等電點(diǎn)沉淀法魚分離蛋白結(jié)構(gòu)與功能變化研究進(jìn)展

王 偉，劉俊榮，馬永生，吳 忠，田元勇

（大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連 116023）

等電點(diǎn)沉淀法魚分離蛋白結(jié)構(gòu)與功能變化研究進(jìn)展

王 偉，劉俊榮*，馬永生，吳 忠，田元勇

（大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連 116023）

以蛋白質(zhì)分離提取為出發(fā)點(diǎn)，系統(tǒng)回顧了國內(nèi)外有關(guān)分離蛋白特別是魚分離蛋白的研究現(xiàn)狀，闡述基于等電點(diǎn)絮凝沉淀原理的蛋白分離技術(shù)在食品蛋白配料中的重要性。集中探討了分離后蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的變化，現(xiàn)有研究均表明分離過程中蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的變化與分離魚蛋白產(chǎn)物的食品功能特性具有相關(guān)性。因此研究魚分離蛋白的結(jié)構(gòu)變化規(guī)律，對于通過調(diào)控以改善魚蛋白配料的食品功能特性有重要指導(dǎo)意義。

蛋白分離；食品蛋白配料；功能；魚蛋白

基于等電點(diǎn)絮凝沉淀原理的蛋白質(zhì)分離技術(shù)廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域。該技術(shù)最早應(yīng)用于植物蛋白的提取分離，如商品化的大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI），因其卓越的功能特性，作為食品蛋白配料已被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)領(lǐng)域[1]。近年來，蛋白質(zhì)分離技術(shù)也越來越多地用于開 發(fā)水產(chǎn)蛋白資源[2]。據(jù)中國漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒，2012年全國水產(chǎn)品總產(chǎn)量5 907.68萬 t[3]。從 開發(fā)功能性蛋白配料角度出發(fā)，針對蛋白成分的開發(fā)與利用是低值原料及水產(chǎn)加工副產(chǎn)物精深加工利用的有效途徑，也是目前我國水產(chǎn)品加工領(lǐng)域亟待解決的問題。

pH調(diào)節(jié)法是源于等電點(diǎn)絮凝沉淀原理有效分離魚蛋白的蛋白質(zhì)分離技術(shù)[4]，其特有優(yōu)勢在于可回收肌漿蛋白以提高蛋白質(zhì)的回收率，能有效地去除中性脂肪等，且回收蛋白質(zhì)的功能性較好[2]。這種技術(shù)的出現(xiàn)，在解決水產(chǎn)蛋白質(zhì)分離提取、開發(fā)新型功能性魚蛋白食品配料等領(lǐng)域，具有十分廣泛的前景。而魚蛋白在分離過程中，由于受pH值、溫度、離子強(qiáng)度等因素影響，分子結(jié)構(gòu)、空間構(gòu)象及理化性質(zhì)等會發(fā)生一系列的變化，這些變化對蛋白質(zhì)的營養(yǎng)性、安全性以及功能特性等將產(chǎn)生影響，因此探討蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能特性的關(guān)聯(lián)十分必要。本文針對國內(nèi)外有關(guān)蛋白分離，特別是魚分離蛋白的研究情況做了系統(tǒng)回顧。

