一株高效防治甜菜夜蛾的萊氏野村菌的篩選

鐘萬(wàn)芳，李雪萍，郭慧芳*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，南京 210014;2.云南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，昆明 650091)

甜菜夜蛾 Spodoptera exigua 屬鱗翅目Lepidoptera 夜蛾科Nocruidae，是世界性分布、間歇性大發(fā)生的、以危害蔬菜為主的雜食性害蟲(chóng)。甜菜夜蛾寄主范圍很廣，主要危害茄子、黃瓜、豇豆、花椰菜等35 科108 屬170 余種植物。由于該蟲(chóng)對(duì)化學(xué)農(nóng)藥抗藥性的不斷增強(qiáng)，近年來(lái)在我國(guó)南方發(fā)生有加重趨勢(shì)(文禮章等，2014)。真菌是唯一能在自然條件下通過(guò)體壁接觸侵染昆蟲(chóng)的病原微生物。在害蟲(chóng)防治過(guò)程中，蟲(chóng)生真菌是替代傳統(tǒng)農(nóng)藥的最佳選擇，這是因?yàn)橄x(chóng)生真菌對(duì)人、畜、植物及環(huán)境安全，并能在適宜的環(huán)境條件下引起流行病，在自然調(diào)節(jié)昆蟲(chóng)種群過(guò)程中起著重要作用(Ali et al.，2010)。萊氏野村菌Nomuraea rileyi 屬于半知菌亞門(mén)絲孢綱Hyphomycetes 叢梗孢目Miniliales 野村菌屬Nomuraea 是一種世界性廣泛分布的重要蟲(chóng)生真菌。其可以侵染30 多種鱗翅目害蟲(chóng)，尤其是對(duì)夜蛾科害蟲(chóng)，如斜紋夜蛾Spodoptera litura、甜菜夜蛾、粉紋夜蛾Trichoplusia ni、煙青蟲(chóng)Helicoverpa assulta、棉鈴蟲(chóng)H.armigera等的致病力強(qiáng)，在自然界常常引發(fā)高強(qiáng)度的昆蟲(chóng)流行病，故受到各國(guó)科學(xué)工作者的重視(Srisukchayakul ＆ Pantuwatana，2005;Perinotto et al.，2012;Song et al.，2013)。和昆蟲(chóng)病毒、細(xì)菌必須攝入到昆蟲(chóng)體內(nèi)不同，真菌可直接通過(guò)產(chǎn)生附著孢等特殊結(jié)構(gòu)從害蟲(chóng)體壁侵入，在此期間會(huì)分泌蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、脂肪酶等多種酶(Santi et al.，2010)。在侵入后，菌絲體會(huì)利用昆蟲(chóng)體液進(jìn)行生長(zhǎng)、繁殖，同時(shí)產(chǎn)生的毒素及代謝物會(huì)干擾和破壞害蟲(chóng)的生理機(jī)能，最終導(dǎo)致害蟲(chóng)死亡(Schrank ＆ Vainstein，2010)。

我們從南京六合大豆田罹病斜紋夜蛾幼蟲(chóng)蟲(chóng)體上分離獲得一株萊氏野村菌新菌株，測(cè)定了其對(duì)甜菜夜蛾的毒力，以期為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用該菌開(kāi)展生物防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株、培養(yǎng)基與昆蟲(chóng)

實(shí)驗(yàn)用萊氏野村菌菌株于2013年9月在江蘇省南京市六合大豆田罹病斜紋夜蛾幼蟲(chóng)蟲(chóng)體上分離得到。培養(yǎng)基選用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)。供試甜菜夜蛾幼蟲(chóng)為本實(shí)驗(yàn)室利用人工飼料飼養(yǎng)多年的室內(nèi)種群。養(yǎng)蟲(chóng)條件為26℃，相對(duì)濕度75%，光照時(shí)間14 h。

1.2 試劑

基因組DNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取DNA 為Promega 公司產(chǎn)品，瓊脂糖凝膠回收試劑盒為Omega Biotek 公司產(chǎn)品，pEASY T3 為T(mén)ransgen 公司產(chǎn)品，LA Taq 聚合酶為T(mén)AKARA 公司產(chǎn)品，X-gal、IPTG、氨芐青霉素等為BBI 公司產(chǎn)品，其他常用試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 菌株DNA 的提取及鑒定

