高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定參術(shù)止帶糖漿中4個(gè)有效成分

馬靈珍， 何勝利， 張 贇， 凌 今

（1.亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院，安徽 亳州 236800；2.遂成藥業(yè)股份有限公司，河南 新鄭 451150；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海200032；4.復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院，上海201203；5.浙江金華廣福醫(yī)院，浙江金華321001）

高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定參術(shù)止帶糖漿中4個(gè)有效成分

馬靈珍1， 何勝利2， 張 贇3*， 凌 今4，5

（1.亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院，安徽 亳州 236800；2.遂成藥業(yè)股份有限公司，河南 新鄭 451150；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海200032；4.復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院，上海201203；5.浙江金華廣福醫(yī)院，浙江金華321001）

目的 建立高效液相色譜法測(cè)定參術(shù)止帶糖漿 （山藥、車前子、黨參、蒼術(shù)、陳皮等）中尿囊素、薯蕷皂苷元、京尼平苷酸、毛蕊花糖苷4個(gè)有效成分的含有量。方法 參術(shù)止帶糖漿70%甲醇提取液分析采用依利特C18色譜柱 （4.6 mm×200 mm，5μm）；以甲醇-乙腈 （3：2）與0.5%冰醋酸溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫；體積流量為0.9 m L/m in；柱溫為室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)分別為224 nm（尿囊素）、210 nm（薯蕷皂苷元）和254 nm（京尼平苷酸和毛蕊花糖苷）。結(jié)果 尿囊素在0.085 4～1.708 0μg（r=0.999 8）、薯蕷皂苷元在0.010 6～0.212 0μg（r=0.999 2）、京尼平苷酸在0.095 8～1.916 0μg（r=0.999 5）、毛蕊花糖苷在0.145 2～2.904 0μg（r=0.999 7）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；平均加樣回收率 （n=6）分別為98.4%、97.5%、97.9%、98.6%，RSD為0.69%～1.1%。結(jié)論 暫定本品每1 mL含山藥以尿囊素計(jì)不得低于0.35 mg，以薯蕷皂苷元計(jì)不得低于0.040 mg；含車前子以京尼平苷酸計(jì)不得低于0.38mg，以毛蕊花糖苷計(jì)不得低于0.60mg。

參術(shù)止帶糖漿；尿囊素；薯蕷皂苷元；京尼平苷酸；毛蕊花糖苷；高效液相色譜

參術(shù)止帶糖漿是由山藥、車前子、黨參、蒼術(shù)、陳皮、白術(shù)、白芍、荊芥、柴胡、甘草十味藥物組成的中藥復(fù)方制劑，收載于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第二十冊(cè)，具有補(bǔ)中健脾、疏肝解郁、化濕止帶等功效，可用于臨床上脾虛濕盛、肝郁氣滯之帶下癥等癥的治療［1-2］。原標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)處方中的陳皮薄層鑒別和正丁醇提取物進(jìn)行了控制，沒有對(duì)該制劑進(jìn)行定量測(cè)定研究，無法有效地控制產(chǎn)品的質(zhì)量和有效性。同時(shí)尿囊素和薯蕷皂苷元為山藥的主要成分和可測(cè)定成分［3-4］，京尼平苷酸和毛蕊花糖苷為車前子的主要成分和可測(cè)定成分［5］。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相梯度洗脫法測(cè)定該制劑中尿囊素、薯蕷皂苷元、京尼平苷酸、毛蕊花糖苷，為提高參術(shù)止帶糖漿質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 安捷倫1200高效液相色譜儀 （包括G1322A脫氣機(jī)、G1311A四元泵、G1329A自動(dòng)進(jìn)樣器、Chemstation色譜工作站、G1315B可變波長(zhǎng)檢測(cè)器）。