1 蛋白質(zhì)分離技術(shù)與魚蛋白資源利用

1.1 蛋白質(zhì)分離技術(shù)與功能性食品蛋白質(zhì)配料

食品蛋白配料被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代食品工業(yè)中，根據(jù)蛋白配料的不同功能特性，分別用于各類食品的生產(chǎn)制造。所謂等電點(diǎn)絮凝沉淀原理是根據(jù)蛋白質(zhì)的兩性特點(diǎn)，在一定pH值條件下，其氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)帶凈正電或凈負(fù)電荷，使得蛋白溶解。在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)（pI）時，蛋白質(zhì)凈電荷為零，此時其溶解度最小，進(jìn)而聚集沉淀[5]，基于這個原理可有效分離純化蛋白質(zhì)。早在1952年，Anon[6]利用等電點(diǎn)法從豌豆、堅(jiān)果及大豆等植物提取分離蛋白；1956年Bolley[7]發(fā)現(xiàn)并解決了早期植物分離蛋白的風(fēng)味缺陷；1957年大豆分離蛋白實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化[8]。隨著技術(shù)的不斷成熟，作為功能性食品配料大豆分離蛋白已廣泛應(yīng)用于焙烤食品、糖果、肉類加工制品、仿肉制品及嬰幼兒配方奶粉等[9]。

早期關(guān)于魚肉分離蛋白的研究重在分離，忽視了分離產(chǎn)物的加工性能對功能性的影響。1959年Vogel等[10]以脂肪含量低于4%的魚為原料，經(jīng)等電點(diǎn)沉淀回收得到分離魚蛋白，進(jìn)一步進(jìn)行真空干燥處理，蛋白質(zhì)不可避免地發(fā)生了熱變性，因此親水性遭到破壞。同樣，1968年 Libenson等[11]先利用40～100 ℃的熱堿溶液對魚碎肉進(jìn)行處理，脫除脂肪等非蛋白組分，再利用等電點(diǎn)法進(jìn)一步分離提純，得到的分離蛋白也徹底喪失了持水性。直到20世紀(jì)90年代，魚分離蛋白的研究在過程條件控制與分離產(chǎn)物功能性方面才獲得極大的進(jìn)展。1999年，Hultin等[4]采用在低溫偏離蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的酸（pH＜2.5）或堿（pH＞10.5）條件下使蛋白 質(zhì)充分溶出，然后通過離心或過濾將 骨刺、皮和脂肪等不溶物去除，再將pH值調(diào)至蛋白質(zhì)等電點(diǎn)（約5.2～5.5）進(jìn)行沉淀回收，制備魚分離蛋白（fish protein isolate，F(xiàn)PI）。值得注意的是，整個提取分離過程是在低溫（4 ℃）下進(jìn)行的，由此蛋白質(zhì)變性程度小、且蛋白回收率較高。與早期相比，蛋白分離產(chǎn)物在功能特性方面表現(xiàn)出突出的優(yōu)勢，可歸納為[12]：1）操作簡單高效，原料絞碎均質(zhì)后即可直接進(jìn)行溶解處理；2）有效去除骨刺、皮和脂類等雜質(zhì)，由于脂質(zhì)氧化帶來的風(fēng)味和質(zhì)地下降問題可得到有效控制；3）有效回收可溶性肌漿蛋白，顯著提高了蛋白質(zhì)的回收率，如Kristinsson等[13]研究顯示，以斑點(diǎn)叉尾鮰為原料，pH調(diào)節(jié)法能將魚蛋白回收率由傳統(tǒng)魚糜水洗法的62%提高至70%～86%；4）分離得到的魚蛋白具有優(yōu)良的功能特性。很多研究表明，分離魚蛋白的凝膠特性優(yōu)于傳統(tǒng)魚糜[14-15]。

總而言之，等電點(diǎn)沉淀法分離魚蛋白技術(shù)在蛋白質(zhì)回收及功能特性方面表現(xiàn)出巨大優(yōu)勢，同時可彌補(bǔ)魚蛋白在功能性食品蛋白配料中的空缺。目前已成為國內(nèi)外水產(chǎn)加工領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。

