微生物修復(fù)石油污染土壤的生態(tài)毒性指示

沈偉航，朱能武,，尹富華，王華金，黨志,

1. 華南理工大學(xué)環(huán)境與能源學(xué)院，廣東 廣州 510006；2. 工業(yè)聚集區(qū)污染控制與生態(tài)修復(fù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006

微生物修復(fù)石油污染土壤的生態(tài)毒性指示

沈偉航1，朱能武1,2*，尹富華1，王華金1，黨志1,2

1. 華南理工大學(xué)環(huán)境與能源學(xué)院，廣東 廣州 510006；2. 工業(yè)聚集區(qū)污染控制與生態(tài)修復(fù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006

發(fā)光菌的相對(duì)發(fā)光度和植物光合色素含量以及土壤酶活性是土壤石油污染程度和生態(tài)毒性強(qiáng)弱的綜合反映。為探究不同生物指示方法對(duì)石油污染土壤生態(tài)毒性的指示效果以及污染土壤在生物修復(fù)過程中毒性的變化規(guī)律，采用前期篩選分離的三株對(duì)石油烴具有良好降解效果的降解菌構(gòu)建混合菌體系，開展石油污染土壤模擬微生物修復(fù)實(shí)驗(yàn)。文章首先以明亮發(fā)光桿菌為指示生物考察不同修復(fù)時(shí)期土壤生態(tài)毒性，并以高等植物毒性試驗(yàn)以及土壤酶活性試驗(yàn)結(jié)果作為輔助證據(jù)從生態(tài)學(xué)角度揭示修復(fù)過程中石油污染土壤生態(tài)毒性的變化，并分析了以上3種指示方法的一致性。結(jié)果表明，該混合菌能高效降解對(duì)石油烴污染物，污染土壤經(jīng)40 d修復(fù)后，石油烴污染物濃度從5 000 mg·kg-1降到1 781 mg·kg-1，去除率達(dá)到64%。高等植物生態(tài)毒性試驗(yàn)、土壤酶活性試驗(yàn)與發(fā)光菌生態(tài)毒性試驗(yàn)結(jié)果呈現(xiàn)良好的一致性，石油污染土壤的生態(tài)毒性隨著微生物修復(fù)過程的進(jìn)行呈先上升后下降的趨勢(shì)。具體而言，修復(fù)初期的土樣對(duì)小麥光合色素含量的抑制作用最大，葉綠素a含量相對(duì)于對(duì)照組降低了39.3%，僅為(1.36±0.04) mg·g-1；土壤過氧化氫酶酶活性與石油烴殘留量呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（-0.973）；污染土壤生態(tài)毒性在修復(fù)的第8天達(dá)到最大，其二氯甲烷/二甲基亞砜浸提液中發(fā)光菌的相對(duì)發(fā)光度為18.1%，與0.187 mg·L-1HgCl2的毒性相當(dāng)。明亮發(fā)光桿菌的相對(duì)發(fā)光度和小麥光合色素含量以及土壤過氧化氫酶活性能較好地指示石油污染土壤在生物修復(fù)過程中的生態(tài)毒性，可作為石油污染土壤微生物修復(fù)效果的指示生物。

石油污染土壤；生物修復(fù)；發(fā)光菌；生物指示

石油工業(yè)的迅猛發(fā)展使得石油污染物對(duì)土壤的污染狀況日趨嚴(yán)重。石油污染物（烷烴類、芳香烴類以及苯類等）毒性大且具有致癌作用，進(jìn)入土壤后難以去除，并會(huì)引發(fā)土壤性質(zhì)變化甚至地下水污染等重大生態(tài)危機(jī)，如何有效地修復(fù)石油污染土壤已成為全球性的環(huán)境難題（黃廷林等，2009）。在眾多修復(fù)方法中，石油污染土壤的微生物修復(fù)以其對(duì)土壤環(huán)境干擾小、成本低廉、無二次污染等優(yōu)點(diǎn)，正逐步成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者的一個(gè)研究熱點(diǎn)（王華金等，2013）。然而，要成功運(yùn)作石油污染土壤微生物修復(fù)仍面臨諸多難題。研究表明，恢復(fù)污染土壤的原有生態(tài)功能是一個(gè)緩慢且復(fù)雜的過程（宋玉芳等，2004）。隨著微生物修復(fù)過程的進(jìn)行，污染土壤逐步向健康狀態(tài)轉(zhuǎn)變，并伴隨著土壤及微生物一系列生理生化指標(biāo)的變化。對(duì)石油污染土壤的微生物修復(fù)過程及此過程中土壤健康狀況的監(jiān)測(cè)、指示以及生態(tài)毒理學(xué)研究有助于全面掌握石油污染土壤微生物修復(fù)過程中生態(tài)毒性的強(qiáng)弱及變化規(guī)律。

已有研究表明，土壤生態(tài)系統(tǒng)中的敏感指示物能夠較為全面地反映土壤生態(tài)毒性（劉五星等，2007）。針對(duì)石油污染土壤生態(tài)毒性的指示和評(píng)價(jià)系統(tǒng)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者提出了包括發(fā)光菌毒性試驗(yàn)、高等植物毒性試驗(yàn)和土壤酶活性試驗(yàn)在內(nèi)的多種生態(tài)毒性試驗(yàn)方法。在這些生態(tài)毒性指示方法中，發(fā)光細(xì)菌生態(tài)毒性試驗(yàn)以其相關(guān)性好，靈敏性高、監(jiān)測(cè)效率高等優(yōu)點(diǎn)而被國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛應(yīng)用于石油污染土壤修復(fù)過程中土壤生態(tài)毒性的評(píng)價(jià)與監(jiān)測(cè)（林志芬等，2001）。有學(xué)者采用發(fā)光細(xì)菌生態(tài)毒性性試驗(yàn)來評(píng)價(jià)生物堆肥 16個(gè)月之后的石油污染土壤的生態(tài)毒性，土壤毒性的最大值出現(xiàn)在堆肥的初期，隨著堆肥過程的進(jìn)行，土壤生態(tài)毒性呈減弱趨勢(shì)，但仍有較高的生態(tài)毒性（Chaineau et al.，2003）。有研究通過發(fā)光細(xì)菌生態(tài)毒性試驗(yàn)研究?jī)煞N不同堆肥條件下的石油污染土壤發(fā)現(xiàn)，自然條件下堆肥處理的生態(tài)毒性最高可達(dá)到人工強(qiáng)化堆肥的4倍（P?aza et al.，2005）。高等植物作為土壤生態(tài)系統(tǒng)中的基本組成部分，利用其生長(zhǎng)發(fā)育狀況及葉片生理生化指標(biāo)來指示土壤生態(tài)毒性是土壤污染生態(tài)毒理學(xué)診斷的重要組成部分。Banks et al.（2005）以萵苣、粟、蘿卜、紅三葉草和小麥的種子發(fā)芽率為指標(biāo)，考察它們作為供試植物的可行性，結(jié)果表明，僅萵苣種子能準(zhǔn)確地指示受污土壤和凈土之間生態(tài)毒性的差異。土壤酶活性作為土壤微生物新陳代謝是否正常的關(guān)鍵性指標(biāo)，是土壤整體健康狀況的綜合反映（張曉陽(yáng)，2013），將土壤酶活性作為土壤生態(tài)毒性的指示物，也具有理論上的可行性。研究表明，在柴油污染土壤的生物修復(fù)過程中土壤脂肪酶和脫氫酶與石油烴殘留量呈顯著負(fù)相關(guān)，而β葡萄糖苷活性與土壤中石油烴殘留量呈顯著正相關(guān)（Riffaldi et al.，2006）。

