兔黏液瘤病快速檢測方法的建立

林穎崢，林士佳，宋 青，郭雨雁，包雯駿，熊 煒，李樹清，魏曉鋒

（1．上海出入境檢驗(yàn)檢疫局，上海 200135；2．上海實(shí)驗(yàn)動物研究中心，上海 201203）

兔黏液瘤病快速檢測方法的建立

林穎崢1，林士佳1，宋 青1，郭雨雁1，包雯駿1，熊 煒1，李樹清1，魏曉鋒2

（1．上海出入境檢驗(yàn)檢疫局，上海 200135；2．上海實(shí)驗(yàn)動物研究中心，上海 201203）

兔黏液瘤病是由兔黏液瘤病毒引起的兔的一種高度接觸性、致死性傳染病。為了加強(qiáng)口岸對進(jìn)境野生及實(shí)驗(yàn)用兔中兔黏液瘤病的篩查和流行病學(xué)調(diào)查，本研究建立了PCR和Real-time PCR快速高通量檢測兔黏液瘤病的方法，證實(shí)兩種檢測方法具有良好的特異性和靈敏性，適用于兔黏液瘤病的快速檢測。

兔黏液瘤??；PCR；Real-time PCR；Taqman探針

兔粘液瘤?。╩yxomatosis）是由兔粘液瘤病毒引起的一種高度接觸性、致死性傳染病。該病以全身皮下特別是顏面部和天然孔周圍皮下發(fā)生粘液瘤性腫脹為主要特征[1]。本病是一種自然疫源性疾病，最早于1896年在烏拉圭發(fā)現(xiàn)，隨后不久即傳播到南美的巴西、阿根廷、哥倫比亞和巴拿馬等國家。1930年，此病經(jīng)墨西哥傳入美國加利福尼亞州，目前在美國西部各州呈地方性流行。1950年，澳大利亞為消滅野兔所造成的危害，人為地將黏液瘤病毒引入。1952年，該病傳入歐洲，在18個月內(nèi)傳遍了法國、比利時、德國和荷蘭等國，并越過英吉利海峽傳到英倫三島，同時斯堪地那維亞和北非國家也有此病的流行。到目前為止，已發(fā)生過本病的國家和地區(qū)至少有56個。

黏液瘤病毒（myxoma virus）屬痘病毒科（Poxviridae）野兔痘病毒屬（Leporiuirus genus）[2]。本病有高度的宿主特異性，只發(fā)生于家兔和野兔，其它動物不易感。本病的主要傳播方式是直接與病兔及其排泄物、分泌物接觸或與被病毒污染的飼料、飲水和用具接觸。在自然界，蚊子、跳蚤、虱、螨等吸血昆蟲是最常見的病毒傳播者[3]。兔黏液瘤病全年均可發(fā)生，病情嚴(yán)重時死亡率可達(dá)100%。該病主要流行于大洋洲、美洲、歐洲諸國。目前檢測兔黏液瘤病的方法主要有病原分離鑒定、瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、免疫熒光抗體試驗(yàn)、血清中和試驗(yàn)、ELISA方法等。這些傳統(tǒng)檢測方法受試樣本具有一定的局限性，同時操作繁瑣且靈敏度較低[4～7]。

我國目前尚未發(fā)現(xiàn)本病，但近幾年實(shí)驗(yàn)研究證明，中國家兔感染兔黏液瘤病毒后的發(fā)病率和死亡率均為100%，世界動物衛(wèi)生組織和我國分別將其列為報告疫病和二類動物傳染病。隨著對國外各種種兔及兔產(chǎn)品原料等的引入，我國養(yǎng)兔業(yè)引入該病的潛在威脅很大，一旦傳入，該病所造成的危害和經(jīng)濟(jì)損失將無法估量。為了加強(qiáng)口岸對進(jìn)境野生及實(shí)驗(yàn)用兔中兔黏液瘤病的篩查和流行病學(xué)調(diào)查，本研究建立了PCR和Real-time PCR快速高通量檢測兔黏液瘤病的方法，并對所建立的兔黏液瘤病核酸檢測方法的特異性和靈敏性進(jìn)行了評估。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

Trizol購自Invitrogen公司；DNA提取試劑盒購自QIAGEN公司；Taq酶、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、dNTP、隨機(jī)引物、DNA Marker（DL2000）購自TaKaRa公司。