1.2 蛋白分離技術(shù)在魚蛋白領(lǐng)域中的研究進(jìn)展

國外關(guān)于魚分離蛋白的研究眾多，針對海水魚已有系列報(bào)道。對鯔魚（Mugil cephalus）[16]、石首魚（Umbrina）[17]、石斑魚（Epinephelus adscensionis）[18]等白肉魚分離蛋白的回收率及功能特性研究顯示，相比水洗魚糜，酸溶蛋白的回收率高，堿溶蛋白的凝膠性更好，但太平洋牙鱈（Merluccius productus）[19]分離蛋白沒有水洗魚糜的凝膠性好。另外，Kim等[20]報(bào)道不同pH值對太平洋鱈魚（Gadus morhua）分離蛋白凝膠特性影響，發(fā)現(xiàn)在pH 11條件下溶解魚肉能獲得最佳的凝膠特性?？梢姴煌贩N、pH值條件對于分離蛋白產(chǎn)物的凝膠特性有重要影響。對沙丁魚（Sardina pilchardus）[21]、竹莢魚（Trachurus japonicus）、日本鯖魚[22]等紅肉魚分離蛋白的研究表明，與水洗魚糜相比，蛋白回收率高但凝膠性差。Undeland等[23]以鯡魚（Clupea harengus）為原料制備分離蛋白的研究結(jié)果卻相反，其堿溶蛋白具有優(yōu)良的凝膠性。此外，Taskaya等[24]制備鰱魚分離蛋白的研究發(fā)現(xiàn)回收蛋白若不加功能性添加劑，凝膠性則較差。Foh等[25]報(bào)道發(fā)現(xiàn)羅非魚（Oreochromis niloticus）堿溶分離蛋白的乳化性、起泡性較好。

國內(nèi)關(guān)于魚分離蛋白的研究報(bào)道日益增多。起初陳申如等[26]研究了酸溶提取鰱魚肌肉蛋白的最適條件；付湘晉等[27]發(fā)現(xiàn)等電點(diǎn)沉淀法提取鰱魚分離蛋白的保水性比水洗魚糜差，酸溶蛋白有較好的乳化性。傅潤澤等[28]優(yōu)化了鰱魚肌肉蛋白分離條件，確定pH 2.5酸溶或pH 11.5～12.5范圍內(nèi)堿溶處理，蛋白質(zhì)回收率可達(dá)到89.5%～90.5%。劉俊榮等[29]制備了羅非魚分離蛋白，結(jié)果表明與中性漂洗相比，回收的分離蛋白具有較好的溶解和分離效果且堿溶回收蛋白的功能性優(yōu)于酸溶處理。另外，還有對低值的南美白對蝦（Penaeus vannamei Boone）[30]、箭齒鰈（Atheresthes stomias）[31]、蝦夷扇貝（Patinopecten yessoensis）外套膜[32]分離蛋白功能特性的研究報(bào)道。

從大量的研究報(bào)道可見國內(nèi)外研究焦點(diǎn)主要集中在分離魚蛋白產(chǎn)物的凝膠特性及蛋白回收率兩個方面。結(jié)果表明蛋白回收率均提高但分離蛋白的凝膠特性各有差異，堿溶蛋白相比酸溶蛋白的凝膠特性好，但與水洗魚糜相比，不同因素對凝膠特性影響不同，目前對分離魚蛋白的凝膠機(jī)制尚不十分清楚。