1.2 試藥 對(duì)照品尿囊素 （批號(hào)111501-200202，置五氧化二磷減壓干燥器中干燥12 h以上使用）、薯蕷皂苷元 （批號(hào)111539-200001，置五氧化二磷減壓干燥器中干燥12 h后使用）、京尼平苷酸 （批號(hào)111828-201102，純度96.0%）和毛蕊花糖苷（批號(hào)111530-201310，純度93.3%）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。參術(shù)止帶糖漿 （每瓶裝210 m L，批 號(hào) 分 別 為 131201、131202、131203、131204、 131205、 131206、 131207、 131208、131209、131210）購(gòu)于陜西中醫(yī)學(xué)院制藥廠；分析純冰醋酸，購(gòu)于上海埃彼化學(xué)試劑有限公司；色譜純甲醇，購(gòu)于天津市康科德科技有限公司。

2 試驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 采用依利特 C18色譜柱 （4.6 mm×200 mm，5μm）；體積流量為0.9 mL/min；甲醇-乙腈 （3：2）作為流動(dòng)相A，0.5%冰醋酸溶液作為流動(dòng)相B，按比例進(jìn)行梯度洗脫 （0～10 min，10.0%A；10～23 min，10.0%→22.0%A；23～40 min，22.0%→38.0%A）［6-12］；檢測(cè)波長(zhǎng)（0～15 min，λ1=224 nm［13-14］；15～23 min，λ2= 210 nm［4］；23～40 min，λ3=254 nm［15］）。在上述

色譜條件下，待測(cè)成分峰與相鄰峰的分離度大于2.0，理論塔板數(shù)均大于2 500。

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備方法 精密稱取對(duì)照品尿囊素8.54 mg、薯蕷皂苷元10.60 mg、京尼平苷酸9.58 mg和毛蕊花糖苷14.52 mg，分別置于20 m L的量瓶中，加入70%甲醇振搖溶解后稀釋到刻度，上述溶液作為參術(shù)止帶糖漿檢測(cè)用對(duì)照品貯備液。然后分別精密量取各對(duì)照品貯備液10.0、1.0、10.0、10.0 mL，置于同一個(gè)50 mL量瓶中，加70%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得尿囊素0.085 4 mg/mL、薯蕷皂苷元0.010 6 mg/mL、京尼平苷酸0.095 8 mg/mL、毛蕊花糖苷0.145 2 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備方法 精密量取參術(shù)止帶糖漿10mL，置于50mL量瓶中，加入70%甲醇振搖溶解后稀釋到刻度，搖勻，0.45μm微孔濾膜過濾，接取續(xù)濾液，作為參術(shù)止帶糖漿檢測(cè)用供試品溶液。

2.4 陰性對(duì)照試驗(yàn) 嚴(yán)格按照參術(shù)止帶糖漿質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的處方和生產(chǎn)工藝，制備山藥陰性樣品和車前子陰性樣品，按照 “2.3”項(xiàng)下供試品溶液的配制方法制備各陰性樣品溶液。分別精密吸取上述制備的 “2.3”項(xiàng)下供試品溶液、“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液以及上述兩個(gè)陰性對(duì)照溶液各10μL，依法進(jìn)行測(cè)定，參術(shù)止帶糖漿中尿囊素、薯蕷皂苷元、京尼平苷酸和毛蕊花糖苷對(duì)照品與其他組分均能達(dá)到基線分離，陰性對(duì)照溶液色譜圖在對(duì)照品相應(yīng)位置處無吸收峰，見圖1。

圖1 尿囊素、薯蕷皂苷元、京尼平苷酸和毛蕊花糖苷的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatogram s of aIIantoin，diosgenin，geniposidic acid and verbascoside