雖然上述方法在生態(tài)毒性指示方面各有優(yōu)勢(shì)，但是涉及不同指示方法的指示效果研究以及它們之間的一致性分析還比較少。由于通過不同指示生物對(duì)土壤生態(tài)毒性進(jìn)行指示和評(píng)價(jià)能夠有效地整合土壤中不同食物鏈生物對(duì)有毒有害物質(zhì)的整體毒性效應(yīng)，可以較為全面地反映土壤的受污情況。因此，石油污染土壤微生物修復(fù)過程需要整合各種生態(tài)毒性指示和評(píng)價(jià)方法對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)的安全性做出全面、科學(xué)地判斷。課題組前期研究表明，土壤過氧化氫酶活性與土壤中的殘留石油烴相關(guān)系數(shù)最大（王華金等，2013）；小麥與蘿卜相對(duì)于萵苣、黑麥草以及小青菜更適合作為供試植物來指示石油污染土壤的生態(tài)毒性變化（沈偉航等，2015）。然而前期研究并未涉及石油污染土壤的復(fù)合指示效果研究以及不同指示方法之間的一致性分析?；诖?，本研究選取明亮發(fā)光桿菌，土壤過氧化氫酶活性以及小麥和蘿卜的葉片光合色素毒性試驗(yàn)來進(jìn)一步探究石油污染土壤生態(tài)毒性變化規(guī)律以及不同方法之間的一致性分析。文章首先通過發(fā)光菌毒性試驗(yàn)考查石油污染土壤微生物修復(fù)過程中土壤的生態(tài)毒性強(qiáng)弱及變化規(guī)律，通過度量發(fā)光細(xì)菌在不同修復(fù)時(shí)期土壤中的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度，并結(jié)合毒性等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)確定石油污染土壤發(fā)光菌指示的可行性與敏感性。隨后，文章以高等植物毒性試驗(yàn)及土壤酶活性試驗(yàn)結(jié)果作為輔助證據(jù)從生態(tài)學(xué)角度揭示石油污染土壤微生物修復(fù)過程中殘留的石油污染物和中間代謝產(chǎn)物對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響，在佐證發(fā)光菌毒性試驗(yàn)結(jié)果的同時(shí)也完成了石油污染土壤微生物修復(fù)過程中污染土壤的生態(tài)毒性變化規(guī)律的探究及指示效果的一致性分析。

1 材料與方法

1.1 混合菌的制備

本研究選取課題組前期分離出的洋蔥伯克霍爾德氏菌（Burkholderiacepacia）中的烷烴降解菌GS3C（CCTCC No. M 207169）；鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas sp.）中的菲降解菌GY2B（CCTCC No. M 206019）；伯克菌科 Pandoraea菌屬的pnomenusa種中的芘降解菌 GP3B（CCTCC No. M207167）為初始菌種資源。將上述3種菌株分別取1環(huán)進(jìn)行富集培養(yǎng)，然后在25 mg·mL-1的原油無機(jī)鹽培養(yǎng)基（5.0 mL PBS， 1.0 mL CaCl2溶液，1.0 mL FeCl3溶液，3.0 mL MgSO4溶液，1.0 mL微量元素，1000 mL蒸餾水）中分別加入1 mL富集液，接著將投加了石油降解菌的原油無機(jī)鹽培養(yǎng)基置于的搖床中馴化培養(yǎng)（30 ℃，150 r·min-1），每 5天為一個(gè)馴化周期，共馴化55 d后離心分離分別獲取3種馴化產(chǎn)物。最后將馴化后的GS3C、GY2B、GP3B菌（4.0×108CFU·mL-1）按等量配比的原則（1∶1∶1，V/V/V）復(fù)配后形成石油烴降解混合菌。

1.2 石油污染土壤的制備

供試土壤采自廣東增城的水稻田表層土壤。土壤取回經(jīng)干燥處理后過4.75 mm篩，去除大顆粒物質(zhì)后分為兩份，一份保存在4 ℃冰箱中并于避光條件下測(cè)定新鮮土樣的初始指標(biāo)（表1），另一份置于陰涼處風(fēng)干后過2 mm篩，保存待用。實(shí)驗(yàn)用油由廣州石化提供的原油（飽和烴：45.55%，芳烴：17.69%，膠質(zhì)和瀝青質(zhì)：9.68%）。

表1 供試土壤的理化性質(zhì)Table 1 Basic physiochemical properties of the tested soils

在φ15 cm×20 cm塑料盆裝入3 kg干土，將溶于石油醚中的石油均勻地加入土壤中，使土壤中石油烴的初始濃度為5000 mg·kg-1（每千克干土中含5 g原油），并攪拌均勻（Vouillamoz et al.，2001）。接著按3%（每100 g土加3 mL石油烴降解混合菌菌液）的比例接種到石油污染土壤中。

最后將各培養(yǎng)皿置于恒溫培養(yǎng)箱（30 ℃）中進(jìn)行石油污染土壤的微生物修復(fù)實(shí)驗(yàn)，每2天翻土攪拌一次并維持土壤含水率的穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)過程中，采集微生物修復(fù)第0、8、16、24、32、40 d的土壤，分別標(biāo)記為 S1，S2，S3，S4，S5，S6，同時(shí)采集凈土標(biāo)記為S0，將這7個(gè)土樣作為不同微生物修復(fù)時(shí)期的石油污染土壤，備用（Tang et al.，2010）。

1.3 測(cè)試項(xiàng)目及方法

1.3.1 供試原油的標(biāo)準(zhǔn)曲線

原油標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取 0.1000 g原油，加入少量正己烷，將其溶解后轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中定容，然后搖勻，配制成2 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。系列濃度原油標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：分別移取上述原油標(biāo)準(zhǔn)溶液1、3、5、7、9 mL于25 mL容量瓶中，并用正己烷定容。再分別取1 mL的系列原油溶液定容于25 mL容量瓶中，配成標(biāo)準(zhǔn)系列的濃度分別是3.2、9.6、16、22.4、28.8 mg·L-1。在繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線前，先取少量原油標(biāo)準(zhǔn)液于紫外-分光光度計(jì)的220～260 nm處進(jìn)行光譜掃描，找出本研究中油樣的最大吸收波長(zhǎng)。然后在最大吸收波長(zhǎng)下分別測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)濃度油樣的吸光度，并將數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

