牛、羊乳及其乳制品中幽門螺桿菌污染及檢測技術(shù)研究進展

張 于，江 濤，冉 健，文月玲，沈留紅，余樹民，曹隨忠，姚學(xué)萍

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 雅安 625014）

牛、羊乳及其乳制品中幽門螺桿菌污染及檢測技術(shù)研究進展

張 于，江 濤，冉 健，文月玲，沈留紅，余樹民，曹隨忠，姚學(xué)萍*

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 雅安 625014）

近年來大量研究已經(jīng)表明幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）可能是種食源性致病菌，而牛、羊乳是其最可能的感染源。食物中較難分離培養(yǎng)出Hp，而聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)相關(guān)技術(shù)靈敏度高，能檢出樣品中微量的Hp，可用于檢測牛、羊乳中幽門螺桿菌的污染情況，但是與人類臨床方面檢測Hp技術(shù)的多樣性、特異性與成熟性相比，食品中H p快速而有效的檢測方法及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)還相對缺乏。本文主要就近年來牛、羊乳及其乳制品中 幽門螺桿菌污染及檢測技術(shù)的研究進展進行綜述，為進一步完善Hp傳播途徑與致病機制等研究提供一些參考。

幽門螺桿菌；牛乳；乳制品；檢測技術(shù)

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）可使人引起多種胃腸道疾病，如慢性胃炎、十二指腸潰瘍、胃黏膜相關(guān)淋巴樣組織（mucosal-associated lymphoid tissue，MALT）淋巴瘤及胃腺癌，同時也證實幽門螺桿菌與胃腸外疾病相關(guān)，如血液病、心腦血管病、肝膽疾病、皮膚病等[1]。幽門螺桿菌感染了世界范圍內(nèi)一半以上的人口，其發(fā)病率各個國家不同，甚至同一國家的各個地區(qū)也不相同。其發(fā)病率的高低與社會經(jīng)濟水平、人口密集程度、衛(wèi)生狀況和生活條件等相關(guān)。不同疾病是由H. pylori和宿主之間復(fù)雜的致病機制導(dǎo)致[2]。盡管感染的發(fā)病率很高，多種傳播路徑已經(jīng)被提出（包括胃-口、口-口、糞-口途徑），但是幽門螺桿菌感染人的宿主和傳播途徑仍不明確。根據(jù)其微生物學(xué)和流行病學(xué)特征，多個研究表明幽門螺桿菌可能是種食源性致病菌[3]。幽門螺桿菌在飲用水[4]、海水以及動物源性食品例如山羊[5]和牛[6]乳汁中已經(jīng)被檢測到。動物源性的首次污染或者不合理的處理方式（人類傳染源）引起的二次污染都可能使得食品成為幽門螺桿菌感染的來源[7]。該感染主要發(fā)生于兒童期間，而牛、羊乳通常作為人類食物食用，尤其是小孩。一些研究已經(jīng)表明，在乳制品和牛乳產(chǎn)品中有幽門螺桿菌的存在及生存[3,8]。因此Hp可能通過牛、羊乳及其乳制品從動物傳播至人。Fujimura等[6]表明幽門螺桿菌在奶牛糞便和土壤中的檢出率分別為50%和38%。此外，研究也表明在肉類、蔬菜和其他食品中幽門螺桿菌也能存活一段時間[9-10]。

1 幽門螺桿菌的生物學(xué)性狀

1.1 培養(yǎng)特性

幽門螺桿菌為微需氧性革蘭氏陰性菌，通常為螺旋狀，有時可能呈現(xiàn)棒狀，體外長期培養(yǎng)或抗生素治療后可能呈現(xiàn)球菌狀[11]。研究表明球菌樣形式可能代表了一種活的非培養(yǎng)狀態(tài)（viable but non-culturable state，VBNC），但是它們是否代表死細胞或一種有抵抗力的狀態(tài)還不清楚[12]。球形變異的本質(zhì)仍不清楚，其在Hp傳播途徑（尤其通過動物或食物）中的作用仍存在爭議。幽門螺桿菌的酸適應(yīng)使得細胞質(zhì)pH值維持在中性水平，進而使菌體能生存于高酸性的胃酸中[13]。