2.5 線性關(guān)系考察 精密稱取尿囊素、薯蕷皂苷元、京尼平苷酸和毛蕊花糖苷對(duì)照品各適量，加入70%甲醇分別制成0.854 mg/mL、0.106 mg/mL、0.958 mg/mL、1.452 mg/mL的對(duì)照液。分別精密吸取上述各對(duì)照液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mL至10 m L量瓶中，用70%甲醇稀釋制成系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照液，精密吸取各質(zhì)量濃度混合對(duì)照液10.0μL，注入色譜儀中，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積Y對(duì)進(jìn)樣量X擬合，得回歸方程為尿囊素Y=2.354 9×106X-367.2，r=0.999 8；薯蕷皂苷元Y=1.756 1×106X+201.4，r=0.999 2；京尼平苷酸Y=2.825 1×106X+412.4，r=0.999 5；毛蕊花糖苷Y=2.349 2×106X+351.9，r=0.999 7。尿囊素、薯蕷皂苷元、京尼平苷酸和毛蕊花糖苷分別在0.085 4～1.708 0μg、0.010 6～0.212 0μg、0.095 8～1.916 0μg、0.145 2～2.904 0μg范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取 “2.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液（尿囊素0.085 4 mg/mL、薯蕷皂苷元0.010 6 mg/mL、京尼平苷酸0.095 8 mg/m L、毛蕊花糖苷0.145 2 mg/mL），連續(xù)進(jìn)樣6次測(cè)定，記錄尿囊素、薯蕷皂苷元、京尼平苷酸和毛蕊花糖苷的峰面積，尿囊素、薯蕷皂苷元、京尼平苷酸和毛蕊花糖苷的RSD分別為0.49%、0.92%、

0.63%和0.47%。結(jié)果表明，該儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一個(gè)批號(hào) （批號(hào)為131201）的參術(shù)止帶糖漿6份，平行制備6份供試品溶液進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算，求得尿囊素、薯蕷皂苷元、京尼平苷酸和毛蕊花糖苷的 RSD均小于1.0%。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一個(gè)批號(hào) （批號(hào)為131201）的參術(shù)止帶糖漿制備的供試品溶液，分別在室溫下放置0、2、4、8、12、24 h后，每次進(jìn)樣10μL，測(cè)定其峰面積值，求得尿囊素、薯蕷皂苷元、京尼平苷酸和毛蕊花糖苷的RSD分別為0.38%、0.76%、0.54%和0.29%。結(jié)果表明，參術(shù)止帶糖漿室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 加樣回收試驗(yàn) 精密量取已知成分含有量（尿囊素為0.426 mg/m L，薯蕷皂苷元為0.054 mg/mL，京尼平苷酸為0.482 mg/mL，毛蕊花糖苷為0.728 mg/mL）的同一批號(hào)參術(shù)止帶糖漿共9份，5.0 mL/份，分別置于9個(gè)50 mL的量瓶中，精密吸取20 mL、25 mL、30 m L“2.2”項(xiàng)下配制的混合對(duì)照品溶液各3份，然后70%甲醇分別稀釋至刻度，搖勻，0.45μm微孔濾膜過濾，即得加樣供試液，按上述方法進(jìn)樣測(cè)定，分別計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

2.10 樣品測(cè)定 取10個(gè)批次的參術(shù)止帶糖漿，按 “2.3”項(xiàng)下供試品制備方法，按 “2.1”項(xiàng)下色譜條件，精密吸取供試品溶液和 “2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液各10μL，按外標(biāo)法測(cè)定本品中尿囊素、薯蕷皂苷元、京尼平苷酸和毛蕊花糖苷含有量，所測(cè)結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇 分別以甲醇-水［3，7］、甲醇-磷酸二氫鉀水溶液［8］、甲醇-0.5%冰醋酸溶液［9］、甲醇-乙腈 （3：2）與0.5%冰醋酸溶液［10］為流動(dòng)相不同比例進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)果以甲醇-水、甲醇-磷酸二氫鉀水溶液為流動(dòng)相梯度洗脫時(shí)尿囊素和薯蕷皂苷元分離效果良好，而京尼平苷酸和毛蕊花糖苷未達(dá)到基線分離；以甲醇-0.5%冰醋酸溶液為流動(dòng)相梯度洗脫時(shí)京尼平苷酸和毛蕊花糖苷與其他色譜峰能達(dá)到基線分離，但尿囊素和薯蕷皂苷元拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重。而甲醇-乙腈 （3：2）與0.5%冰醋酸溶液為流動(dòng)相按照文中比例梯度洗脫時(shí)4組分均能達(dá)到基線分離。故選用甲醇-乙腈 （3：2）與0.5%冰醋酸溶液按照本實(shí)驗(yàn)中比例為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。

