雞基因工程復(fù)合抗病毒制劑凍干保護(hù)劑的篩選

張代寶，閆若潛，劉 煒，賈松濤

（1.鄭州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南鄭州 450015；2.河南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南鄭州 450008）

雞基因工程復(fù)合抗病毒制劑凍干保護(hù)劑的篩選

張代寶1，閆若潛2，劉 煒1，賈松濤1

（1.鄭州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南鄭州 450015；2.河南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南鄭州 450008）

采用不同高壓滅菌條件處理的不同比例的脫脂奶粉、蔗糖、海藻糖以及維生素C組成的保護(hù)劑配方對(duì)雞基因工程復(fù)合抗病毒制劑進(jìn)行凍干，凍干后通過(guò)外觀檢查、pH值檢測(cè)、復(fù)水性檢測(cè)及效價(jià)測(cè)定比較篩選出了理想的凍干保護(hù)劑，之后將普通水劑型和凍干型雞基因工程復(fù)合抗病毒制劑分別置于4℃、-20℃、-70℃條件下進(jìn)行保存期試驗(yàn)，結(jié)果表明采用脫脂奶粉+蔗糖、脫脂奶粉+蔗糖+海藻糖+維生素C兩種配方對(duì)雞基因工程復(fù)合抗病毒制劑的保護(hù)效果最好，凍干后效價(jià)仍為220；普通水劑和凍干型雞基因工程復(fù)合抗病毒制劑在-70℃保存條件下保存360天內(nèi)效價(jià)均未降低，普通水劑分別于90天、180天后效價(jià)開(kāi)始明顯下降，而凍干型雞基因工程復(fù)合抗病毒制劑的效價(jià)均無(wú)明顯降低，穩(wěn)定性良好。本研究初步篩選出了雞基因工程抗病毒制劑的凍干配方，顯著延長(zhǎng)了其保存期，為雞基因工程抗病毒制劑規(guī)?；a(chǎn)和推廣應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

雞基因工程復(fù)合抗病毒制劑；凍干；保護(hù)劑；保存期

干擾素（interferon，IFN）是由細(xì)胞分泌的一類(lèi)誘生性蛋白質(zhì)，具有廣譜的抗病毒，抑制細(xì)胞分裂和免疫調(diào)節(jié)活性，是一種重要的抗病毒、抗腫瘤治療藥物，也是治療動(dòng)物病毒性疫病的重要藥物[1-2]。白細(xì)胞介素-2（IL-2）是輔助T細(xì)胞分泌的淋巴因子，在免疫系統(tǒng)中起著重要的作用，它能促進(jìn)T細(xì)胞、NK細(xì)胞、B細(xì)胞的分化成熟及激活其生物活性，誘導(dǎo)淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞（LAK）活性，還能促進(jìn)許多淋巴因子如干擾素、腫瘤壞死因子等的合成與釋放以及抗體生成，大大增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。但該類(lèi)制劑在生產(chǎn)實(shí)踐的應(yīng)用中仍有許多問(wèn)題，比如熱穩(wěn)定性差、不易長(zhǎng)期保存和遠(yuǎn)距離運(yùn)輸?shù)葐?wèn)題。較理想的辦法是對(duì)其進(jìn)行真空冷凍干燥，這樣不僅可以利用簡(jiǎn)易條件延長(zhǎng)保存期，而且有利于長(zhǎng)距離運(yùn)輸。因此，筆者在前期成功構(gòu)建融合表達(dá)和純化ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因的基礎(chǔ)上，對(duì)以rIFN-α-linker-IL-2重組復(fù)合蛋白為主要成份的雞基因工程復(fù)合抗病毒制劑進(jìn)行了凍干保護(hù)劑的篩選和保存期的實(shí)驗(yàn)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

抗病毒效價(jià)為220雞基因工程復(fù)合抗病毒制劑、水泡性口炎病毒（VSV）病毒株由河南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心技術(shù)研究室保存；SPF雞胚，由乾元浩鄭州生物藥廠實(shí)驗(yàn)室提供；DEME基礎(chǔ)培養(yǎng)基及完全培養(yǎng)基由上海拜力生物科技有限公司生產(chǎn)；小牛血清由杭州四季青生物工程有限公司生產(chǎn)；胰酶由上海滬宇生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 凍干保護(hù)劑的準(zhǔn)備

