正交試驗優(yōu)化注射用左卡尼汀調(diào)配條件

吳 妍，曹教育，吳鳳芝，李 民，劉 圣，馬旖旎，唐 琪

(1.安徽省立醫(yī)院南區(qū)，安徽合肥 230036;2.安徽中醫(yī)藥大學，安徽合肥 230012)

左卡尼汀(即左旋肉堿)，又稱維生素BT，是一種廣泛存在于機體組織內(nèi)的特殊氨基酸，是動物能量代謝必需的體內(nèi)天然物質(zhì)［1］。其主要作用是運載長鏈脂酰輔酶A通過線粒體內(nèi)膜進入線粒體基質(zhì)進行 β-氧化，為脂肪酸 β-氧化必不可少的載體［2-3］。注射用左卡尼汀適用于慢性腎衰長期血透病人因繼發(fā)性肉堿缺乏產(chǎn)生的一系列并發(fā)癥狀，臨床表現(xiàn)如心肌病等。在臨床應用過程中注射用左卡尼汀溶媒選擇差異較大，包括0.9%NS、5%GS、10%GS和GNS［4-5］，為了進一步規(guī)范注射用左卡尼汀臨床應用行為，提高其成品輸液質(zhì)量，擬采用正交試驗，優(yōu)選注射用左卡尼汀最佳溶解方法，并考察左卡尼汀濃溶液與4種常用輸液配伍后成品輸液在0～8 h內(nèi)各項指標變化，判斷其在各輸液中的穩(wěn)定性，最終確定最佳調(diào)配方案，為左卡尼汀靜脈用藥調(diào)配技術(shù)提供數(shù)據(jù)支持，促進臨床合理用藥。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LC-2010A HT島津高效液相色譜儀(紫外檢測器，四元低壓泵，自動進樣器，LabSolutions Version 5.51色譜工作站);FA2004B電子天平(上海精科天美科學儀器有限公司);PHS-3C型電子pH計(上海雷磁儀器廠);GWF-5JS微粒分析儀(天河醫(yī)療儀器有限公司)，KJ-202型振蕩器(江蘇康健醫(yī)療用品有限公司)。

1.2 藥品與試劑 左卡尼汀對照品(ID:2ASVCRW9，規(guī)格400 mg，純度 99.9%，中國食品藥品檢定研究院);注射用左卡尼汀(批號14040718，規(guī)格1 g，瑞陽制藥有限公司);5%GS(批號12122098)、10%GS(批號 14041893)、GNS(批號 12080895)、0.9%NS(批號14072395)，均由安徽豐原藥業(yè)股份有限公司提供;甲醇、乙腈為色譜純，磷酸為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交試驗設計［6-7］與結(jié)果 選擇不同溶解溶媒(A)、溶媒量(B)、振蕩時間(C)、振蕩頻次(D)為考察因素，并考察溶媒類型與溶媒量(A×B)、溶媒類型與振蕩時間(A×C)、溶媒量與振蕩時間(B×C)交互作用，以濃溶液不溶性微?？倲?shù)為評價指標。采用L8(27)正交設計試驗，因素水平設計見表1，正交設計及結(jié)果見表2，交互作用結(jié)果見表3～5，方差分析結(jié)果見表6，7。