1.2 分子生物學(xué)特征

幽門螺桿菌不同菌株間存在廣泛的遺傳變異性。Hp的全基因序列已經(jīng)測出，其中尿素酶基因有4 個開放性閱讀框，分別是UreA、UreB、UreC和UreD。UreA和UreB編碼的多肽與尿素酶結(jié)構(gòu)的兩個亞單位結(jié)構(gòu)相當(dāng)[14]。幽門螺桿菌的尿素酶極為豐富，尿素酶催化尿素水解形成“氨云”保護細菌在高酸環(huán)境下生存[15]。此外，Hp的毒力取決于其產(chǎn)生空泡毒素（VacA）和細胞毒素相關(guān)蛋白（CagA）的能力。根據(jù)這兩種基因蛋白存在與否，又將幽門螺桿菌菌株分成：Ⅰ型（CagA+和VacA+）和Ⅱ型（CagA－和VacA－），現(xiàn)多認(rèn)為Ⅰ型菌株與胃疾病關(guān)系較為密切[16-17]。這些基因的分子特征不僅僅在Hp的診斷方面起著至關(guān)重要的作用，還有利于探索不同宿主種類或食品中分離或檢測到的菌株間的基因關(guān)系。

2 流行病學(xué)特征

幽門螺桿菌定殖于世界半數(shù)人口的胃中，而該定植并不總是與病理學(xué)的發(fā)展相關(guān)，超過70%的受感染人群是無癥狀的[3]。但是一經(jīng)感染，若不根除治療，將終生攜帶。Hp感染主要發(fā)生于兒童期間，成人感染非常少。Hp感染的流行呈現(xiàn)顯著的家庭內(nèi)聚集現(xiàn)象，Hp陽性父母是其孩子感染的重要原因[16]。Hp的感染率在不同人群、不同人種、不同地區(qū)有很大差異，在發(fā)展中國家通常高于80%，在發(fā)達國家低于40%，感染率呈現(xiàn)全球持續(xù)下降的模式[11]。這可能與社會經(jīng)濟水平[18]，人口密集程度，衛(wèi)生狀況和生活條件等相關(guān)。至今幽門螺桿菌的傳播途徑還未徹底研究清楚，有證據(jù)支持通過胃-口，口-口以及糞-口傳播，但是沒有確切的數(shù)據(jù)證明通過這些途徑傳播的優(yōu)勢。人類感染Hp的最小劑量還未確定，105CFU可能接近最小感染量[19]。近年來大量研究證明食品污染在人類幽門螺桿菌感染中起重要作用，是幽門螺桿菌傳播的途徑之一，而牛、羊乳是其中最可能的感染來源[5,20]。

3 牛、羊乳及其乳制品中幽門螺桿菌的污染

幽門螺桿菌在牧民中的感染率極高。通過13C-urea呼吸測試對42 名牧民及其28 名家庭成員幽門螺桿菌的檢測研究發(fā)現(xiàn)，Hp在牧民中感染率達97.6%，家庭成員感染率為86%，而沒有與羊接觸的對照中感染率相對較低，為65.1%[21]。與此同時，與羊接觸的牧民孩子的幽門螺桿菌感染率是城市孩子的兩倍[22]。由此推測牧民孩子的幽門螺桿菌感染可能是來自羊[3]。這些研究使得幽門螺桿菌感染被認(rèn)為是人畜共患病。