2 分離魚蛋白結(jié)構(gòu)變化與功能特性

2.1 分離過程中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的研究進(jìn)展

魚蛋白分離產(chǎn)物的功能性是蛋白分離技術(shù)的研究價值所在。在分離處理過程中，蛋白質(zhì)所發(fā)生的空間結(jié)構(gòu)變化勢必影響到分離產(chǎn)物的功能特性。Choi等[33]對太平洋鱈魚（Gadus macrocephalus）的肌肉蛋白質(zhì)分離機(jī)理做了研究，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)其肌球蛋白重鏈和肌動蛋白在提取過程中發(fā)生了降解，表面疏水性和巰基含量分析表明二者均下降。另外針對巖魚（Sebastes fl avidus）[18]的研究發(fā)現(xiàn)，巖魚蛋白在分離過程中肌原纖維蛋白和肌漿蛋白均發(fā)生變性，表現(xiàn)為溶解性下降和熱吸收峰的消失；此外，巰基含量分析發(fā)現(xiàn)，與魚肉和水洗魚糜相比，堿溶處理所得分離蛋白的二硫鍵交聯(lián)程度最大，其凝膠特性的分析結(jié)果也驗(yàn)證了這一點(diǎn)，表現(xiàn)出較高的破斷力和形變值。Rawdkuen等[34]針對羅非魚（Orechromis niloticus）的研究結(jié)果表明，酸溶提取分離蛋白的肌原纖維蛋白發(fā)生了部分降解。孫月娥等[35]研究發(fā)現(xiàn)酸提鰱魚蛋白的肌球蛋白重鏈明顯降解，肌動蛋白含量顯著降低。王瑛[36]對羅非魚肌球蛋白在pH值調(diào)節(jié)下結(jié)構(gòu)和性質(zhì)變化進(jìn)行了報(bào)道，發(fā)現(xiàn)偏離等電點(diǎn)時，肌球蛋白的表面疏水性逐漸增大、巰基含量逐漸減小、色氨酸熒光強(qiáng)度減弱。這表明肌球蛋白疏水基團(tuán)暴露、分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化?？梢?，在分離提取過程中魚肉蛋白的組分及結(jié)構(gòu)均會發(fā)生變化，而國內(nèi)外關(guān)于分離后蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化及其變化對分離蛋白產(chǎn)物功能特性影響的基礎(chǔ)研究較少。因此，有必要探討等電點(diǎn)沉淀法分離蛋白后蛋白結(jié)構(gòu)與性質(zhì)變化和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能特性的關(guān)系等基本理論。

2.2 肌球蛋白在分離過程中的變化

魚肉中的蛋白質(zhì)根據(jù)溶解性的不同分為3 類：鹽溶性的肌原纖維蛋白、水溶性的肌漿蛋白和不溶性的肌基質(zhì)蛋白。其中肌原纖維約占魚肉總蛋白質(zhì)的65%～80%，而肌球蛋白是肌原纖維中最豐富的功能性蛋白質(zhì)。肌球蛋白復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，特別是在其氨基端，肌球蛋白桿部折疊起來呈球狀結(jié)構(gòu)，賦予了肌球蛋白纖維狀和球狀結(jié)構(gòu)特征[37]。許多研究發(fā)現(xiàn)，肌球蛋白主要決定了肌肉組織的持水性、凝膠性、乳化性與發(fā)泡性等[38]。2003年，Kristinsson等[37]報(bào)道了大西洋鱈魚（Gadus morhua）肌球蛋白經(jīng)pH值調(diào)節(jié)分離過程中的構(gòu)象和結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)pH 2.5酸溶處理使蛋白展開，肌球蛋白桿部由于靜電斥力作用可能完全解離，但在pH 11堿溶條件下無解離。同時極端pH值下均導(dǎo)致肌球蛋白重鏈的球狀頭部組分有顯著的構(gòu)象變化。當(dāng)pH值調(diào)整至中性，肌球蛋白的重鏈球狀頭部發(fā)生重折疊，但并未恢復(fù)到其天然狀態(tài)，而球狀頭部區(qū)域不可逆的變化使得其暴露出更多的巰基，導(dǎo)致疏水性增強(qiáng)、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較差。Mohan等[39]研究鯔魚肌球蛋白時也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。鯔魚肌球蛋白頭部比桿狀尾部對酸堿更敏感。發(fā)生重折疊后，酸處理肌球蛋白的三級結(jié)構(gòu)依然有部分保持解離狀態(tài)，堿處理肌球蛋白卻沒有類似結(jié)果。大量研究都將在這期間肌球蛋白的分子結(jié)構(gòu)部分展開繼而發(fā)生重折疊的狀態(tài)，即蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)被破壞，但仍然保持其類似天然的二級結(jié)構(gòu)和致密性，稱之為熔球態(tài)（molten globule）[40-42]。在蛋白質(zhì)去折疊和重折疊過程中，都存在這樣相似的中間構(gòu)象，主要通過疏水相互作用保持穩(wěn)定。下面具體探討下肌球蛋白二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)發(fā)生的變化。