表1 因素水平表

表2 L 8(27)正交設計與結(jié)果

表3 A×B交互作用表

表4 A×C交互作用表

表5 B×C交互作用表

表6 ≥10μm不溶性微?？倲?shù)的方差分析表

表7 ≥25μm不溶性微?？倲?shù)的方差分析表

結(jié)果分析:根據(jù)影響不溶性微?！?0μm因素和水平的直觀分析、交互作用和方差分析結(jié)果，可知各影響因素的主次順序為:A×B＞B＞A×C＞D＞B×C＞A＞C，其中C因素影響較弱，作為誤差估計的來源。溶媒量、溶媒種類與溶媒量的交互作用兩個因素具有顯著作用，得出最佳調(diào)配方法為A1B1C2D2。根據(jù)影響不溶性微?！?5μm因素和水平的直觀分析、交互作用和方差分析結(jié)果，可知各影響因素的主次順序為:A×B＞B×C＞A×C＞B＞A＞C＞D，其中D因素影響較弱，作為誤差估計的來源，得出最佳調(diào)配方法為A1B1C1D2。比較兩種最佳調(diào)配方法僅C因素存在差別，因C作用不顯著，故取C1或C2均可，但從實際工作出發(fā)，取C1可相對減少調(diào)配時間，提高輸液調(diào)配效率。故最佳調(diào)配方法為A1B1C1D2，即每1 g藥粉用8 mL滅菌注射用水溶解，慢頻次振蕩1 min。

2.2 最佳調(diào)配方法驗證 按最佳調(diào)配方法，取注射用左卡尼汀1支(1 g)，加8 mL滅菌注射用水慢頻次振蕩1 min，置于取樣器上，儀器適量抽取4次，第一次數(shù)據(jù)不計，取后3次測定值，根據(jù)取樣體積與容器內(nèi)液體總體積，計算每個容器所含的微?？倲?shù)。以上操作平行進行3次，結(jié)果見表8。

表8 注射用左卡尼汀調(diào)配方法驗證試驗結(jié)果

2010版《中國藥典》規(guī)定［9］標示裝量為100 mL以下的注射用濃溶液的每個供試品容器中含10μm及10μm以上的微粒不得過6 000粒，含25μm及25μm以上的微粒不得過600粒。驗證試驗結(jié)果表明濃溶液中10μm及以上、25μm及以上的微?？倲?shù)均符合藥典標準，且微粒數(shù)較正交試驗值小，說明此最佳調(diào)配方案可行。

2.3 成品輸液的穩(wěn)定性考察

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱:Hypersil ODSC18(4.6 mm ×250 mm-5 μm)，流動相:磷酸鹽緩沖液溶液(精密稱取磷酸二氫鉀8.45 g，磷酸氫二鉀0.87 g，滅菌注射用水定容成1 000 mL，用磷酸調(diào) pH為3.0)— 甲醇65∶35;檢測波長:225 nm;流速:0.8 mL·min-1;柱溫:26℃;進樣量:20 μL。在此色譜條件下，左卡尼汀對照品溶液，4種不同的空白輸液以及4種成品輸液分別進樣，記錄色譜圖(圖1)，左卡尼汀對照品的出峰時間為4.7 min左右，理論塔板數(shù)按左卡尼汀計不低于1 200。

2.3.2 溶液的配制 對照品溶液:精密稱取左卡尼汀對照品約50 mg，置于1.5 mL離心管中，加1.0 mL流動相定容，即制成濃度為50 g·L-1的對照品貯備液。

供試品溶液:取注射用左卡尼汀(1 g)4支，均加8 mL滅菌注射用水慢頻次振蕩1 min，靜置后，分別用500 mL 5%GS、10%GS、GNS 及 0.9%NS 調(diào)配為成品輸液，即得。

2.3.3 線性關(guān)系考察 50 g·L-1的貯備液依次使用流動相稀釋，得系列質(zhì)量濃度對照品溶液(0.25、0.50、1.0、2.0 、4.0 、6.0、8.0 g·L-1)按“2.3.1”項下條件，測定峰面積，以峰面積(Y)為縱坐標，質(zhì)量濃度(X)為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程Y=204 347X+7 134.3(r=0.999 4)。結(jié)果表明，注射用左卡尼汀質(zhì)量濃度在0.25～8.0 g·L-1范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系。

2.3.4 精密度試驗 取左卡尼汀標準品溶液8.0、2.0、0.25 g·L-1三種濃度，各進樣 6 次，記錄峰面積，RSD 分別為 0.05%、0.12%、0.85%，表明該方法精密度良好。