石油及其產(chǎn)品在紫外區(qū)有特征吸收，帶有苯環(huán)的芳香族化合物的主要吸收波長(zhǎng)為250～260 nm，帶有共軛雙鍵的化合物主要吸收波長(zhǎng)為215～230 nm，一般原油的兩個(gè)主要吸收波長(zhǎng)為225及254 nm（何麗媛，2010）。本研究中的原油樣品在220～260 nm的特征吸收波段下的掃描結(jié)果如圖1（a）所示。可以看出，原油樣品在波長(zhǎng)225 nm和235 nm處均出現(xiàn)了較強(qiáng)的吸收峰，其中在波長(zhǎng)225 nm處為最大吸收峰。研究認(rèn)為，在最大吸收峰處吸收最大、干擾最?。ɡ顚毭鳎?007）。故本研究中選取225 nm作為最佳吸收波長(zhǎng)。在最大吸收峰波長(zhǎng)225 nm下，分別測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)油樣品溶液的吸光度。為了能夠更準(zhǔn)確的反映樣品濃度和吸光度之間的關(guān)系，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1（b）所示。

圖1 原油標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制Fig. 1 The drafting of crude oil standard curves

標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為：

式中：y—吸光值；x—原油濃度，mg·mL-1。

1.3.2 土樣中總石油烴含量的測(cè)定

稱取風(fēng)干土壤5 g于50 mL離心管中，加入適量Na2SO4和10 mL正己烷，然后在1800 r·min-1條件下振蕩1 min，再將其超聲半小時(shí)并離心（3000 r·min-1，10 min）收集上清液。重復(fù)上述操作4次，確保土樣中的石油烴全部被提取出來。將上述上清液過 0.45 μm 的有機(jī)系濾膜后移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52CS）中進(jìn)行濃縮，用25 mL的容量瓶定容，最后在225 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值，對(duì)照石油的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出石油污染土樣中石油烴殘留量和降解率（Han et al.，2009）。

式中：α1為土樣中石油烴的初始含量；α2為不同微生物修復(fù)時(shí)期土樣中石油烴的殘留量。

1.3.3 發(fā)光細(xì)菌的生態(tài)毒性測(cè)定

將等質(zhì)量的污染土壤與無菌蒸餾水混合，在25 ℃條件下，在振蕩機(jī)（HZQ-F160）上反復(fù)振蕩（120 r·min-1）1 h，隨后土壤水樣于4000 r·min-1的條件下離心30 min，過濾備用。污染土壤二氯甲烷（DCM）/二甲基亞砜（DMSO）浸提液制備：稱取5.0 g土壤，用二氯甲烷（DCM）超聲提取30 min，然后在4000 r·min-1的條件下離心10 min，收集上層液體。重復(fù)上述操作4次，確保土壤中的石油烴全部被洗出。然后將萃取液減壓旋轉(zhuǎn)濃縮至5 mL，再加入5 mL二甲基亞砜（DMSO），然后將該混合物繼續(xù)濃縮至5 mL，備用（劉五星等，2007）。

發(fā)光菌生態(tài)毒性測(cè)試在2 mL的測(cè)試管中進(jìn)行，分別向測(cè)試管中加入200 μL 22%的NaCl溶液，200 μL的待測(cè)溶液，1580 μL的去離子水，20 μL的復(fù)蘇好的菌液。加完復(fù)蘇好的菌液（實(shí)驗(yàn)所采用的明亮發(fā)光桿菌，T3變種凍干粉購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所）后蓋上瓶塞，用手顛倒5次，拔取瓶塞，放回測(cè)試架上（Bundy et al.，2004）。反應(yīng)15 min后在生態(tài)毒性測(cè)試儀上測(cè)定其發(fā)光強(qiáng)度（mV）。本研究采用相對(duì)發(fā)光度（%）（樣品的發(fā)光強(qiáng)度除以對(duì)照的發(fā)光強(qiáng)度），同時(shí)根據(jù)參比毒物氯化汞的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出與樣品急性毒性相當(dāng)?shù)穆然瘽舛龋╩g·L-1）。

圖2 不同修復(fù)時(shí)期的土壤中石油烴殘留量及表觀降解率Fig. 2 Changes in TPH removal efficiency and residual oil during different phases of bioremediation

1.3.4 光合色素含量的測(cè)定

取不同微生物修復(fù)時(shí)期的石油污染土樣各 100 g于不同培養(yǎng)皿中，再將小麥（Triticum aestivnm L.）和蘿卜（Raphanus sativus L.）種子（各20粒，購(gòu)于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院），均勻嵌入不同培養(yǎng)皿的土樣中，再在種子上面均勻覆蓋20 g對(duì)應(yīng)修復(fù)時(shí)期的供試土壤，并調(diào)節(jié)土壤含水率（Al-Mutairi et al.，2008），隨后蓋好玻璃培養(yǎng)皿并置于25 ℃光照培養(yǎng)箱（SPX-250）中培養(yǎng)。黑暗培養(yǎng)2 d后進(jìn)行為期3 d的光照和黑暗交替培養(yǎng)，每天光照16 h，黑暗培養(yǎng)8 h，維持光照強(qiáng)度為4300 lux（Al-Mutairi，2008；Banks et al.，2005）。種子發(fā)芽后在之前的光照條件下繼續(xù)培養(yǎng)9 d后，測(cè)定不同土壤中小麥和蘿卜的葉片葉綠素a和類胡蘿卜素含量。具體操作為：準(zhǔn)確稱取新鮮植物葉片0.1 g（鮮重）用10 mL100%甲醇進(jìn)行提取，然后放入 4 ℃冰箱中，靜止提取24 h后，提取液在4 ℃、2000 r·min-1下離心15 min，保留上清液。用甲醇做參比溶液，在紫外可見分光光度計(jì)下掃描上清液，得到其在400～750 nm波段的吸光度值。

葉綠素a的含量根據(jù)Porra的計(jì)算公式（3）計(jì)算（Porra，2002），類胡蘿卜素的含量，根據(jù)公式（4）計(jì)算（Parsons et al.，1963）：

式中：A750、A665、A652、A510、A480分別代表波長(zhǎng)為750、665、652、510和480 nm下的吸光度值。

1.3.5 過氧化氫酶活性

過氧化氫酶的測(cè)定采用高錳酸鉀滴定法測(cè)定（周禮愷等，1980）：取5 g過1 mm篩的風(fēng)干土樣、置于150 mL錐形瓶中，注入40 mL蒸餾水和5 mL 0.3%過氧化氫。另設(shè)對(duì)照（往瓶中注入40 mL蒸餾水和5 mL 0.3%過氧化氫，而不加土樣）。將瓶塞緊，置于120 r·min-1往返式搖床上，振蕩30 min。隨后，注入5 mL1.5 mol·L-1硫酸以終止反應(yīng)，將瓶中內(nèi)容物用致密濾紙過濾。取25 mL濾液用0.1 mol·L-1高錳酸鉀溶液滴定至微紅色。土壤的過氧化氫酶活性，以單位重量土壤消耗的0.1 mol·L-1高錳酸鉀毫升數(shù)（對(duì)照與試驗(yàn)測(cè)定的差值）表示，也可以將高錳酸鉀毫升數(shù)轉(zhuǎn)化為氧化氫的毫克數(shù)表示。