2.2.1 肌球蛋白的二級結(jié)構(gòu)在分離過程中的變化

蛋白質(zhì)一般具有4 級結(jié)構(gòu)，其高級結(jié)構(gòu)主要靠共價鍵、氫鍵、靜電作用、疏水作用等維持。蛋白質(zhì)特定的結(jié)構(gòu)是其行使其功能的物質(zhì)基礎(chǔ)，蛋白質(zhì)的各種功能又是其結(jié)構(gòu)的表現(xiàn)。從某種程度上說，蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)、四級結(jié)構(gòu)比一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系更大。肌球蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要是α-螺旋結(jié)構(gòu)，兩條重鏈尾部折疊形成。目前測定蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的方法常用的主要有圓二色譜 、紅外光譜（infrared spectroscopy，IR）、拉曼光譜（Raman spectroscopy）和核磁共振，前3 種方法可以確定蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的類型和相對含量，核磁共振的化學(xué)位移則可以確定二級結(jié)構(gòu)在一級結(jié)構(gòu)中的具體位置[43]。Kristinsson等[37]對大西洋鱈魚（Gadus morhua）肌球蛋白的研究就通過遠(yuǎn)紫外圓二色譜分析得出：肌球蛋白經(jīng)極端酸或堿處理其二級結(jié)構(gòu)基本未發(fā)生變化，其桿部仍然為α-螺旋結(jié)構(gòu)。尤其是與變性劑鹽酸胍處理的蛋白相比，經(jīng)酸/堿處理的肌球蛋白二級結(jié)構(gòu)沒有顯著性變化。Raghavan等[44]研究酸誘導(dǎo)鯰魚肌球蛋白發(fā)現(xiàn)，不同種類的酸處理肌球蛋白的二級結(jié)構(gòu)沒有顯著性變化，但在肌球蛋白展開前添加NaCl其α-螺旋含量會顯著性增加，表明鹽可以阻礙肌球蛋白變性展開而起到保護(hù)作用。同樣，Raghavan等[45]研究堿誘導(dǎo)鯰魚肌球蛋白發(fā)現(xiàn)，NaOH處理的肌球蛋白的二級結(jié)構(gòu)在不同pH值下沒有顯著性變化。

2.2.2 肌球蛋白的三級結(jié)構(gòu)在分離過程中的變化

蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)是多肽鏈在二級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上通過側(cè)鏈基團(tuán)的相互作用進(jìn)一步卷曲折疊，借助次級鍵維系使α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲等相互配置而形成的特定的構(gòu)象。肌球蛋白的三級結(jié)構(gòu)主要在于球狀頭部，在蛋白分離提取過程中球狀頭部會發(fā)生展開再折疊，這期間必然引起肌球蛋白的三級結(jié)構(gòu)的變化。如Kristinsson等[37]研究鱈魚（Gadus morhua）肌球蛋白采用近紫外圓二色譜分析肌球蛋白的三級結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果表明極端酸（pH 2.5）處理和堿（pH 11）處理均使肌球蛋白的三級結(jié)構(gòu)有顯著的變化，所有蛋白質(zhì)顯然失去了其三級相互作用。這就可以解釋“熔球態(tài)”的形成。