2.3.5 回收率試驗 精密稱取適量注射用左卡尼汀共6份，分別用 5%GS、10%GS、GNS及 0.9%NS溶解成一定濃度，按“2.3.1”項下條件進樣20 μL，每種輸液平行操作6次。計算4種輸液的平均回收率分別為 101.5%、99.1%、98.37%、101.4%(n=6)，回收率較好，方法可行。

2.3.6 成品輸液左卡尼汀的含量變化 按“2.3.2”項下方法制備4種成品輸液，分別按“2.3.1”項下色譜條件于 0、2、4、6、8 h 進樣，測定峰面積，計算相對含量，結(jié)果見表9。

結(jié)果分析:在靜脈注射液中大于10%的有效成分被分解，則認為該藥品與輸液不宜配伍［8］。注射用左卡尼汀與10%GS配伍穩(wěn)定性最差，2 h含量下降近40%;與GNS配伍穩(wěn)定性也較差，6 h含量下降超過10%;與5%GS、0.9%NS配伍8 h內(nèi)穩(wěn)定含量較穩(wěn)定，適宜配伍。

表9 成品輸液中左卡尼汀的含量變化

表10 4種成品輸液0～8 h p H及外觀變化情況

2.3.7 成品輸液pH、外觀、不溶性微粒檢測 在室溫(23℃)條件下，依據(jù)2010版《中國藥典》二部附錄ⅥH pH值測定法和附錄IX R不溶性微粒檢查法分別測定空白輸液以及0、2、4、6、8 h的 4種成品輸液pH、不溶性微粒數(shù)，并觀察其外觀變化情況，結(jié)果見表 10，11。

結(jié)果分析:2010版《中國藥典》規(guī)定［9］標示裝量為100 mL或以上的靜脈用注射液，除規(guī)定外，每1 mL中含10μm及10μm以上的微粒不得過25粒，含25μm及25μm以上的微粒不得過3粒，4種成品輸液8 h內(nèi)不溶性微粒符合規(guī)定，且各成品輸液pH均在4～9范圍內(nèi)，符合靜脈用輸液要求。

表11 4種成品輸液0～8 h不溶性微粒變化情況/mL

3 討論

左卡尼汀化學名稱為(R)-3-羧基-N，N，N-三甲基-1-丙胺氫氧化物，內(nèi)鹽［10］，屬堿性物質(zhì)，因此溶于4種不同的空白輸液后，成品輸液pH均較空白輸液有不同程度升高。且依據(jù)空白輸液pH檢測結(jié)果，10%GS、GNS 的 pH 相對5%GS、0.9%NS 偏低，因此左卡尼汀在pH稍高的5%GS、0.9%NS輸液中穩(wěn)定性較好?？疾斐善份斠?～8 h不溶性微粒變化情況得知，左卡尼汀在5%GS、0.9%NS輸液中不溶性微粒(≥10μm)變化較明顯，0～2 h內(nèi)不溶性微粒(≥10μm)數(shù)較小，提示溶解完全，2 h后不溶性微粒(≥10μm)數(shù)明顯增多，該趨勢與同時間段內(nèi)左卡尼汀含量變化相符，提示臨床使用中應盡可能的現(xiàn)配現(xiàn)用。

注射用左卡尼汀說明書推薦其用于靜脈滴注的稀釋溶媒為0.9%氯化鈉或乳酸鹽林格注射液，但是對于心血管疾病患者，為了避免增加其心臟負擔［11］，臨床醫(yī)生更傾向于選用5%GS作為稀釋溶媒。因而，本實驗在成品輸液穩(wěn)定性方面，為注射用左卡尼汀臨床選用5%GS作為稀釋溶媒的可行性提供了有效佐證。