研究表明綿羊原乳和胃組織中均已發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌DNA，此外，恒河猴、狒狒、貓等動物胃內(nèi)Hp檢測陽性，說明它們可能是Hp的自然宿主，是但其確切的傳播方式還需進一步研究[23-24]。Ghasemian等[8]研究發(fā)現(xiàn)，92 份奶牛血清樣品中，25 份（27%）為Hp IgG抗體陽性，67 份為陰性；對于血清學(xué)反應(yīng)為陽性的奶牛，10 份糞便（40%）、4 份乳汁（16%）為Hp抗原陽性，4 份既是乳汁Hp抗原陽性，也是糞便Hp抗原陽性。由此推測，奶牛血清中幽門螺桿菌抗體的存在可能暗示著幽門螺桿菌在奶牛體內(nèi)共生，其可能是幽門螺桿菌的自然宿主。

表1 牛奶樣品中幽門螺桿菌污染情況Table 1 Detection ofHelicobacter pylori ori contamination in milk

Dore等[23]采用16S rRNA檢測63 份綿羊原乳，38 份原乳檢出幽門螺桿菌DNA，而再用Hp vacA基因檢測38 份原乳發(fā)現(xiàn)5 份陽性，序列分析顯示與Hp特異性DNA序列同源性達99%，這可能因為16S rRNA針對幽門螺桿菌屬特異性，Hp可能存在不同的分子分型。從原乳樣品中分離出幽門螺桿菌是極其罕見的[6]，Turutoglu等[25]從440 份山羊原乳樣品中都未分離培養(yǎng)出任何幽門螺桿菌。牛奶是一種保質(zhì)期短的食品，幽門螺桿菌能短期存活于牛乳中[26]。祝雯雯等[9]研究人工模擬不同環(huán)境介質(zhì)中幽門螺桿菌的生存狀況發(fā)現(xiàn)，Hp在牛乳中的存活時間最長，且存活時間與環(huán)境介質(zhì)溫度成負(fù)相關(guān)。為此，被人類或動物污染的牛乳可能確實是幽門螺桿菌傳播的重要來源。近年來報道的關(guān)于牛、羊乳及其乳制品中幽門螺桿菌的污染情況如表1所示。

4 牛奶中幽門螺桿菌的檢測

4.1 細菌培養(yǎng)法

Hp分離培養(yǎng)是診斷Hp感染最經(jīng)典、最可靠的方法之一，可作為驗證其他診斷性實驗的金標(biāo)準(zhǔn)。Hp的培養(yǎng)基一般分為固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基兩種。鄺玉等[28]采用添加有10%脫纖維兔血和混合抗生素的哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基，置于厭氧罐37 ℃培養(yǎng)72 h 能生長出典型的幽門螺桿菌。由于血液容易污染，費用較高，且易造成溶血，影響培養(yǎng)效果，所以已有研究用卵黃替代血制備培養(yǎng)液[29]。液體培養(yǎng)成功的關(guān)鍵在于氣體能否在培養(yǎng)基中彌散。梁昌盛等[30]證實采用抽氣換氣法可以有效保證培養(yǎng)所需的氣體環(huán)境。Joo等[31]發(fā)現(xiàn)了一種切實可行的多功能液體培養(yǎng)技術(shù)—薄層液體培養(yǎng)技術(shù)，用于研究Hp的細菌特性。從食品中分離幽門螺桿菌極其困難，而且Hp對體外生長條件要求嚴(yán)苛、培養(yǎng)困難，培養(yǎng)時往往變異為非可培養(yǎng)的球形[12]，因此傳統(tǒng)培養(yǎng)方式用于快速而準(zhǔn)確的檢測與鑒定有一定局限性。

4.2 PCR檢測

近年來聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)已經(jīng)用于Hp的診斷，該技術(shù)的敏感性比寡核苷酸探針增加了100 倍，可以檢出少至100 個Hp[32]，并且不必要求活菌。目前Hp的尿素酶基因和16S rRNA基因的部分序列已經(jīng)測出，為PCR特異性引物的選擇提供了依據(jù)。