注：實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純，購(gòu)于阿拉丁。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行差異顯著性（P=0.05和P=0.01）和相關(guān)性統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果以算術(shù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 石油污染土壤的微生物修復(fù)作用

不同微生物修復(fù)時(shí)期土壤中總石油烴降解率及殘留量如圖2a和2b所示。整體來看，與不投加混合菌的石油污染土壤相比，投加混合菌的污染土壤在石油污染土壤微生物修復(fù)的各階段都表現(xiàn)出更高的石油烴降解率以及更低的殘留量。具體而言，在投加菌劑的污染土壤中，從土樣S1到S2石油烴降解率有一個(gè)急速的增長(zhǎng)過程，之后隨微生物修復(fù)過程的進(jìn)行而穩(wěn)步上升，在土樣S2～S6中石油烴表觀降解率在54%～64%范圍內(nèi)變化，從土樣S5開始石油烴的降解率基本維持在64%左右（圖2a），相應(yīng)地，殘留量也基本保持穩(wěn)定（1.79 mg·g-1）（圖2b）。在微生物修復(fù)的前期，石油污染物的進(jìn)入為土壤中的微生物提供了豐富的碳源，微生物經(jīng)過一段時(shí)間的適應(yīng)期之后便開始利用其中易降解的短鏈?zhǔn)蜔N進(jìn)行繁殖，大量消耗了石油中的短鏈?zhǔn)蜔N組分，整體呈現(xiàn)出很高的降解率；隨著微生物修復(fù)過程的繼續(xù)進(jìn)行，易降解的石油烴組分繼續(xù)被大量消耗，殘留物變成了以芳香烴等難降解物為主的混合物，這些物質(zhì)大多難以被微生物利用，僅有小部分仍在繼續(xù)被降解（Margesin et al.，1999），從微生物修復(fù)中后期的的數(shù)據(jù)可以看出在，雖然降解率仍在上升，但上升的速率卻已經(jīng)十分緩慢，相應(yīng)地石油烴的殘留量也基本保持穩(wěn)定。

同時(shí)應(yīng)注意到，在不投加菌劑的污染土壤中，石油烴的降解率隨修復(fù)過程的進(jìn)行也有緩慢上升，但降解速率基本僅維持在16%左右，即使是在土樣S6中仍有83.2%的石油烴被剩余（圖2b），由此可以確認(rèn)，土壤中土著微生物對(duì)石油烴的降解也有貢獻(xiàn)（Langbehn et al.，1995），但其效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及本實(shí)驗(yàn)復(fù)配形成的混合菌。綜上可知，投加菌劑的污染土壤表觀出的高降解率和低殘留量是復(fù)配的降解菌對(duì)石油烴污染物的去除起主導(dǎo)作用這一微觀結(jié)果的宏觀體現(xiàn)。

2.2 不同修復(fù)時(shí)期土壤水浸提液及 DCM/DMSO浸提液生態(tài)毒性

參比毒物HgCl2的生態(tài)毒性分析。將一系列的HgCl2標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行生態(tài)毒性測(cè)試，得到不同濃度對(duì)應(yīng)的發(fā)光量，相對(duì)于空白對(duì)照換算成相對(duì)發(fā)光度，得到以HgCl2濃度為橫坐標(biāo)，相對(duì)發(fā)光度為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3（a）所示。

圖3 （a）HgCl2的生態(tài)毒性的標(biāo)準(zhǔn)曲線；（b）不同生物修復(fù)階段土壤浸提液的生態(tài)毒性Fig. 3 (a) The standard curve of ecotoxicityof HgCl2; (b) the ecotoxicity of soil extracts in different phases of bioremediation The asterisk (*) indicates differences at the 0.05 level compared with the control group (S0). The double asterisks (**) indicates differences at the 0.01 level compared with the control group (S0)n.s. not significant

其標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：

其中：y為相對(duì)發(fā)光度（%）；x為HgCl2的標(biāo)準(zhǔn)液濃度，mg·L-1。

在國(guó)標(biāo)GB/T15441─1995（水質(zhì)急性毒性的測(cè)定-放光細(xì)菌法）中規(guī)定：當(dāng)氯化汞標(biāo)準(zhǔn)液濃度為0.10 mg·L-1，發(fā)光細(xì)菌的相對(duì)發(fā)光度為50%，其誤差不能超過±10%，否則更換發(fā)光細(xì)菌凍干粉，重新進(jìn)行測(cè)定。按照該標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行本研究中標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢驗(yàn)，將 x=0.10代入上式，得到 y=58.006，其誤差η=8.006%<10%，這說明了 HgCl2系列的標(biāo)準(zhǔn)液生態(tài)毒性可以作為本研究的參比毒物的生態(tài)毒性。

此外，可以看出不同修復(fù)時(shí)期土壤的發(fā)光細(xì)菌相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度呈現(xiàn)“先減弱后增強(qiáng)”的趨勢(shì)。當(dāng)發(fā)光細(xì)菌受到外界影響時(shí)，其發(fā)光過程就會(huì)受到相應(yīng)的干擾，并且發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度與毒性作用強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（馬梅等，1998）。這說明土壤中的生態(tài)毒性強(qiáng)度是先增強(qiáng)后減弱的，這與（Xu et al.，2010）以及（Al-Mutairi et al.，2008）的研究結(jié)果是一致的。其中以土樣 S2的生態(tài)毒性最大，其次是土樣S3，相對(duì)發(fā)光度分別為18.1%和18.8%，對(duì)照表2中美國(guó)Microtox的毒性等級(jí)劃分可以看出：它們的生態(tài)毒性級(jí)別為劇毒，同時(shí)對(duì)照通過公式（4）計(jì)算可知土樣S2的生態(tài)毒性值與0.187 mg·L-1的HgCl2毒性相當(dāng)，土樣S3的生態(tài)毒性值與0.185mg·L-1的HgCl2毒性相當(dāng)。隨著修復(fù)的進(jìn)行土壤的生態(tài)毒性有所降低，在修復(fù)結(jié)束后，土樣 S6的DCM/DMSO浸提液中發(fā)光菌的相對(duì)發(fā)光度為51.4%，其生態(tài)毒性級(jí)別為中毒，與 0.114 mg·L-1HgCl2的毒性相當(dāng)。

表2 國(guó)外發(fā)光細(xì)菌的生態(tài)毒性實(shí)驗(yàn)毒性等級(jí)劃分Table 2 The toxicity classification on Microtox test in different state