分別按照表1、表2、表3的配方和處理?xiàng)l件配置相應(yīng)的凍干保護(hù)劑。

表1 一組凍干保護(hù)劑準(zhǔn)備

表2 二組凍干保護(hù)劑準(zhǔn)備

表3 三組凍干保護(hù)劑準(zhǔn)備

1.2.2 凍干工藝 將準(zhǔn)備好的凍干保護(hù)劑與雞基因工程抗病毒制劑按1∶1的比例混合，用濾器（0.22μm孔徑）除菌過(guò)濾，將抗病毒制劑溶液分裝在清洗干凈并經(jīng)高壓滅菌處理的青霉素瓶中；分裝完成后放進(jìn)真空冷凍干燥機(jī)箱體內(nèi)，進(jìn)箱完畢后25℃保持2.5h，使所有產(chǎn)品從25℃同一起點(diǎn)降溫到-50℃，并在-50℃保持4h，然后回?zé)岬?10℃并保持 1.5h；預(yù)凍階段結(jié)束后進(jìn)行升華，將板層溫度控制在-10℃，使產(chǎn)品在-10℃溫度維持48h，直到產(chǎn)品中的凍結(jié)冰升華完畢 ；解析階段分多步驟完成：先把溫度升到-5℃并維持1h，1h后升溫到0℃并維持1h，然后再升溫到10℃并維持1h，最后升溫到25℃，在該溫度和高真空的狀況下保持 4h。最后壓塞，打開(kāi)凍干箱，取出產(chǎn)品，壓鋁蓋，完成凍干。

1.2.3 雞基因工程復(fù)合抗病毒制劑凍干制品的檢定①凍干后外觀、溶解度、pH值檢測(cè)

檢查凍干產(chǎn)品的外形、結(jié)構(gòu)、體積、色澤、質(zhì)地。溶解度檢測(cè)是指凍干后產(chǎn)品的返溶于水的能力，凍干干擾素制劑在加入滅菌注射用水后，應(yīng)迅速溶解，且不含有肉眼可見(jiàn)的不溶物。用酸度計(jì)測(cè)定pH值，應(yīng)與凍干前保持一致，范圍為6.5～7.5。

②凍干后效價(jià)測(cè)定

取凍干制劑，以注射用水再溶解，采用微量細(xì)胞病變抑制法測(cè)定樣品的生物活性。主要操作步驟如下：取10日齡SPF雞胚，外殼消毒后打開(kāi)氣

室，無(wú)菌條件下取出雞胚，放于一次性平皿中；去除頭和四肢，剝離內(nèi)臟，用PBS液洗滌三次；用高壓過(guò)的小剪子剪碎胚體，用PBS液洗滌三次；加入30 mL DMEM培養(yǎng)基和6 mL消化液，置于37℃的水浴鍋中消化20 min，倒掉培養(yǎng)液；加入30 mLDMEM完全培養(yǎng)基，用吸管吹打使細(xì)胞均勻散落；取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入100 μL上述分離的細(xì)胞，置于5%CO2、37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將雞基因工程復(fù)合抗病毒制劑樣品作21～220稀釋?zhuān)?xì)胞長(zhǎng)滿單層，加入系列稀釋的雞基因工程復(fù)合抗病毒制劑樣品100μL，每個(gè)樣品重復(fù)4孔，同時(shí)作細(xì)胞空白對(duì)照組和VSV毒對(duì)照組，5%CO2、37℃培養(yǎng)24 h后，每孔加入100μL 200 TCID50的VSV病毒稀釋液，培養(yǎng)24h左右，觀察病變，按照獸藥典中的Reed-Muench兩氏法判定效價(jià)。

1.2.4 雞基因工程復(fù)合抗病毒制劑保存期試驗(yàn)

采用上述篩選出的凍干保護(hù)劑配方進(jìn)行凍干，取凍干型雞基因工程復(fù)合抗病毒制劑和普通水劑，每個(gè)4組，分別置于4℃、-20℃、-70℃條件下保存，于15d、30d、60d、90d、180d、360d分別測(cè)定樣品效價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 凍干后外觀、溶解度、 pH值檢測(cè)結(jié)果

白色或微黃色海綿狀疏松體結(jié)構(gòu)，質(zhì)地細(xì)膩，均勻分布于瓶底，凍干前后體積不變；加入滅菌注射用水后，迅速溶解，平均復(fù)水時(shí)間不超過(guò)5s，且不含肉眼可見(jiàn)的不溶物；pH值為7.3，與凍干前保持一致。