將PDA 培養(yǎng)基培養(yǎng)好的萊氏野村菌分生孢子接種于液體培養(yǎng)基中，180 rpm，26℃，振蕩培養(yǎng)72 h，將菌液轉(zhuǎn)移至50 mL 無(wú)菌離心管中，10000 rpm離心10 min，收集菌體，依據(jù)基因組DNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取DNA。

1.4 菌株的ITS 鑒定

采用真菌核糖體rDNA 區(qū)通用引物ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')擴(kuò)增ITS1-5.8S-ITS2 rDNA 全序列及部分18S 和28S rDNA 序列。引物由上海生工合成。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性4 min;94℃變性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸60 s，共35 個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，目的片段經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收純化后，克隆到pEASY T3載體中，陽(yáng)性克隆由南京金斯瑞公司測(cè)序。

1.5 菌株的擴(kuò)繁及孢子計(jì)數(shù)

將萊氏野村菌接種在PDA 培養(yǎng)基上在人工氣候箱26℃下培養(yǎng)10 d 供試驗(yàn)用。分生孢子液的制備:將分生孢子粉刮到一個(gè)三角瓶中，加入10 mL的0.05%吐溫-80 及少量的玻璃珠，充分振蕩后過(guò)濾，除去菌絲和雜質(zhì)。利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法，把分生孢子按照10×稀釋法配成不同的濃度。

1.6 甜菜夜蛾幼蟲(chóng)接種感染方法

采用浸漬法接種甜菜夜蛾幼蟲(chóng)。用鑷子將甜菜夜蛾3 齡幼蟲(chóng)放入待測(cè)萊氏野村菌分生孢子液中浸5 s，然后移入盛有人工飼料的六孔板中，每孔放置5 頭，每處理120 頭，重復(fù)4 次，以0.05%吐溫-80 作為對(duì)照，連續(xù)觀(guān)察8 d，記錄死亡數(shù)。實(shí)驗(yàn)條件為26℃，光照時(shí)間14 h，施藥后第一天相對(duì)濕度90%，之后為75%。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用幾率值分析法，將蟲(chóng)體死亡率進(jìn)行幾率值轉(zhuǎn)換后用DPS 進(jìn)行顯著性測(cè)驗(yàn)，并分別對(duì)劑量和時(shí)間作線(xiàn)性回歸分析建立直線(xiàn)回歸模型，分別估計(jì)劑量效應(yīng)LC50和時(shí)間效應(yīng)LT50。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的ITS 鑒定

電泳結(jié)果在凝膠成像系統(tǒng)上觀(guān)察、拍照，供試菌株目的片段長(zhǎng)度約為600 bp (圖1)。測(cè)序結(jié)果顯示其長(zhǎng)度為619 bp，其中31-182 bp、183-370 bp、371-561 bp 分別為ITS1、5.8S rRNA、ITS2。BLAST 分析發(fā)現(xiàn)其與萊氏野村菌的同源性高達(dá)99%，結(jié)合形態(tài)特征觀(guān)察，確定其為萊氏野村菌Nomuraea rileyi。圖2 為測(cè)序結(jié)果(GenBank登錄號(hào)為KM396227)。

圖1 真菌鑒定電泳圖片F(xiàn)ig.1 Electrophoresis of amplified DNA fragment

2.2 萊氏野村菌對(duì)甜菜夜蛾幼蟲(chóng)的毒力

由表1 可知，第3 天出現(xiàn)少量死亡的甜菜夜蛾幼蟲(chóng)，孢子濃度為2.25×107個(gè)孢子/mL 和2.25×108個(gè)孢子/mL 時(shí)對(duì)幼蟲(chóng)的感染效果較好，第3 天就有幼蟲(chóng)死亡，5-8 d 的死亡率分別為76.67%、85.83%，87.50%、94.17%，93.33%、96.67%，97.5%、100%。孢子濃度為2.25×104個(gè)孢子/mL 的萊氏野村菌對(duì)甜菜夜蛾的感染效果較差，直到第5 天幼蟲(chóng)才開(kāi)始死亡，而且到第8 天死亡率也不超過(guò)50%。

表2 和表3 表明，該菌對(duì)甜菜夜蛾幼蟲(chóng)有較高的殺蟲(chóng)活性，第5-8 天的LC50由3.6488×106降低到6.2180×104，而且差異顯著，LC95也從6.6605×108降低到1.2714×106。在2.25×105-2.25×108個(gè)孢子/mL 濃度下的LT50隨著濃度增加而逐漸縮短，即由7.4165 縮短到4.3292 d。

圖2 萊氏野村菌ITS 及5.8S rRNA 序列Fig.2 The ITS and 5.8S ribosomal RNA sequences of Nomuraea rileyi