微生物修復(fù)初始階段，由于高濃度的石油污染物進(jìn)入土壤中危害到了混合菌的生長(zhǎng)代謝，從而導(dǎo)致初始階段土壤浸提液表現(xiàn)出強(qiáng)生態(tài)毒性。隨著修復(fù)的進(jìn)行，毒性有所降低但仍高于對(duì)照組。值得注意的是，強(qiáng)烈的生態(tài)毒性是出現(xiàn)在生物修復(fù)的前中期，此時(shí)大部分烴類污染物已被去除。這可能是由于微生物在修復(fù)石油污染土壤過程中產(chǎn)生了毒性更強(qiáng)的中間體或者代謝產(chǎn)物（Al-Mutairi et al.，2008）。這也可以看出，目標(biāo)污染物濃度的降低并不意味著其生態(tài)毒性的減弱，中間代謝產(chǎn)物的生成或者是污染物的生物可利用性變化可能會(huì)產(chǎn)生更強(qiáng)的生態(tài)毒性（Xu et al.，2010）。

此外，由于不同的石油烴降解微生物對(duì)石油烴的代謝途徑存在差異，在實(shí)際修復(fù)過程中構(gòu)建混合菌體系中微生物的種類、復(fù)配比例等因素都會(huì)對(duì)微生物降解石油烴產(chǎn)生較為明顯的影響，從而導(dǎo)致土壤的毒性存在差異（冷凱良等，2001）。石油類污染物進(jìn)入土壤后會(huì)破壞原有的土壤生態(tài)系統(tǒng)，引起土壤中生物的分子、細(xì)胞、個(gè)體、種群和群落五個(gè)水平的響應(yīng)（焦海華等，2013），進(jìn)而會(huì)對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)食物鏈上的生物體的遺傳物質(zhì)進(jìn)行誘導(dǎo)并產(chǎn)生一系列的變化，影響遺傳物質(zhì)的傳遞和表達(dá)，最終表現(xiàn)出與正常生物個(gè)體不同的外部癥狀（楊麗芹等，2011）。在過去的很長(zhǎng)一段時(shí)間里，學(xué)者們普遍將石油烴目標(biāo)污染物作為評(píng)價(jià)污染土壤修復(fù)效果的一項(xiàng)指標(biāo)。然而，土壤環(huán)境本身就是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)，化學(xué)方法并不能科學(xué)、全面地評(píng)價(jià)土壤的修復(fù)效果和表征修復(fù)后土壤整體的質(zhì)量特征，需要采用其他方法對(duì)此作出補(bǔ)充（趙晴等，2005）。

雖然發(fā)光菌毒性試驗(yàn)結(jié)果很好地指示了石油污染土壤的生態(tài)毒性，但涉及不同指示方法之間的效果及一致性分析的研究還比較少。由于通過不同指示生物對(duì)土壤生態(tài)毒性進(jìn)行指示和評(píng)價(jià)可以有效地集合土壤中不同食物鏈生物對(duì)有毒有害物質(zhì)的整體毒性效應(yīng)，能較為全面地反饋土壤的污染信息。因此，本文通過高等植物毒理性試驗(yàn)以及土壤酶活性試驗(yàn)進(jìn)一步佐證發(fā)光菌毒性試驗(yàn)結(jié)果的正確性，整合這幾種毒性試驗(yàn)方法，進(jìn)行相互檢驗(yàn)以及一致性分析。借此對(duì)土壤系統(tǒng)的生態(tài)安全性做出全面、科學(xué)地判斷。

2.3 高等植物光合色素試驗(yàn)

石油污染物對(duì)高等植物光合作用的影響是它們受害的重要原因之一，即便生長(zhǎng)于不同生態(tài)毒性土壤中的植物外在形貌上的差異不大，其生理機(jī)能如光合作用強(qiáng)度、光合時(shí)間長(zhǎng)短以及光合色素含量等均受到不同程度的影響（廖長(zhǎng)君，2015；盧麗麗，2008）。其中，光合色素在植物光合作用的光吸收過程中起關(guān)鍵作用，且與各種形式的生命活動(dòng)緊密聯(lián)系在一起，發(fā)揮著著不可替代的作用。因此，探究石油污染土壤對(duì)植物葉片光合色素含量的影響，有助于理解植物在污染土壤中的生長(zhǎng)狀況，進(jìn)而推斷石油污染物的生態(tài)毒性強(qiáng)弱。

不同微生物修復(fù)時(shí)期污染土壤中小麥和蘿卜葉片中的葉綠素a以及胡蘿卜素含量變化如圖4所示?？梢钥闯?，小麥的葉綠素a含量在不同微生物修復(fù)時(shí)期的污染土壤中均表現(xiàn)出顯著抑制作用，其中土樣 S1對(duì)其抑制作用達(dá)到最大，相對(duì)于對(duì)照組S0(2.24±0.08) mg·g-1降低了39.3%，僅為(1.36±0.04) mg·g-1；其次是土樣 S3和 S4，分別相對(duì)于對(duì)照組S0減少了34.6%和37.3%，最終葉綠素a的含量分別為1.46±0.07和(1.39±0.29) mg·g-1。小麥類胡蘿卜素含量和葉綠素a含量的變化趨勢(shì)一致，兩者在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有極顯著的正相關(guān)性，r=0.996（P<0.01），這說明在石油污染的脅迫下葉綠素a和類胡蘿卜素含量具有較好的一致性。

圖4 原油對(duì)小麥和蘿卜葉片光合色素的影響Fig. 4 Effects of crude oil on the photosynthetic pigments (Triticumacstivnm L.andRaphanussativusL.)

一方面石油污染物進(jìn)入土壤會(huì)降低土壤養(yǎng)分的有效性、干擾植物細(xì)胞的正常生理活動(dòng)，削弱植物對(duì)土壤養(yǎng)分的攝取，進(jìn)而影響植物光合色素的合成（Karthikeyan et al.，2014）；另一方面，在石油土壤中的余油以及微生物修復(fù)過程中的中間代謝產(chǎn)物會(huì)破壞細(xì)胞膜和葉綠體結(jié)構(gòu)的破壞導(dǎo)致植物的光合作用（Xie et al.，2014）。也有研究表明光合色素的降低可能與氣孔的變化密切相關(guān)。例如，鉛的重毒性可引起茄子（Solarium melongena）葉綠素含量明顯降低，鉛濃度對(duì)氣孔參數(shù)具有負(fù)作用（Yilmaz et al.，2009）。由于植物所生長(zhǎng)的土壤生態(tài)毒性越強(qiáng)，植物生理生化過程受到的抑制就越強(qiáng)，有機(jī)物質(zhì)合成受阻，部分酶的功能受到抑制，最終導(dǎo)致光合色素含量降低越明顯（Cartmill et al.，2014；Xie et al.，2014）。所以小麥光合色素含量可以間接地反映石油污染土壤的生態(tài)毒性的強(qiáng)弱。以上結(jié)果說明石油污染土壤的生態(tài)毒性在前中期較強(qiáng)，后期生態(tài)毒性有所減弱但仍強(qiáng)于對(duì)照組，該結(jié)果與發(fā)光菌毒性試驗(yàn)結(jié)果吻合。

