精白保胚米發(fā)芽過程中米谷蛋白及其氨基酸的變化

李向紅，劉永樂，俞 健，王發(fā)祥，王建輝，王滿生

（長沙理工大學食品與生物工程系，湖南省水生資源食品加工工程技術研究中心，湖南 長沙 410114）

精白保胚米發(fā)芽過程中米谷蛋白及其氨基酸的變化

李向紅，劉永樂*，俞 健，王發(fā)祥，王建輝，王滿生

（長沙理工大學食品與生物工程系，湖南省水生資源食品加工工程技術研究中心，湖南 長沙 410114）

研究精白保胚米發(fā)芽過程中米谷蛋白及其氨基酸組成的變化。精白保胚米在發(fā)芽過程中，淀粉含量呈下降趨勢，蛋白質的含量略有上升；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳和體積排阻色譜的結果顯示：發(fā)芽后米谷蛋白中含量較高的各亞基分子質量沒有太大差別，但其含量有所變化，高分子質量亞基含量減少，低分子質量亞基含量增多。米谷蛋白氨基酸分析結果發(fā)現(xiàn)：發(fā)芽可以增加精白保胚米總氨基酸和必需氨基酸的含量，必需氨基酸組成模式更加合理。分析結果表明發(fā)芽可以提高精白保胚米的食用品質和營養(yǎng)價值。

精白保胚米；發(fā)芽；谷蛋白；氨基酸分析

研究表明，精白保胚發(fā)芽米食用品質優(yōu)于精白保胚米、糙米和發(fā)芽糙米[1]，其營養(yǎng)價值有所提高[2]。精白保胚米發(fā)芽過程中，所含的淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等被激活和釋放，各種淀粉酶的作用使得精白保胚米中淀粉含量下降，總糖和葡萄糖含量增加[2]；同時，精白保胚米中的蛋白質也在蛋白酶的作用下發(fā)生了一系列的變化，影響了精白保胚米的食用品質和營養(yǎng)價值。目前，對于發(fā)芽糙米的研究較多，對于精白保胚米發(fā)芽過程中蛋白質分子質量以及氨基酸組分的變化尚未見報道；并且前人大都是對糙米米粉進行氨基酸組分分析[3]，單獨對米谷蛋白氨基酸分析的報道很少。由于精白保胚米的蛋白質主要是米谷蛋白，因此本實驗對精白保胚米中米谷蛋白的亞基、氨基酸組成以及γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA）的含量變化進行了分析，為精白保胚發(fā)芽米產品的開發(fā)以及綜合利用提供了一定的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

精白保胚米的原料為東北粳稻（空育131），購自黑龍江北大荒種業(yè)集團有限公司。

氨基酸標準品（生化試劑純）、β-巰基乙醇 國藥集團化學試劑有限公司；溴酚藍 汕頭市西隴化工廠有限公司；氫氧化鈉、濃鹽酸、十二烷基硫酸鈉、標準牛血清白蛋白、丙烯酰胺、N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺均為市售分析純級。

1.2 儀器與設備

精白保胚米制米機組 湖南省湘糧機械制造有限公司；MJ-Ⅱ霉菌培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；UV2600 紫外-可見分光光度計 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；FW100型高速萬能粉碎機 天津泰撕特儀器有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責任公司；DELTA 320 pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SK-1型快速混勻器 金壇市醫(yī)療儀器廠；LG10-24A高速離心機 北京金立離心機有限公司；FD-1真空冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；迷你型垂直電泳槽、YY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 北京市六一儀器廠；氨基酸自動分析儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 精白保胚米發(fā)芽工藝

精白保胚米發(fā)芽工藝參考文獻[4]。

1.3.2 常規(guī)成分檢測

蛋白質含量的測定：參照GB 5009.5—2010《食品中蛋白質的測定》中凱氏定氮法，氮換算為蛋白質的系數(shù)為5.95[5]；淀粉含量的測定：硫酸-蒽酮法[6]；還原糖含量的測定：直接滴定法[7]；脂肪含量的測定：GB/T 5512—2008《糧油檢驗 糧食中粗脂肪含量測定》中索氏抽提法[8]；水分含量的測定：GB 5009.3—2010《食品中水分的測定》中直接干燥法[9]。