4.2.1 直接PCR

目前幽門螺桿菌的多 種基因，如尿素酶（A、B、C、D）基因、16S rRNA基因、VacA及CagA基因均已克隆成功，根據(jù)幽門螺桿菌不同的靶基因，設(shè)計不同的引物，從而建立不同的PCR系統(tǒng)，用以檢測Hp都取得了成功。Hoshina等[33]首次應(yīng)用PCR技術(shù)擴增16S rRNA基因檢測Hp。Dore等[5]應(yīng)用16S rRNA基因的特異引物進行PCR檢測發(fā)現(xiàn)60%綿羊原乳存在幽門螺桿菌；此后，Ebrahim等[34]應(yīng)用ureC基因特異引物進行PCR，不僅在奶牛、山羊和綿羊原乳中檢測到幽門螺桿菌，而且首次在駱駝和水牛原乳中發(fā)現(xiàn)Hp DNA。史艷宇等[35]以尿素酶基因序列為靶位點設(shè)計引物，建立的幽門螺桿菌PCR檢測方法敏感度為8 CFU/mL。

4.2.2 逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）

采用PCR最主要的缺 陷在于其不能區(qū)分可培養(yǎng)的或者死的細菌，從而提出通過RT-PCR來解決此問題。RNA作為生物活性的標(biāo)志，RT-PCR最大的優(yōu)點就在于利用RNA反轉(zhuǎn)錄出cDNA作為擴增的目標(biāo)片段，從而解決死菌DNA帶來的假陽性問題[36]。張少華等[37]取患者胃黏膜組織用qRT-PCR檢測幽門螺桿菌Hp 16S rRNA基因陽性率為67.9%，與之前江南等[38]報道結(jié)果一致。

4.2.3 巢式PCR（nested-PCR）

巢式PCR用兩套引物，第一套用于產(chǎn)生擴增的DNA片段，此片段中含有第二輪PCR引物的結(jié)合位點，第一輪反應(yīng)產(chǎn)物被等分轉(zhuǎn)入第二輪PCR引物，擴增靶DNA，連續(xù)兩次放大，具有更好的靈敏性和特異性[39]。Fujimura等[6]設(shè)計兩對上游引物（A-2F2和A-2F3），一對下游引物（A-2R），A-2F2、A-2R用于首次擴增，A-2F3、A-2R作為內(nèi)引物，通過半巢式PCR（semi-nested PCR）擴增ureA基因，發(fā)現(xiàn)奶牛原乳和巴氏消毒牛奶中各有72.2%和55%存在Hp DNA；Quaglia等[26]通過巢式PCR檢測人工污染的綿羊、山羊和奶牛原乳glmM基因，得出幽門螺桿菌的檢測敏感性可達到3 CFU/mL。

4.2.4 其他方法

Quaglia等[40]使用多重PCR（multiplex PCR，MT-PCR）檢測綿羊原乳中幽門螺桿菌，得出其檢測敏感度為15 CFU/mL。劉靜秋等[41]根據(jù)Hp尿素酶基因設(shè)計特異性引物及探針，成功建立了食品中幽門螺桿菌的熒光PCR檢測方法，特異性強，檢測敏感度可達到3 CFU/mL。Sehee等[42]研究使用疊氮溴化丙錠（propidium monoazide，PMA）結(jié)合實時PCR（realtim e PCR）能有效區(qū)分出幽門螺桿菌的可培養(yǎng)形式及死菌形式。PCR及RT-PCR技術(shù)要求高，且具有高度敏感性，臨床標(biāo)本易污染，因此應(yīng)該嚴(yán)格設(shè)置陽性和陰性對照從而保證檢測結(jié)果的可靠性。除此之外，水或食品中幽門螺桿菌的檢測方法還包括微生物學(xué)法、免疫磁分離技術(shù)結(jié)合PCR、放射自顯影技術(shù)以及ATP生物熒光檢測等[23]，但是都存在一定缺陷：微生物學(xué)法雖具高選擇性但是敏感性較低；免疫磁分離技術(shù)結(jié)合PCR雖然可以聚集食品中的微生物，但是費用高、要求嚴(yán)格且耗時；后兩者雖已成功應(yīng)用于水源、人類糞便中Hp的檢測，但是還未 用于食品中，并且ATP不能區(qū)別食品中不同細胞來源。為此相對于人類臨床方面Hp的檢測技術(shù)，至今國內(nèi)尚無食品中幽門螺桿菌快速、簡便而有效的檢測方法及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