《義務(wù)教育語(yǔ)文課程標(biāo)準(zhǔn)（2011年版）》中指出：“各個(gè)學(xué)段的閱讀教學(xué)都要重視朗讀和默讀?！睆哪撤N意義上說，學(xué)生朗讀的水平直接體現(xiàn)其語(yǔ)文素養(yǎng)的高低。語(yǔ)文課程的學(xué)科特點(diǎn)決定了必須通過大量的朗讀和背誦來積累語(yǔ)言，提高語(yǔ)言文字的運(yùn)用能力。全國(guó)著名特級(jí)教師于永正說：“語(yǔ)文教學(xué)的亮點(diǎn)，首先應(yīng)該在朗讀上，老師讀得正確、流利、有感情，并引導(dǎo)學(xué)生讀得正確、流利、有感情，是一種美好的境界。師生能讀得入情入境的語(yǔ)文課堂，一定是充滿生機(jī)、充滿靈性、充滿情趣的語(yǔ)文課堂?！苯虒W(xué)中，教師應(yīng)做到因文而異，帶領(lǐng)學(xué)生讀出文章的抑揚(yáng)頓挫，讀出作者的喜怒哀樂，展現(xiàn)語(yǔ)文課程的學(xué)科魅力。

與此相反，從圖4可以看出，蘿卜的葉綠素a含量在不同修復(fù)時(shí)期的污染土壤中均表現(xiàn)出誘導(dǎo)作用，其中在修復(fù)的前中期（S1、S2、S3、S4）與對(duì)照組之間出現(xiàn)顯著誘導(dǎo)，相對(duì)于對(duì)照處理組S0(0.58±0.00)分別高出了 32.3%、30.0%、11.3%和15.8%，蘿卜的葉綠素 a含量最終分別到達(dá)(0.76±0.02)，(0.75±0.02)，(0.64±0.02)和(0.67±0.03) mg·g-1。蘿卜的類胡蘿卜素的結(jié)果和葉綠素 a結(jié)果同樣表現(xiàn)出極顯著的正相關(guān)性。這與小麥的葉綠素a和類胡蘿卜素結(jié)果恰好相反，說明不同的植物種類在石油污染脅迫下葉綠素a和類胡蘿卜素的變化表現(xiàn)出差異。大多數(shù)植物在污染物的脅迫下會(huì)出現(xiàn)光合作用強(qiáng)度減弱、光合色素含量下降的情形。如Pb能抑制菠菜葉綠素中光合電子傳遞，抑制光合作用中對(duì)CO2的固定（吳曉，2008）；Cd主要抑制光化學(xué)系統(tǒng)中的電子轉(zhuǎn)運(yùn)，影響光合磷酸化作用，并增加葉肉細(xì)胞對(duì)氣體的阻力，從而使光合作用下降。然而，本研究結(jié)果表明石油污染物卻對(duì)蘿卜葉片的光合色素的含量起誘導(dǎo)作用，這可能與蘿卜對(duì)石油污染物的響應(yīng)機(jī)制有關(guān)，具體原因需要進(jìn)一步探索。

2.4 土壤酶活性實(shí)驗(yàn)

石油污染土壤微生物修復(fù)過程中生態(tài)毒性的變化會(huì)直接導(dǎo)致土壤微生物的活性的變化，進(jìn)而引發(fā)土壤酶活性的變化。土壤酶活性作為土壤微生物新陳代謝是否正常的關(guān)鍵性指標(biāo)，是土壤整體健康狀況的綜合反映（張曉陽(yáng)，2013）。其中，過氧化氫酶形成于微生物體呼吸氧化有機(jī)物的過程，廣泛存在于微生物細(xì)胞中，是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一。它能直接將對(duì)生物體有毒害作用的 H2O2催化分解為無害的H2O與O2，避免強(qiáng)氧化性·OH的形成，進(jìn)而解除H2O2對(duì)微生物的損害（藺昕等，2005），將其作為土壤生態(tài)毒性的指示物，具有理論上的可行性。本文在課題組前期的研究基礎(chǔ)上優(yōu)選過氧化氫酶作為土壤酶的代表（王華金等，2013），考察了 H2O2酶的活性在接種外源石油降解混合菌劑的石油污染土壤修復(fù)過程中的變化情況，并將其與石油烴殘留量進(jìn)行耦合進(jìn)行了相關(guān)性分析以及線性擬合，用于估計(jì)該微生物修復(fù)體系中土壤 H2O2酶活性和石油烴殘留量的關(guān)系。

不同預(yù)處理的土壤在各修復(fù)階段的 H2O2酶活性變化如圖5所示?？傮w來看，不同預(yù)處理的土壤中H2O2酶活性高低順序?yàn)椋和都泳奈廴就寥?凈土>未加菌的污染土壤。具體而言，未投加菌劑的污染土壤中 H2O2酶活性始終維持在較低水平（2.39～2.51 mg H2O2·(g干土)-1·h-1），明顯低于無污染的土壤（2.60～2.74 mg H2O2·(g干土)-1·h-1），這說明石油污染物對(duì)土壤H2O2酶活性產(chǎn)生了抑制作用。而在投加菌劑的污染土壤中，從S1（2.395）到S2（3.003 mg H2O2·(g干土)-1·h-1），H2O2酶活性有一個(gè)快速、明顯的上升過程，該階段 H2O2酶活性的增長(zhǎng)速率最大，達(dá)到25.3%；隨后修復(fù)階段的土樣S3和S4中酶活性的增長(zhǎng)速率急劇下降（僅為2.392%和2.984%），并最終在土樣S4中H2O2酶活性在達(dá)到最大（3.167mg H2O2·(g干土)-1·h-1）；接下來的土樣 S5，S6中 H2O2酶活性呈緩慢的下降趨勢(shì)（-3.258%和-1.222%）。

圖5 不同預(yù)處理的土壤在各修復(fù)階段的H2O2酶活性Fig. 5 Catalase activity activity of the soil samples in different phases of bioremediation

初始階段，石油烴進(jìn)入土壤為石油烴降解微生物提供了大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)了土壤中石油降解微生物的大量繁殖，微生物的呼吸作用增強(qiáng)產(chǎn)生大量 H2O2，微生物分泌 H2O2酶來降低過量的 H2O2對(duì)微生物體的毒害作用，這導(dǎo)致了土壤中 H2O2酶活性迅速增強(qiáng)（吳偉林等，2010）。隨著修復(fù)的進(jìn)行，土壤中 C∶N∶P的比例逐漸失衡，且石油烴在生物修復(fù)過程中產(chǎn)生了某些具有強(qiáng)烈毒性的中間產(chǎn)物，初步抑制了微生物的活性，導(dǎo)致了 H2O2酶活性的增長(zhǎng)速率急劇下降（Al-Mutairi et al.，2008；魯莽等，2009）。從土樣S4開始，隨著C∶N∶P的比例的進(jìn)一步失衡，微生物生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡，并且石油烴的強(qiáng)毒性中間代謝產(chǎn)物進(jìn)一步累積使得 H2O2酶活性開始下降，這表明石油污染物已經(jīng)開始嚴(yán)重破壞微生物的正常生理活動(dòng)。此外，可以預(yù)見，雖然 H2O2酶能分解微生物的呼吸過程產(chǎn)生的H2O2，但分解能力的局限會(huì)導(dǎo)致剩余H2O2在土壤中積累，對(duì)微生物產(chǎn)生毒害作用，加劇H2O2酶活性的降低。