1.3.3 米谷蛋白的提取

采用分步法提取米谷蛋白，工藝流程參考文獻[10]。

1.3.4 米谷蛋白分子質量的測定

采用垂直板十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）蛋白電泳法測定米谷蛋白分子質量，分離膠質量分數(shù)為12.5%和濃縮膠質量分數(shù)為4%。以相對分子質量64×104～14×104的標準蛋白為標準，樣品用0.05 mol/L NaOH預處理。電泳同時用考馬斯亮藍R250染色5 h左右，脫色至電泳帶清晰即可。

1.3.5 米谷蛋白分子質量分布的測定

采用體積排阻色譜-高效液相色譜（size exclusion chromatography-high performance liquid chromatography，SEC-HPLC）法測定米谷蛋白的相對分子質量分布。將米谷蛋白用磷酸鹽緩沖液（2% SDS，pH 7.0）溶解配制成5 mg/mL的分散液，8 000 r/min離心15 min后取上清液用0.45 μm微孔濾膜過濾，使用島津LC-20A高效液相系統(tǒng)與Shodex KW-804蛋白柱分析米谷蛋白樣品的分子質量分布。流動相為200 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液（2% SDS，pH 7.0），洗脫速率1 mL/min，在280 nm波長處檢測洗脫液，柱溫為20 ℃。

1.3.6 米谷蛋白氨基酸組分分析[11]

精密稱取樣品0.05 g左右樣品于20 mL安培瓶中，加入10 mL 6 mol/L鹽酸于酒精噴燈上封口，于110 ℃加熱12 h。取出冷后過濾，取0.2 mL于60 ℃水浴吹干，加入1.0 mL 流動相溶解并轉入1.5 mL離心管中，于12 000 r/min離心3 min，置于4 ℃條件下避光保存。取5 μL樣品于1.5 mL離心管中，加入50 μL衍生試劑，渦旋振蕩1 min。取20 μL注入氨基酸自動分析儀。記錄色譜圖，計算峰面積，以樣品的峰面積與標準的峰面積比較定量，以保留時間定性。

其中氨基酸評分（amino acid score，AAS）的計算公式為：

必需氨基酸指數(shù)（essential amino acid index，EAAI）的計算方法為：米谷蛋白的必需氨基酸含量與雞蛋蛋白質中必需氨基酸含量比值的幾何平均數(shù)。

1.3.7 γ-氨基丁酸含量的測定

色譜柱：Waters AccQ?TagTM氨基酸分析柱（3.9 mm×150 mm，4 μm）。流動相：流動相A為140 mmol/L醋酸鈉加17 mmol/L三乙胺，用稀H3PO4調整pH值到5.02；流動相B為乙腈；流動相C為水。流速為1 mL/min，紫外檢測波長248.0 nm，柱溫37 ℃，進樣量10 μL。

2 結果與分析

2.1 常規(guī)成分分析

表1 大米主要成分含量分析Table 1 Proximate composition of different rice samples %

由表1可知，發(fā)芽可略微增加精白保胚米中蛋白質的含量，大米蛋白中的氨基酸相比其他谷物蛋白來說較平衡，易被消化吸收[12]，說明發(fā)芽可以提高精白保胚米蛋白質的生物利用率[13]。同時，發(fā)芽過程中，隨著α-淀粉酶和β-淀粉酶活力的不斷提高，淀粉不斷被降解為還原糖等物質，淀粉含量有所減少，還原糖含量增加。

2.2 米谷蛋白分子質量測定結果分析

2.2.1 SDS-PAGE

根據(jù)低分子質量標準蛋白曲線以及用Gel-ProAnalyzer 4.5凝膠分析軟件對電泳圖進行分析，得到各個泳道中蛋白帶的分子質量與其相應的積分光密度值，結果見表2。