表1 萊氏野村菌分生孢子液對(duì)甜菜夜蛾3 齡幼蟲(chóng)的感染死亡率Table 1 Toxicity of Nomuraea rileyi to 3rd instar larvare of Spodoptera exigua

表2 萊氏野村菌分生孢子對(duì)甜菜夜蛾3 齡幼蟲(chóng)的致死中時(shí)Table 2 Median lethal time of Nomuraea rileyi to 3rd instar larvare of Spodoptera exigua

表3 萊氏野村菌分生孢子對(duì)甜菜夜蛾3 齡幼蟲(chóng)的致死中濃度Table 3 Median lethal concentration of Nomuraea rileyi to 3rd instar larvare of Spodoptera exigua

3 結(jié)論與討論

在害蟲(chóng)防治中利用生物防治技術(shù)，可降低化學(xué)農(nóng)藥的使用量，減輕對(duì)環(huán)境的污染，保護(hù)利用天敵，促進(jìn)自然抑制能力的發(fā)揮而降低蟲(chóng)口密度。目前使用的甜菜夜蛾的生物防治制劑包括蘇云金芽孢桿菌、甜菜夜蛾核型多角體病毒等(呂善運(yùn)等1997;郭慧芳等2003)，而真菌殺蟲(chóng)劑使用報(bào)道尚少，仍然處于研究階段。本研究利用萊氏野村菌對(duì)甜菜夜蛾3 齡幼蟲(chóng)進(jìn)行致病性測(cè)定，對(duì)其最高死亡率達(dá)100%，致死中濃度為6.2180×104個(gè)孢子/mL，當(dāng)孢子濃度為2.25×108個(gè)孢子/mL 致死中時(shí)為4.3292 d。周立峰等(2012)測(cè)定的5 株萊氏野村菌對(duì)甜菜夜蛾的毒力偏低 (死亡率都未超過(guò)50%)，無(wú)法滿(mǎn)足應(yīng)用。朱春燕等(2011)測(cè)定的萊氏野村菌對(duì)甜菜夜蛾的LC50為2.43×105個(gè)孢子/mL，比本研究略高。因此，本研究獲得的萊氏野村菌具有較大的應(yīng)用前景。

真菌對(duì)害蟲(chóng)的寄生必須有一個(gè)最小數(shù)量的入侵單位與寄主接觸，才能誘發(fā)疾病。如果低于這個(gè)數(shù)量，寄主就不能染病或者發(fā)病極低，起不到防治作用(包建中和古德祥，1998)。本研究中的萊氏野村菌在濃度為2.25×104個(gè)孢子/mL 時(shí)對(duì)甜菜夜蛾3 齡幼蟲(chóng)的毒力偏低，甜菜夜蛾第8 天的死亡率僅為43.33%，即便第14 天死亡率也未超過(guò)50% (未發(fā)表數(shù)據(jù))。萊氏野村菌處理的甜菜夜蛾3 齡幼蟲(chóng) LC50、LC95分別為2.1721×105、9.5152×107，田間防治的防效一般應(yīng)在80% 以上，因此，萊氏野村菌用于甜菜夜蛾的防治濃度應(yīng)在1×106以上。

本研究致病力試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，甜菜夜蛾被萊氏野村菌菌株侵染后蟲(chóng)體發(fā)硬，初期在僵蟲(chóng)上產(chǎn)生白色菌絲，后期產(chǎn)生大量綠色的分生孢子。應(yīng)當(dāng)指出，上述萊氏野村菌處理前3 天，甜菜夜蛾幼蟲(chóng)的死亡率都很低，4 d 后防治效果明顯提高。提高萊氏野村菌的殺蟲(chóng)速度是突破制約其廣泛應(yīng)用的一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。

隨著對(duì)食品安全問(wèn)題的日益關(guān)注，國(guó)內(nèi)外越來(lái)越重視害蟲(chóng)綜合治理(IPM)，主張以生物防治作為綜合防治的重要要素之一，而使用微生物農(nóng)藥是生物防治的手段。在各種殺蟲(chóng)微生物中，真菌因能持續(xù)控制害蟲(chóng)種群數(shù)量、生物安全性高、易于人工培養(yǎng)、生產(chǎn)成本較低等優(yōu)點(diǎn)而在害蟲(chóng)種群控制方面具備很大的發(fā)展?jié)摿?，必將?1 世紀(jì)可持續(xù)發(fā)展的環(huán)境友好型的理想農(nóng)藥。

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