進(jìn)一步對(duì)石油污染土壤微生物修復(fù)過程中土樣酶活性與石油殘留量的相關(guān)性分析表明，H2O2酶活性與石油殘留量呈極顯著相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為-0.973（P=0.001）；同時(shí)以土壤石油烴殘留量為自變量（x），土壤酶活性為因變量（y），進(jìn)行線性擬合分析可得表3。

表3 H2O2酶活性與土壤殘油的相關(guān)性分析及線型回歸方程Table 3 Correlation analysis and linear regression equations between catalase activity and residual oil

H2O2酶活性與土壤殘油的線型回歸方程如下：

從整個(gè)微生物修復(fù)過程中，綜合3種土壤中過氧化氫酶活性來看，土壤中的土著微生物對(duì)解除石油污染土壤的生態(tài)毒性作用不大，表現(xiàn)為未投加菌劑的污染土壤中氧化氫酶活性在整個(gè)修復(fù)過程中始終維持在極低水平且上升幅度極小；投加菌劑的污染土壤中過氧化氫酶活性維持在較高水平且上升幅度大。這也驗(yàn)證了之前的試驗(yàn)一致：本試驗(yàn)中外源添加的復(fù)合菌劑對(duì)石油污染物的去除起主導(dǎo)作用。同時(shí)可以看到，投加菌劑的污染土壤中活性高，只能說明石油烴殘留低，并不意味著生態(tài)毒性始終維持在低水平，微生物修復(fù)前期產(chǎn)生的強(qiáng)毒性中間代謝產(chǎn)物會(huì)初步抑制微生物活性并逐步累積導(dǎo)致微生物的正常代謝活動(dòng)被破壞。前期表現(xiàn)為隨石油烴殘留量的減少，過氧化氫酶活性上升速率逐漸降低；后期表現(xiàn)為隨石油烴殘留量的減少，過氧化氫酶活性逐漸減弱。該試驗(yàn)結(jié)果也可以間接說明石油污染土壤微生物修復(fù)過程中的生態(tài)毒性在前期因中間代謝產(chǎn)物的生成而增強(qiáng)，后期部分適應(yīng)了新的土壤環(huán)境的微生物開始降解中間代謝產(chǎn)物導(dǎo)致石油污染土壤生態(tài)毒性減弱。

2.5 微生物修復(fù)石油污染土壤過程中的生態(tài)毒性

目標(biāo)污染物的濃度是評(píng)價(jià)石油污染土壤微生物修復(fù)效果的重要指標(biāo)之一，然而土壤生態(tài)環(huán)境的多樣性以及石油污染物組分的復(fù)雜性使得通過化學(xué)方法將土壤中所有的有毒物質(zhì)一一檢測(cè)幾乎不可能實(shí)現(xiàn)。研究表明，土壤環(huán)境本身就是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)，一般的化學(xué)方法并不足以科學(xué)、全面地評(píng)價(jià)污染土壤的生態(tài)修復(fù)效果并指示微生物修復(fù)后土壤整體的健康狀況。此外，即便石油污染土壤中目標(biāo)污染物的含量達(dá)到環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，但殘留的難降解組分以及微生物生成的某些中間產(chǎn)物仍會(huì)使土壤具備較強(qiáng)的生態(tài)毒性，并且最終會(huì)在生物體上體現(xiàn)出來。所以，化學(xué)診斷的局限性決定了用單一化學(xué)方法監(jiān)測(cè)和診斷土壤的微生物修復(fù)效果已不能準(zhǔn)確指示石油污染土壤生態(tài)毒性的強(qiáng)弱。

本研究以發(fā)光細(xì)菌的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度為主要指標(biāo)對(duì)不同修復(fù)時(shí)期石油污染土壤生態(tài)毒性進(jìn)行了分析診斷，并以高等植物毒性試驗(yàn)以及土壤酶活性試驗(yàn)結(jié)果作為輔助證據(jù)來評(píng)價(jià)了石油污染土壤微生物的修復(fù)效果并分析了這 3種指示方法的一致性。通過對(duì)比分析可以看出，高等植物光合色素毒性試驗(yàn)、土壤過氧化氫酶和發(fā)光細(xì)菌生態(tài)毒性試驗(yàn)結(jié)果之間存在良好的一致性，都表明污染土壤生態(tài)毒性隨修復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先增大后減弱的變化趨勢(shì)。具體而言，發(fā)光菌生態(tài)毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，不同修復(fù)時(shí)期土壤的發(fā)光細(xì)菌相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度呈現(xiàn)“先減弱后增強(qiáng)”的變化趨勢(shì)。當(dāng)發(fā)光細(xì)菌受到外界影響時(shí)，其發(fā)光過程就會(huì)受到相應(yīng)的干擾，并且發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度與毒性作用強(qiáng)度呈線性負(fù)相關(guān)關(guān)系。這說明了土壤中的生態(tài)毒性強(qiáng)度也是先增強(qiáng)后減弱。從高等植物光合色素毒性試驗(yàn)結(jié)果分析可得，植物光合色素的響應(yīng)并不是隨石油烴的濃度的變化呈現(xiàn)出對(duì)應(yīng)的變化趨勢(shì)，最高的石油烴濃度并不會(huì)對(duì)供試植物的光合色素含量產(chǎn)生最強(qiáng)的抑制作用；在石油污染土壤修復(fù)過程的前中期，石油污染土壤對(duì)小麥葉片光合色素含量的抑制作用最為明顯。同時(shí)，不同植物（小麥與蘿卜）對(duì)石油污染土壤的生態(tài)毒性響應(yīng)呈相反趨勢(shì)。從土壤過氧化氫酶活性試驗(yàn)結(jié)果分析可得，投加菌劑的污染土壤中較高的過氧化氫酶活性以及較低的石油烴殘留并不意味著石油污染土壤的生態(tài)毒性始終維持在低水平，微生物修復(fù)前期產(chǎn)生的強(qiáng)毒性中間代謝產(chǎn)物會(huì)初步抑制微生物活性并逐步累積導(dǎo)致微生物的正常代謝活動(dòng)被破壞。隨著石油烴殘留量的減少，前期表現(xiàn)為過氧化氫酶活性上升速率逐漸降低，后期表現(xiàn)為過氧化氫酶活性逐漸減弱。該試驗(yàn)結(jié)果也間接說明了微生物修復(fù)土壤的生態(tài)毒性在前期因中間代謝產(chǎn)物的生成而增強(qiáng)，后期有減弱趨勢(shì)。以上結(jié)果說明，在石油污染土壤的微生物修復(fù)過程中，石油烴目標(biāo)污染物殘留量作為一個(gè)化學(xué)指標(biāo)，它的減少并不能說明受污土壤的修復(fù)效果好，應(yīng)結(jié)合土壤的生態(tài)毒理學(xué)試驗(yàn)，綜合評(píng)價(jià)土壤的修復(fù)效果和健康狀況。