1.2 病毒樣品來源及處理

兔黏液瘤病毒陽性組織樣品、血清和細(xì)胞培養(yǎng)物來自上海實(shí)驗(yàn)動物研究中心。陽性組織樣品加等體積生理鹽水研磨成勻漿，3000g離心15min，收集上清液待檢。本研究使用的其他病毒如兔病毒性出血癥病毒、兔痘病毒、兔纖維瘤病毒、兔輪狀病毒、兔水皰性口炎病毒來自上海實(shí)驗(yàn)動物研究中心。根據(jù)病毒核酸性質(zhì)，上述病毒樣品分別經(jīng)核酸分離提取制備成DNA或cDNA模板備用。

1.3 PCR檢測

針對兔黏液瘤病毒的融合糖蛋白（fusion glycoprotein）基因設(shè)計(jì)PCR引物，其擴(kuò)增基因片段大小為431 bp，其上游引物：5' -AGA ACA TAG ACA TAG ACG ATC TGA CC- 3'，下游引物：5' -GCA GAA TAC GTG ATT GCA GTG AGA- 3'。在PCR薄壁管中，加模板2 μL、10×Taq酶濃縮緩沖液2.5 μL、dNTP 0.5 μL、上下游引物各0.25 μL、Taq酶0.25 μL，加水補(bǔ)足總體積至25 μL。將PCR管置PCR儀上，按如下程序擴(kuò)增：首先94℃預(yù)變性3min；然后94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸 40s，35個循環(huán)；最后72℃延伸3min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠成像系統(tǒng)拍攝。

1.4 Real-time PCR引物和TaqMan探針

使用Vector NTI Suite軟件分析不同國家和地區(qū)分離的兔黏液瘤病毒基質(zhì)蛋白（matrix protein）基因的保守序列，用Primer Express軟件設(shè)計(jì)引物和TaqMan探針，上游引物：5' -AAA GGA GAG GAA TGC GCC ATA T- 3'，下游引物：5' -CAC GCC GAA GAA ACT ACT CTT AAT G- 3'，TaqMan探針：5' -ACC CGT ATA CGC CAA AC- 3'，其中TaqMan探針的5' 端標(biāo)記FAM，3' 端標(biāo)記MGB。引物和探針由上海輝睿生物科技有限公司合成，引物和探針的濃度均為25 μmol/L。

1.5 Real-time PCR檢測

采用ABI公司ViiA7熒光PCR儀。反應(yīng)體系：10×Taq酶濃縮緩沖液2.5μL、dNTP 0.5μL、Taq酶0.25μL、模板1μL、上下游引物各0.25μL、TaqMan探針0.25μL，加水補(bǔ)足總體積至25μL。反應(yīng)條件：首先95℃預(yù)變性3min；然后95℃15s，58℃ 45s，40個循環(huán)，每個循環(huán)第二步收集熒光信號。

2 結(jié)果

2.1 PCR和Real-time PCR檢測兔黏液瘤病毒的特異性試驗(yàn)

針對兔黏液瘤病毒保守基因序列，設(shè)計(jì)引物和探針，分別建立PCR和Real-time PCR檢測方法，并使用不同兔病毒（如兔病毒性出血癥病毒、兔痘病毒、兔纖維瘤病毒、兔輪狀病毒、兔水皰性口炎病毒）作為對照，測試這兩種檢測方法的特異性。結(jié)果顯示，經(jīng)PCR檢測，僅有兔黏液瘤病毒陽性樣品出現(xiàn)條帶單一的特異性基因擴(kuò)增，其他對照病毒樣品均呈陰性（圖1）；經(jīng)Real-time PCR檢測，兔黏液瘤病毒陽性樣品在10～12個循環(huán)處出現(xiàn)顯著擴(kuò)增，對照病毒樣品未見擴(kuò)增（圖2）。

2.2 PCR和Real-time PCR檢測兔黏液瘤病毒的靈敏性試驗(yàn)

為測試所建立的PCR和Real-time PCR方法的靈敏性，將兔黏液瘤病毒陽性樣品DNA進(jìn)行

定量并梯度稀釋，制備濃度分別為10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/ μL、10fg/μL、1fg/μL的模板，再分別用建立的兩種方法進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，PCR檢測兔黏液瘤病毒陽性樣品DNA模板的下限量為100～10pg（圖3），而Real-time PCR檢測兔黏液瘤病毒DNA模板的下限量為100～10fg（圖4）。

圖1 PCR檢測兔黏液瘤病毒的特異性

圖2 Real-time PCR檢測兔黏液瘤病毒的特異性

圖3 PCR檢測兔黏液瘤病毒的靈敏性

圖4 Real-time PCR檢測兔黏液瘤病毒的靈敏性試驗(yàn)

