染shRNA后MKN28細(xì)胞遷移能力Fig. 10 Cell migration of MKN28 cells transfected with shRNA detected by wound healing assay

3 討 論

進(jìn)展期胃癌手術(shù)后5年生存率只有20%～50%，被寄予厚望的輔助化療、放療等迄今也未能明顯改善胃癌患者的預(yù)后［3］。研究發(fā)現(xiàn)，影響胃癌預(yù)后的因素較多，主要包括胃癌早期診斷率低、手術(shù)后易于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等。因此，充分認(rèn)識胃癌生物學(xué)行為的分子機(jī)制研究具有重要作用。PTP1B是PTPs家族中的一員，最初是從人的胎盤組織中所提取作為一個(gè)相對分子質(zhì)量為37×103的催化結(jié)構(gòu)域［1］。研究結(jié)果顯示，PTP1B在乳腺癌［4］、卵巢癌［5］、結(jié)腸癌［6］和一些上皮來源的腫瘤［7］等多種腫瘤組織或細(xì)胞中高表達(dá)，并有促進(jìn)細(xì)胞增殖生長、分化和腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用。前期研究發(fā)現(xiàn)，PTP1B在胃癌細(xì)胞株和胃癌組織中均高表達(dá)，并且PTP1B在胃癌組織中的表達(dá)與胃癌的TNM分期、淋巴結(jié)浸潤及腫瘤原發(fā)部位的浸潤有明顯的相關(guān)性［2］。PTP1B在TNM分期較晚(Ⅲ和Ⅳ期)和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N1、N2和N3)的患者胃癌組織中的表達(dá)要明顯高于其在TNM分期較早(Ⅰ和Ⅱ期)和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N0)的患者胃癌組織中的表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)將shRNA轉(zhuǎn)染MKN28胃癌細(xì)胞下調(diào)PTP1B表達(dá)。qRT-PCR及Western blot分析結(jié)果顯示，PTP1B mRNA和蛋白表達(dá)均被明顯抑制。PTP1B表達(dá)下調(diào)后，MKN28細(xì)胞的增殖活性及遷移能力被顯著抑制。相反，pcDNAPTP1B轉(zhuǎn)染MKN45細(xì)胞上調(diào)PTP1B表達(dá)后，MKN45細(xì)胞的增殖活性和遷移能力明顯增強(qiáng)。因此，PTP1B與胃癌的增殖、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)。在結(jié)腸癌中，PTP1B通過激活Src激酶而促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長［6］。在永生化成纖維細(xì)胞中，下調(diào)PTP1B在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)可以降低Ras原癌基因的活性從而達(dá)到抑制該細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和增殖的作用［8］。Julien等［9］的研究顯示，PTP1B的表達(dá)是HER-2/Neu誘導(dǎo)的乳腺癌所必需的，并且下調(diào)PTP1B表達(dá)可以抑制HER-2/Neu誘導(dǎo)的乳腺癌的發(fā)生和肺部轉(zhuǎn)移。

腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移是一系列多因素、多信號通路相互作用的結(jié)果。目前的研究結(jié)果顯示，PTP1B與ErbB2、Akt/PIK、Ras等多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相互作用，調(diào)控腫瘤增殖、轉(zhuǎn)化和侵襲［10］。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)PTP1B表達(dá)下調(diào)抑制胃癌細(xì)胞的增殖和遷移。因此，進(jìn)一步研究PTP1B可能有助于揭示胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機(jī)制，并可能為胃癌的分子靶向治療提供新的研究方向。

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Effect of PTP1B gene on the proliferation and migration of human gastric cancer cell lines

WANG

Jinguo, WU Pei, WU Jian, MAO Jiading (Department of Gastrointestinal Surgery, Yijishan Hospital, Wannan Medical College, Wuhu Anhui 241000, China)

WANG Jinguo E-mail: shwangjg@sina.com

Background and purpose: Gastric cancer is the most common malignant tumor of digestive tract, and the possibility of postoperative recurrence and metastasis is higher. Our previous studies showed that protein tyrosine phosphatase1B (PTP1B) gene is closely correlated with tumor size, lymph node metastasis and TNM stage of gastric cancer. The purpose of the present study was to explore the effect of PTP1B gene on cell proliferation and migration of gastric cancer cell lines. Methods: Short hairpin RNA (shRNA) sequence targeting PTP1B gene and PTP1B cDNA were transfected into MKN28 and MKN45 cells, respectively. The expression of PTP1B mRNA and its protein in MKN28 and MKN45 cells were detected by quantitative real-time PCR (qRT-PCR) and Western blot, respectively. The effect of PTP1B on cell proliferation and migration was respectively assessed by cell counting kit-8 (CCK-8) assay, Transwell migration assay and wound healing assay. Results: Compared with blank and negative controls, the expressions of PTP1B mRNA and protein in MKN28 cells were successfully suppressed after the cells were transfected with shRNA (P＜0.05). As CCK-8 test showed, the proliferation of MKN28 cells was successfully restrained at 48, 72 and 96 h after transfected with shRNA compared with blank control and negative control (P＜0.05). Transwell and wound healing test were performed after PTP1B expression was interfered by shRNA. The result demonstrated that migration of MKN28 cells was significantly inhibited (P＜0.05). On the contrary, the expressions of PTP1B mRNA and protein in MKN45 cells were obviously enhanced after the cells were transfected with PTP1B cDNA. And the proliferation and migration of cells were significantly increased. Conclusion: PTP1B gene is an

Gastric cancer; Protein tyrosine phosphatase 1B; Short hairpin RNA; Cell proliferation; Cell migration

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.08.004

R735.2

A

1007-3639(2015)08-0579-09

2014-09-15

2014-11-20）

安徽省教育廳自然科學(xué)基金資助(2011KJ193)；蕪湖市科技計(jì)劃項(xiàng)目資助(2012hm29-1);安徽省自然科學(xué)基金(1508085MH147)。

汪進(jìn)國 E-mail：shwangjg@sina.com

important enchancer for the proliferation and migration of gastric cancer.