表2 精白保胚米及發(fā)芽米中米谷蛋白各個蛋白帶的積分光密度值分析Table 2 Optical density of each protein band of rice gluten in polished rice with intact germ and germinated rice

由表2可知，精白保胚米發(fā)芽后，米谷蛋白中含量較高的各亞基分子質量沒有太大差別，而含量有所變化。其中分子質量為64.4 kD和47.7 kD的部分其含量有所降低，這些部分對應的是米谷蛋白中α和β亞基的聚集體[14-15]，發(fā)芽過程中，蛋白酶活性增大，使得蛋白質聚集體分解為亞基，導致分子質量較小的亞基含量增加，甚至生成部分氨基酸。前人研究發(fā)現(xiàn)，大米中清蛋白、球蛋白和米谷蛋白在陳化過程中均表現(xiàn)出高分子質量部分含量增多，低分子質量亞基含量減少的趨勢[16]，而大米陳化過程中其食用品質有所下降，主要表現(xiàn)在米飯黏性的下降，可能與高分子質量部分含量增多，低分子質量亞基含量減少有關，因此精白保胚米發(fā)芽后食用品質有所提高可能也與其高分子質量部分含量減少，低分子質量亞基含量增多有關。

2.2.2 SEC-HPLC

采用SEC-HPLC進一步測定了米谷蛋白的分子質量分布，見圖1。圖中所列數(shù)據(jù)為每個峰的相對峰面積。結果進一步驗證了SDS-PAGE的結果，保留時間為6.0 min左右的大分子質量的部分隨著發(fā)芽的進行逐級減少，伴隨著小分子質量部分的增加，發(fā)芽24 h后，保留時間為9.0 min左右的部分增加較為明顯。

圖1 精白保胚米及發(fā)芽米中米谷蛋白的體積排阻色譜Fig.1 SEC-HPLC of rice gluten in polished rice with intact germ and germinated rice

2.3 米谷蛋白氨基酸組分變化分析

表3 精白保胚米及發(fā)芽米中米谷蛋白氨基酸含量變化Table 3 Amino acid contents of rice gluten in polished rice with intact germ and germinated rice g/100 g

由表3可知，精白保胚米及其發(fā)芽米的Leu、Ile、Met、Thr、Lys和Ser含量隨著發(fā)芽有所增加。由于谷蛋白中賴氨酸是第一限制氨基酸，因此通過發(fā)芽的方式可提高精白保胚米的蛋白質質量；同時，賴氨酸含量提高，有利于大米風味改善[17]。Glu是精白保胚米及其發(fā)芽米的主要氨基酸，在發(fā)芽過程中谷氨酸脫羧酶被激活，以谷氨酸為底物脫去羧基生成GABA，其含量在發(fā)芽后大幅升高，由于每日補充微量的GABA有利于心腦血壓的緩解，促進人體內氨基酸代謝的平衡，調節(jié)免疫功能[18-19]，因此精白保胚米在發(fā)芽后營養(yǎng)價值有顯著提高；此外，精白保胚米內的蛋白酶會水解部分蛋白質生成一定量的谷氨酸。精白保胚米發(fā)芽過程中谷氨酸含量是下降的，可能原因是谷氨酸脫羧酶在發(fā)芽過程中占主導作用，強于蛋白酶的水解作用。

表4 精白保胚米及發(fā)芽米中米谷蛋白必需氨基酸組成Table 4 Essential amino acid pattern of rice gluten in polished rice with intact germ and germinated rice g/100 g

精白保胚米中米谷蛋白的必需氨基酸組成（表4）與FAO/WHO模式相比較，Leu、Phe+Tyr和Val含量高于模式值，Lys和Thr含量均要低，Ile含量接近于FAO/WHO模式。發(fā)芽后，Lys含量略微增加，Leu、Phe+Tyr值略降低，Ile含量接近于FAO/WHO模式，從而說明精白保胚米在發(fā)芽后必需氨基酸（essential amino acid，EAA）組成模式比發(fā)芽前稍趨合理。