根據(jù)文獻報道［12-14］，分別比較磷酸鹽溶液(取磷酸二氫鉀8.459，磷酸氫二鉀0.879，注射用水定容成1 000 mL，磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0)—甲醇(3∶1);磷酸鹽緩沖液(取磷酸5.75 mL，加1 mol·L-1氫氧化鈉溶液50 mL，加水稀釋至1 000 mL，用飽和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié) pH至2.4)—甲醇—庚烷磺酸鈉(980 mL∶20 mL∶0.555 g);0.05 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(磷酸二氫鉀6.81 g，加水溶解并稀釋至1 000 mL，磷酸調(diào)節(jié)pH至4.3)—乙腈(35∶65)等流動相系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)選擇第一種流動相體系時，左卡尼汀峰型最好，旁無雜峰。

本實驗優(yōu)選出注射用左卡尼汀最佳調(diào)配方法，即每1 g藥粉用8 mL滅菌注射用水溶解，慢頻次振蕩1 min，溶解后的濃溶液宜使用5%GS或0.9%NS稀釋，建議臨床注射用左卡尼汀最好現(xiàn)用現(xiàn)配，并應盡可能在8 h內(nèi)使用完畢，若使用GNS稀釋，則應在4 h內(nèi)使用完畢，不可使用pH最低的10%GS稀釋。

［1］李 敏，那 寧，高建軍.左旋肉堿改善順鉑誘導腎損傷機制的相關(guān)研究［J］.安徽醫(yī)藥，2015，19(1):10-13.

［2］Li K，Sun Q.Simultaneous determination of free and total carnitine in human serum by HPLC with UV detection［J］.J Chromatogr Sci，2010，48(5):371-374.

［3］Cao Y，Wang YX，Liu CJ，et al.Comparison of pharmacokinetics of L-carnitine，acetyL-L-carnitine and propionyL-L-carnitine after single oral administration of L-carnitine in healthy volunteer［J］.Clin Invest Med，2009，32(1):E13-E19.

［4］周慧敏.左卡尼汀對缺血性心力衰竭心室重構(gòu)、心肌酶學及血脂代謝的影響［J］.中國老年學雜志，2014，34(15):4168-4169.

［5］羅 敏，陳世金.左卡尼汀注射液治療慢性心力衰竭92例療效觀察［J］.檢驗醫(yī)學與臨床，2013，10(24):3357-3358.

［6］耿魁魁，汝婷婷，唐 祺，等.注射用血塞通調(diào)配技術(shù)正交優(yōu)化及其在不同溶媒中穩(wěn)定性考察［J］.中國醫(yī)院藥學雜志，2014，34(8):660-664.

［7］杜紅芳，耿魁魁，李冬梅，等.注射用紅花黃色素與6種輸液配伍的穩(wěn)定性［J］.中成藥，2014，36(8):1635-1640.

［8］謝 軍，劉 圣，朱文君.等.苦碟子注射液與5種常用輸液及注射用鹽酸川芎嗪配伍后的穩(wěn)定性考察［J］.中成藥，2013，35(8):1788-1792.

［9］國家藥典委員會.中國藥典(二部)［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄Ⅸ C.

［10］Dabrowska M，Starek M.Analytical approaches to determination of carnitine in biological materials，foods and dietary supplements［J］.Food Chem，2014，142:220-232.

［11］侯曉平.警惕不當輸液引發(fā)的心血管系統(tǒng)醫(yī)源性損害［J］.醫(yī)學與哲學，2012，33(7):63-64.

［12］韋 敏，肖 億.反相高效液相色譜法測定左卡尼汀的血藥濃度［J］.中國新藥雜志，2006，15(20):1785-1786.

［13］付 彪，張烈云.HPLC法測定注射用左卡尼汀的含量［J］.黑龍江醫(yī)學，2010，23(5):692-693.

［14］閔翠娥，陸 媛，江少儀，等.HPLC法測定左卡尼汀注射液含量及有關(guān)物質(zhì)［J］.廣東藥學院學報，2009，25(6):588-591.