2.2 凍干后效價(jià)測(cè)定結(jié)果

表4、表5結(jié)果顯示 ：除了第二組中配方4（10%蔗糖+0.5%海藻糖），采用第二組高壓滅菌方法處理得到的凍干保護(hù)劑凍干制備的雞基因工程復(fù)合抗病毒制劑效價(jià)均高于第一組，這說(shuō)明凍干保護(hù)劑的滅菌處理方式對(duì)凍干后制劑效價(jià)影響較大，采用110℃，15min的高壓滅菌方式對(duì)于凍干保護(hù)劑的效果更好，并初步篩選除了凍干保護(hù)劑的配方和濃度。

表6結(jié)果表明：按照配方2、配方4制備的凍干保護(hù)劑與雞基因工程復(fù)合抗病毒制劑混合凍干后得到的制劑抗病毒活性最高，表明其凍干保護(hù)效果最好；配方1的凍干保護(hù)效果稍低于配方3，但配方3中海藻糖價(jià)格較高，從規(guī)模化凍干的成本和雞基因工程復(fù)合抗病毒制劑的推廣應(yīng)用方面考慮，選取配方2（10%脫脂奶粉+5%蔗糖）作為凍干保護(hù)及配方具有價(jià)格低廉、便于推廣應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)。

表4 第一組凍干保護(hù)劑凍干后的效價(jià)

表5 第二組凍干保護(hù)劑凍干后的效價(jià)

表6 第三組凍干保護(hù)劑凍干后的效價(jià)

2.5 雞基因工程復(fù)合抗病毒制劑保存期試驗(yàn)結(jié)果

由表7、表8及圖1、圖2結(jié)果表明 ：除了在-70℃條件下，水劑和凍干劑型雞基因工程復(fù)合抗病毒制劑最長(zhǎng)放置1年效價(jià)仍為220，均無(wú)下降，但在4℃和-20℃保存下，普通水劑的效價(jià)分別于90、180d后由220降至215、220降至216，開(kāi)始明顯下降；而凍干型雞基因工程復(fù)合抗病毒制劑的效價(jià)在-20℃保存360天仍為220，并未下降，僅在4℃保存條件下由180 d的220降至360d的219。這表明所篩選的凍干保護(hù)劑配方能夠較好地發(fā)揮對(duì)雞基因工程復(fù)合抗病毒制劑的保護(hù)作用，延長(zhǎng)雞基因工程復(fù)合抗病毒制劑的保存期。

3 討論

表7 普通水劑雞基因工程復(fù)合抗病毒制劑不同保存期后效價(jià)

圖1 不同條件下保存不同時(shí)間對(duì)水劑型雞基因工程復(fù)合抗病毒制劑效價(jià)的影響

表8 凍干型雞基因工程復(fù)合抗病毒制劑不同保存期后效價(jià)

圖2 不同條件下保存不同時(shí)間對(duì)凍干型雞基因工程復(fù)合抗病毒制劑效價(jià)的影響

凍干過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的相變過(guò)程，在預(yù)凍、升華、干燥和儲(chǔ)存過(guò)程中，存在著很多誘導(dǎo)干擾素中蛋白質(zhì)變性的因素，為保護(hù)干擾素中蛋白質(zhì)、多肽等成分的活性，有利于干擾素凍干制劑成品的成型，在配方中通常添加凍干保護(hù)劑來(lái)穩(wěn)定干擾素中的蛋白質(zhì)。目前，凍干干擾素制劑大都采用人血白蛋白作為保護(hù)劑，然而，人血白蛋白存在引起血源性污染（感染乙型肝炎、丙型肝炎和艾滋病的危險(xiǎn)）、價(jià)格昂貴、需要低溫密封保存、 能夠在人體內(nèi)產(chǎn)生抗體、引起部分人過(guò)敏等不足之處[3]，所以不少學(xué)者近年來(lái)在努力尋找其替代物，避免使用人血白蛋白，意圖解決上述問(wèn)題。本研究旨在篩選出一種能安全、成本低、能夠替代人血白蛋白的凍干保護(hù)劑，從而實(shí)現(xiàn)規(guī)化凍干和生產(chǎn)，為雞基因工程復(fù)合抗病毒制劑的推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