表1 尿囊素、薯蕷皂苷元、京尼平苷酸和毛蕊花糖苷回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Resu Its of recovery tests for aIIantoin，diosgenin，geniposidic acid and verbascoside

表2 樣品含有量測(cè)定結(jié)果（mg/m L）Tab.2 Resu Its of content determ ination of samp Ies（mg/m L）

3.2 各成分含有量限度的確定 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的各成分含有量的平均值，結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)情況，取所測(cè)平均值的80%作為制劑中各成分的暫定含有量，即暫定本品每1 mL含山藥以尿囊素計(jì)不得低于0.35 mg，以薯蕷皂苷元計(jì)不得低于0.040 mg；含車前子以京尼平苷酸計(jì)不得低于0.38 mg，以毛蕊花糖苷計(jì)不得低于0.60 mg。

［1］ 國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn) （中藥成方制劑）：第二十冊(cè)［S］. 1998：155.

［2］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：2010年版一部［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：27，63，附錄30，附錄36.

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Sim u Itaneous determ ination of four active ingredients in Shenzhu Zhidai Syrup by HPLC

MA Ling-zhen1， HE Sheng-li2， ZHANG Yun3*， LIN Jin4，5

（1.School of Pharmacy，Bozhou Vocational and TechnicalGollege，Bozhou 236800，Ghina；2.Suicheng PharmaceuticalGo.，Ltd，Xinzheng 451150，Ghina；3.Longhua Hospital Affiliated to ShanghaiUniversity of Traditional GhineseMedicine，Shanghai200032，Ghina；4.School of Pharmacy，F(xiàn)udan University，Shanghai201203，Ghina；5.Guangfu Hospital，Jinhua 321001，Ghina）

AIM To develop a high-performance liquid chromatography（HPLC）method for simultaneously determining the contents of four main ingredients（allantoin，diosgenin，geniposidic acid and verbascoside）in Shenzhu Zhidai Syrup（Dioscoreae Rhizoma，Plantaginis Semen，Godonopsis Radix，Atractylodis Rhizoma，Gitri reticulatae Pericarpium，etc.）.METHODS A Hypersil C18column was used for chromatographic separation of 70%methanolic extractof Shenzhu ZhidaiSyrup.Themobile phase consisted ofmethanol-acetonitrile（3：2）and 0.5%glacial acetic acid solution in a gradient elution manner，with the column maintained at room temperature，the flow rate at0.9 mL/min，and the detection wavelengths were set at 224 nm for allantoin，210 nm for diosgenin，and 254 nm for geniposidic acid and verbascoside.RESULTS There were good linear relationships among allantoin，diosgenin，geniposidic acid and verbascoside，and the peak area values with their concentrations kept within the ranges of 0.085 4-1.708 0μg（r=0.999 8），0.010 6-0.212 0μg（r=0.999 2），0.095 8-1.916 0μg（r=0.999 5）and 0.145 2-2.904 0μg（r=0.999 7），respectively.The average recoveries were 98.4%，97.5%，97.9%and 98.6%，respectively，with RSD of0.69%-1.1%.CONCLUSIONS The tentative standard for each 1 mL is fixed at least no less than 0.35 mg allantoin and 0.040 mg diesgenin of Dioscoreae Rhizoma，0.38 mg geniposidie acid and 0.60 mg verbascoside of Plantaginis Semen.

Shenzhu Zhidai Syrup；allantoin；diosgenin；geniposidic acid；verbascoside；HPLC

R927.2

A

1001-1528（2015）11-2422-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.018

2014-12-16

安徽省高等學(xué)校教學(xué)質(zhì)量與教學(xué)改革工程實(shí)測(cè)中心建設(shè)項(xiàng)目 （20101460）

馬靈珍 （1982—），男，碩士，講師，主要從事中藥生產(chǎn)與質(zhì)量控制研究教學(xué)工作。Tel：15905677087，E-mail：hhjj-0000 @163.com

*通信作者：張 贇 （1986—），女，藥師，從事中西藥臨床合理用藥工作。E-mail：hhjj_0000@163.com