在石油污染土壤中，即使石油目標(biāo)污染物的含量達(dá)到環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)，土壤的生態(tài)毒性仍然很強(qiáng)，而且在生物體上會(huì)最終表現(xiàn)出來（Al-Mutairi et al.，2008）。有研究表明盡管微生物修復(fù)后的石油烴總量?jī)H為原來的35%，但指示生物的生態(tài)毒性評(píng)價(jià)結(jié)果顯示生態(tài)毒性的最大值出現(xiàn)在修復(fù)第一階段，并且受污土壤在整個(gè)修復(fù)過程中均有一定的生態(tài)毒性效應(yīng)（Hubálek et al.，2007）。石油污染土壤的生態(tài)毒性隨著微生物修復(fù)過程的進(jìn)行而變得復(fù)雜，生態(tài)毒性在微生物修復(fù)的前中期表現(xiàn)為增強(qiáng)，可能的主要原因有以下兩點(diǎn)：（a）微生物修復(fù)的前期易降解、毒性低的短鏈?zhǔn)蜔N含量的減少，難降解物質(zhì)（如多環(huán)芳烴等，毒性明顯高于短鏈?zhǔn)蜔N類物質(zhì)）含量的相對(duì)增加；（b）修復(fù)過程中微生物的代謝中間產(chǎn)物的產(chǎn)生，導(dǎo)致其毒性要強(qiáng)于原來的污染物。已有研究表明，某些烴尤其是PAHs的氧化中間產(chǎn)物具有比其母本石油烴更強(qiáng)的生態(tài)毒性（Al-Mutairi et al.，2008）。因此，在石油污染土壤微生物修復(fù)過程中，應(yīng)對(duì)微生物的次生代謝產(chǎn)物以及中間代謝產(chǎn)物予以足夠的重視。在石油污染土壤微生物修復(fù)后期，部分微生物開始利用少量的多環(huán)芳烴等難降解物質(zhì)作為碳源來維持自身生命活動(dòng)，土壤的生態(tài)毒性呈下降趨勢(shì)；此外，能夠適應(yīng)土壤新環(huán)境的微生物被保留下來，它們可以利用中間代謝產(chǎn)物進(jìn)行新陳代謝?？梢钥闯?，隨著石油污染土微生物壤修復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng)，受污土壤的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)逐漸降低。理論與實(shí)踐均表明，恢復(fù)石油污染土壤的原有的生態(tài)功能是一個(gè)長(zhǎng)期而復(fù)雜的生態(tài)過程。

3 結(jié)論

（1）在發(fā)光細(xì)菌的生態(tài)毒性實(shí)驗(yàn)中，土壤的生態(tài)毒性呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢(shì)。土樣 S1的生態(tài)毒性最大，其DCM/DMSO浸提液中發(fā)光菌的相對(duì)發(fā)光度為18.1%，與0.187 mg·L-1HgCl2的毒性相當(dāng)。明亮發(fā)光桿菌的相對(duì)發(fā)光度能夠敏感地指示石油污染土壤的生態(tài)毒性。

（2）在植物光合色素毒性試驗(yàn)中，修復(fù)前期的土壤對(duì)小麥葉片光合色素含量的抑制最為明顯，后期抑制效果減弱。小麥與蘿卜葉片光合色素含量對(duì)石油污染土壤生態(tài)毒性的響應(yīng)存在巨大差異。

（3）土壤過氧化氫酶酶活性與石油烴殘留量呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（-0.973），土壤過氧化氫酶活性試驗(yàn)與發(fā)光菌毒性試驗(yàn)以及植物光合色素毒性試驗(yàn)結(jié)果呈現(xiàn)良好的一致性。

（4）石油污染土壤微生物修復(fù)過程中，目標(biāo)石油烴污染物殘留量的減少并不意味著土壤生態(tài)毒性的降低，石油污染土壤微生物修復(fù)過程中土壤生態(tài)毒性的變化呈復(fù)雜化趨勢(shì)。石油污染土壤的生態(tài)毒性在修復(fù)的前中期達(dá)到最大，后期逐漸減弱，且在整個(gè)微生物修復(fù)過程中均存在一定的生態(tài)毒性。

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Study on Combined Bioindicators in Ecotoxicity Monitoring of Oil-contaminated Soil during Bioremediation

SHEN Weihang1, ZHU Nengwu1,2*, YIN Fuhua1, WANG Huajin1, DANG Zhi1,2
1. School of Environment and Energy, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China 2. Key Laboratory of Pollution Control and Ecosystem Restoration in Industry Clusters, Ministry of Education, Guangzhou 510006, China

Bacterial luminescence, content of photosynthetic pigments together with soil enzyme activity could be used to comprehensively reflecting the soil health condition. In order to explore the soil ecotoxicity patterns and biological indicator effects, bioremediation of oil-contaminated soil were conducted. Oil degrading bacterial consortium were built with three strains isolated from oil-contaminated soil. Bacterial luminescence, chlorophyll a and carotene contents, and soil catalase activity was employed to evaluate the ecotoxicity of soil sampled in different bioremediation phases. Good consistency can be obtained among phytotoxicity tests, soil enzyme activity and Photobacterium phosphoreum ecotoxicity tests. The results showed that the application of a mixed bacterial consortium was illustrated to effectively remediate oil-contaminated soil due to the high TPH removal efficiency, which reduced the crude oil concentration from 5 000 mg·kg-1soil to 1 781 mg·kg-1in only 40 d. The maximum inhibition of bacterial luminescence for Photobacterium phosphoreum in the dichloromethane/dimethyl sulfoxide extracts was observed at the initial stage of bioremediation and gradually dropped to normal. Compared with the control group, the chlorophyll a content of Triticum acstivnm L. was significantly inhibited in the different phases of bioremediation. In soils S1, the chlorophyll a content decreased by 39.3% to (1.36±0.04) mg·g-1. A significant negative correlation can be found between soil catalase activity and the residue of petroleum hydrocarbon. The correlation coefficient is -0.973. Soil extract on the 8th day of the bioremediation remained constant at a relative luminosity of 18.1%, with toxicity equivalent to that of 0.187 mg·L-1HgCl2. Therefore, bacterial luminescence, phytotoxicity (inhibition of chlorophyll a and carotene contents), and soil catalase activity could potentially be sensitive indicators to evaluate the effectiveness of bioremediation techniques.

oil contaminated soil; bioremediation; Photobacterium phosphoreum; combined-bioindicators

10.16258/j.cnki.1674-5906.2015.09.021

X171.5；X172

A

1674-5906（2015）09-1560-10

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廣東省自然科學(xué)基金團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（9351064101000001）；教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃項(xiàng)目（NCET-11-0166）

沈偉航（1988年生），男，碩士，主要研究方向?yàn)樯鷳B(tài)毒理與生物指示。Email: shen.wh@mail.scut.edu.cn *通訊作者。朱能武，E-mail: nwzhu@scut.edu.cn

2015-07-08