5 結(jié) 語

幽門螺桿菌已被確定與多種胃腸道疾病相關(guān)。研究已經(jīng)證明食品為幽門螺桿菌的生存提供了環(huán)境，食物和水可能在幽門螺桿菌傳播過程中起著媒介作用，而牛、羊乳是其中最可能的感染來源。直接與奶牛糞便接觸或間接與土壤接觸是牛、羊乳污染的主要來源，牛、羊乳可以在生產(chǎn)過程中被污染或者產(chǎn)品后期衛(wèi)生管理不充分，這些都可能傳播幽門螺桿菌至人類。但是幽門螺桿菌很難從食品中分離出來，尤其是還未從牛、羊乳以外的其他食品中分離出Hp，一方面可能由于幽門螺桿菌分離的方法缺乏足夠的敏感性從而獲得較少數(shù)量的幽門螺桿菌；另外，球菌樣形式在幽門螺桿菌傳播途徑中的作用一直存在爭議。故而至今還缺乏有利的數(shù)據(jù)證明食品污染在幽門螺桿菌傳播中的具體作用。研究顯示Hp可隨糞便排出，那么Hp感染究竟源于動物源性的首次污染還是處理不恰當(dāng)引起的二次污染也需進一步研究，為此，未來應(yīng)該進行更多關(guān)于動物性食品中幽門螺桿菌的存在與生存研究，檢測屠宰消費動物肉食品的Hp并與病人的Hp基因關(guān)系進行分析。探討動物性食品中幽門螺桿菌污染情況不僅 有利于保障食品安全，更為進一步完善幽門螺桿菌傳播途徑與致病機制等的研究提供參考，同時在有效預(yù)防幽門螺桿菌感染方面也有著重要意義。

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Recent Progress in Contamination and Detection Techniques of Helicobacter pylori in Milk and Dairy Products

ZHANG Yu, JIANG Tao, RAN Jian, WEN Yueling, SHEN Liuhong, YU Shumin, CAO Suizhong, YAO Xueping*
(Key Laboratory of Animal Disease and Human Health of Sichuan Province, College of Veterinary Medicine, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

In recent years, a larg e number of studies have shown that Helicobacter pylori may be a food-borne pathogen, and milk is one of the most likely sources of its infection. Isolation and culture of H. pylori from food samples is exacting and time-consuming. At present, PCR and related technologies, which have high s ensitivity, are applied to detect trace amounts of H. pylori in food samples such as milk. However, there is lack of rapid and effective detection methods an d related standards for H. pylori in food samples although a variety of specifi c and mature assays are currently available for clinical use. This review focuses on recent progress in contamination and detection techniques of H. pylori in milk and dairy produ cts, so as to provide some referen ces for further research on transmission and pathogenic mechanisms of H. pylori.

Helicobacter pylori; cow’s milk; dairy products; detection techniques

Q93.332

A

1002-6630（2015）01-0268-05

10.7506/spkx1002-6630-201501051

2014-01-19

四川省科技廳科技支撐計劃項目（2011NZ0060；2013NZ0032）；教育部“長江學(xué)者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃”項目（IRT0848）

張于（1991—），女，碩士研究生，研究方向為動物性食品衛(wèi)生學(xué)。E-mail：zhangyu6304@163.com

*通信作者：姚學(xué)萍（1974—），女，高級實驗師，碩士，研究方向為動物性食品衛(wèi)生學(xué)。E-mail：170802926@qq.com