表5 精白保胚米及發(fā)芽米中米谷蛋白氨基酸評分和必需氨基酸指數(shù)Table 5 Amino acid scores and essential amino acid indexes of rice gluten in polished rice with intact germ and germinated rice

由表5可知，發(fā)芽后精白保胚米中Lys的AAS雖有增加，但仍是限制性氨基酸。發(fā)芽米的EAAI高于未發(fā)芽米，EAAI越大，表明蛋白質的質量和利用率越高，因此，發(fā)芽后精白保胚米的蛋白質營養(yǎng)品質得到較大改善。

蛋白質中氨基酸的組成特性對蛋白質的品質會產生很大的影響。精白保胚米發(fā)芽后，限制性氨基酸如賴氨酸和蘇氨酸含量增加，部分氨基酸含量高于FAO/WHO推薦模式，與發(fā)芽綠豆結果一致[20]，表明發(fā)芽可以進一步改善精白保胚米氨基酸的組成特性，顯著提高其蛋白質品質。

3 結 論

本實驗從發(fā)芽過程中米谷蛋白的分子質量及氨基酸組成變化的角度初步闡明了發(fā)芽對精白保胚米食用品質及營養(yǎng)價值的影響。精白保胚米在發(fā)芽過程中，淀粉含量呈下降趨勢，蛋白質的含量略有上升；發(fā)芽后米谷蛋白中含量較高的各亞基分子質量沒有太大差別，而含量有所變化，高分子質量亞基含量減少，低分子質量亞基含量增多；發(fā)芽可以增加精白保胚米蛋白質、總氨基酸和必需氨基酸的含量，必需氨基酸指數(shù)提高，與FAO/WHO模式相比，精白保胚發(fā)芽米的必需氨基酸組成模式稍趨合理，說明通過發(fā)芽可以提高精白保胚米的食用品質和營養(yǎng)價值。因此，發(fā)芽處理是改造精白保胚米風味、提高營養(yǎng)價值的有效途徑，為精白保胚米的開發(fā)和應用開辟了一條新的加工途徑。

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Changes in Protein and Amino Acids in Polished Rice with Intact Germ during Germination

LI Xianghong, LIU Yongle*, YU Jian, WANG Faxiang, WANG Jianhui, WANG Mansheng
(Hunan Provincial Engineering Technology Research Center of Aquatic Food Resources Processing, Department of Food and Biological Engineering, Changsha University of Science and Technology, Changsha 410114, China)

Changes in protein and amino acids in polished rice with intact germ during germination were investigated. The results showed that the starch content of polished rice with intact germ left intact decreased, while the protein content increased slightly during germination. SDS-PAGE and SEC-HPLC analysis demonstrated that the subunit compositions of polished rice were not affected signifi cantly by germination, but the subunit contents were changed. The fractions of high molecular weight decreased, and correspondingly, the contents of subunits with low molecular weight increased. The results of amino acid analysis showed that the contents of total amino acids and essential amino acids increased during germination, and the essential amino acid pattern became more reasonable, suggesting that germination can improve the eating quality and nutritional value of polished rice with intact germ.

polished rice with intact germ; germination; rice gluten; amino acid analysis

TS213.3

A

1002-6630（2015）01-0037-04

10.7506/spkx1002-6630-201501007

2014-02-16

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD31B08）；國家自然科學基金青年科學基金項目（31101214；31201427）；湖南省自然科學基金項目（13JJ4054；12JJ6028）；湖南省教育廳優(yōu)秀青年基金項目（14B009）

李向紅（1979—），女，副教授，博士，研究方向為農產品深加工與蛋白質工程。E-mail：xianghongl@163.com

*通信作者：劉永樂（1962—），男，教授，博士，研究方向為食品生物技術與大宗農產品加工技術。E-mail：lyle19@163.com