3 討論

兔黏液瘤病毒是感染兔的主要病原之一，其危害嚴(yán)重，一旦感染較難從兔群中清除，影響實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，是實(shí)驗(yàn)動物養(yǎng)殖和使用中重點(diǎn)防范的疫病。數(shù)十年來，學(xué)者們對兔黏液瘤病毒的病原學(xué)特性和診斷方法進(jìn)行了深入研究。將兔黏液瘤病毒感染動物病料接種11～13日齡SPF雞胚絨毛尿囊腔進(jìn)行病毒分離鑒定，是診斷兔黏液瘤病最傳統(tǒng)、最經(jīng)典的方法，但該方法比較耗時、繁瑣，且本病與兔纖維瘤病毒病原學(xué)形態(tài)極為相似，很難進(jìn)行區(qū)分[3]；瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)是出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)檢測兔黏液瘤病所采用的方法，但被檢樣品只能是全血或血清，相對局限[7]；補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)是檢測兔黏液瘤病經(jīng)典方法之一，但補(bǔ)體滴度直接影響檢測質(zhì)量且結(jié)果判定的主觀性較強(qiáng)；免疫熒光抗體試驗(yàn)是檢測兔黏液瘤病的方法之一，其敏感性高，但需要配置熒光顯微鏡[6]；血清中和試驗(yàn)驗(yàn)檢測兔黏液瘤病，要求活的病毒及細(xì)胞培養(yǎng)，要求嚴(yán)格的無菌環(huán)境，過程較長，比較麻煩；ELISA方法是檢測兔黏液瘤病常用的血清學(xué)方法，其敏感性高、操作簡便，但也僅能檢測血液樣本，無法直接檢測動物組織樣本和體液，無法在兔黏液瘤病毒感染早期進(jìn)行診斷。

鑒于血清學(xué)檢測方法的局限性，同時為了滿足口岸對大量野生、實(shí)驗(yàn)用兔及兔產(chǎn)品入境快速

檢疫的需要，本研究針對兔黏液瘤病毒基因的保守序列，建立了PCR和Real-time PCR快速核酸檢測方法，并證實(shí)PCR方法能有效擴(kuò)增兔黏液瘤病毒的特異性基因片段，未發(fā)現(xiàn)陽性樣品漏檢和陰性樣品誤檢，Real-time PCR方法檢測陽性和陰性樣品熒光信號區(qū)分顯著。將兩種檢測方法的靈敏性進(jìn)行對比，證實(shí)Real-time PCR方法的檢測下限比PCR方法提高了3個數(shù)量級，由于兔黏液瘤病毒隱性感染率較高，采用靈敏度高的檢測方法有助于提高隱性感染的檢出率，做到早發(fā)現(xiàn)、早隔離，從而盡可能降低損失，控制兔黏液瘤病的傳入及傳播。此外，與PCR方法相比，Real-time PCR方法檢測周期更短、操作更簡便，適合用于兔黏液瘤病疫情的快速高通量篩檢。

總之，本研究重新設(shè)計(jì)了兔黏液瘤病毒特異性的引物和熒光探針，并創(chuàng)新性的將PCR和Realtime PCR兩種核酸檢測方法互補(bǔ)應(yīng)用于兔黏液瘤病的檢測，這有助于縮短檢疫周期、提高陽性檢出率，降低兔黏液瘤病傳入我國的風(fēng)險。

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（責(zé)任編輯：胡藕祥）

Establishment of PCR and Real-time PCR Assays for Rapid Detection of Myxoma virus

Lin Yingzheng1，Lin Shijia1，Song Qing1，Guo Yuyan1，Bao Wenjun1，Xiong Wei1，Li Shuqing1，Wei Xiaofeng2
（1.Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shanghai 200135；2.Shanghai Laboratory Animal Research Center，Shanghai 201203）

Myxomatosis is an highly contagious and lethal disease caused by myxoma virus. In order to survey and investigate the epidemic character of myxomatosis transmission among wild and experimental rabbits，PCR and Realtime PCR assays using TaqMan probe to detect myxomatosis were established and proved to be of high specifi city and sensitivity，suitable for rapid detection of myxomatosis.

myxomatosis；PCR；Real-time PCR；TaqMan probe

S852.65+9.1；S858.291

A

1005-944X（2015）08-0072-04

上海出入境檢驗(yàn)檢疫局科研專項(xiàng)（編號HK001-2014）。