糖是一種最易得、使用最廣泛的凍干保護(hù)劑，是蛋白質(zhì)的非特異性穩(wěn)定劑，在預(yù)定、解吸、干燥等多個(gè)階段均能對(duì)藥物發(fā)揮凍干保護(hù)作用[4]。本研究中采用的蔗糖和海藻糖都屬于二糖，其中蔗糖呈無(wú)定型結(jié)構(gòu)，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，能夠顯著阻止凍干過(guò)程中蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變和儲(chǔ)藏時(shí)內(nèi)蛋白質(zhì)的伸展和聚集。蔗糖的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度相對(duì)較高，凍干狀態(tài)下，它與蛋白質(zhì)發(fā)生共濃縮，從而稀釋了蛋白質(zhì)濃度，防止發(fā)生聚合，使藥物的分子結(jié)構(gòu)得以維持。另外，海藻糖、蔗糖上的羥基代替部分的結(jié)合水與藥物分子上的氨基和羰基結(jié)合，形成氫鍵，使其在缺水條件下仍能保持原有蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)不變，從而保持活性[5]。海藻糖的比蔗糖具有更低的吸濕性和更高的玻璃化溫度[6-7]，并且不具有還原性，因此凍干保護(hù)效果更好，這在本研究也得到了體現(xiàn)：10%脫脂奶粉+5%蔗糖配方的效果稍差于10%脫脂奶粉+5%蔗糖+0.5%海藻糖+0.2%維生素C配方的效果。但考慮到藥品成本等方面的因素，10%脫脂奶粉+5%蔗糖配方降低了生產(chǎn)成本，有利于雞基因工程復(fù)合抗病毒制劑在市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)中處于有利地位。

本研究所篩選的脫脂奶粉+蔗糖和脫脂奶粉+蔗糖+海藻糖+維生素C配方及采用的凍干劑高壓處理方法處理后得到的凍干保護(hù)劑可有效保護(hù)雞基因工程復(fù)合抗病毒制劑，二者混合凍干后可有效延長(zhǎng)制劑的保存期和穩(wěn)定其效價(jià)，為雞基因工程復(fù)合抗病毒制劑的規(guī)?；a(chǎn)和推廣應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：胡藕祥）

Screening of Cryoprotectants for Chicken Genetic Engineering Composite Antiviral Preparations

Zhang Daibao1，Yan Ruoqian2，Liu Wei1，Jia Songtao1
（1.Zhengzhou Animal Disease Control and Prevention Center，Zhengzhou，Henan 450015；2.Henan Animal Disease Control and Prevention Center，Zhengzhou，Henan 450008）

The chicken genetic engineering composite antiviral preparation was freeze-dried with different cryoprotectant prescriptions made up with skim milk，sucrose，trehalose and Vc by means of different autoclaved sterilization. The ideal cryoprotectant was selected through appearance examination，pH measurement，rehydration test and potency test. The aqueous chicken genetic engineering composite antiviral preparation and lyophilized chicken genetic engineering composite antiviral preparation were placed under 4℃，-20℃，-70℃ for preservation period test. The result suggested that the two cryoprotectant prescriptions（skim milk＋sucrose and skim milk＋sucrose＋trehalose＋Vc）could best protect chicken genetic engineering composite antiviral preparation with the antiviral titer of 220. The preservation period test showed that the aqueous chicken genetic engineering composite antiviral preparation and the lyophilized chicken genetic engineering composite antiviral preparation under -70℃ could be preserved for one year with no decline of the titer；while under 4℃ and -20℃，the titers of the aqueous preparation started to decline respectively after 90d and 180d，and the titer of the lyophilized preparation did not decline under -20℃ and decreased a little under 4℃ after 180d. The result indicated that the selected cryoprotectants could remarkably extend the preservation period of the chicken genetic engineering composite antiviral preparation. The study selected the cryoprotectant of chicken genetic engineering composite antiviral preparation，successfully prepared lyophilized chicken genetic engineering composite antiviral preparation with good appearance. It also lay the foundation for the large-scale production of chicken genetic engineering composite antiviral preparation and made some contribution to clinic promotion and application.

chicken genetic engineering composite antiviral preparation；lyophilization；cryoprotectant；preserve period

TB64

A

1005-944X（2015）08-0079-04