蛋白基團(tuán)微環(huán)境變化也可反映蛋白的三級結(jié)構(gòu)變化，主要是蛋白內(nèi)源生色基團(tuán)（Trp、Tyr和Phe）由蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水區(qū)向親水環(huán)境暴露，在極性環(huán)境下由于溶劑的淬滅作用特征基團(tuán)的熒光強(qiáng)度降低或增強(qiáng)，最大發(fā)射峰位紅移或藍(lán)移，這種變化可用來衡量蛋白質(zhì)分子發(fā)生去折疊的程度，進(jìn)而反映三級結(jié)構(gòu)的變化。Kristinsson等[37]研究了鱈魚肌球蛋白微環(huán)境中色氨酸殘基的變化，結(jié)果表明在酸和堿展開時有顯著的熒光猝滅，但最大熒光波長并沒有移動。而鹽酸胍作用下的蛋白分子有更明顯的熒光猝滅，熒光波長有顯著紅移。相比之下更加說明經(jīng)酸堿處理的肌球蛋白的三級結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著的變化。Raghavan等[44]通過色氨酸熒光光譜研究加鹽順序?qū)λ嵴T導(dǎo)鯰魚的肌球蛋白的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無鹽時肌球蛋白的色氨酸熒光強(qiáng)度下降最快，暴露出色氨酸殘基數(shù)目增多使蛋白展開變性程度增加。但在肌球蛋白展開前加鹽其表現(xiàn)出較高的熒光強(qiáng)度，說明暴露的色氨酸殘基較少進(jìn)而減少了蛋白質(zhì)展開的程度。同樣Raghavan等[45]對堿誘導(dǎo)鯰魚肌球蛋白的結(jié)構(gòu)變化研究也表現(xiàn)出相似的結(jié)果，可見加鹽順序?qū)Φ鞍椎臉?gòu)象和結(jié)構(gòu)有很大的影響。

肌球蛋白的三級結(jié)構(gòu)主要依靠疏水相互作用力來維持。除了蛋白質(zhì)自身內(nèi)在因素外，蛋白質(zhì)在分離過程中表面疏水性的強(qiáng)弱也反映了肌球蛋白三級結(jié)構(gòu)的變性程度。目前常在蛋白質(zhì)分子的特殊部位引入外源熒光，測定外源熒光物質(zhì)的熒光進(jìn)而分析蛋白質(zhì)的疏水微環(huán)境。常用的熒光探針主要有ANS（8-苯胺基-1-萘磺酸）、PRODAN（N,N-二甲基-6-丙酰-2-萘胺）等。Raghavan等[45]使用PRODAN熒光探針研究加鹽順序?qū)A誘導(dǎo)肌球蛋白結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，肌球蛋白展開前加鹽的疏水性降低，重折疊后加鹽的疏水性升高。疏水性增大，溶解度減小，蛋白變性程度增大，展開前加鹽疏水性降低表明鹽可以阻礙肌球蛋白變性展開而起到保護(hù)作用。

2.3 肌漿蛋白在分離過程中的變化

肌漿蛋白質(zhì)主要包括肌溶蛋白、肌紅蛋白、肌漿酶、肌粒蛋白、肌質(zhì)網(wǎng)蛋白等，這些蛋白質(zhì)溶于水或低離子強(qiáng)度的中性鹽溶液，是肉中最易提取的蛋白質(zhì)。研究人員已證明動物源蛋白（卵清蛋白、α-乳清蛋白、β-乳球蛋白）和一些酶（如溶菌酶）具有熔球態(tài)，進(jìn)一步的研究還發(fā)現(xiàn)處于中間態(tài)的蛋白其乳化和起泡等功能性質(zhì)均有改善[46-47]。Kim等[48]研究了在阿拉斯加狹鱈魚糜凝膠中添加石斑魚肌漿蛋白的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)凝膠中加入2%肌漿蛋白，破斷力顯著增加，但其變形值略有下降，表明肌漿蛋白可以改善蛋白凝膠特性。

2.3.1 肌漿蛋白的二級結(jié)構(gòu)在分離過程中的變化

蛋白在分離過程中某些氫鍵體系會發(fā)生變化，與此同時其側(cè)鏈基團(tuán)如酪氨酸、色氨酸吲哚環(huán)、苯丙氨酸的單基取代苯基羥苯基環(huán)及C=O伸縮振動都有輕微變化。拉曼散射光譜和紅外吸收光譜均可得到振動光譜，兩種手段可提供互補(bǔ)信息。通過檢測蛋白質(zhì)酰胺鍵吸收紅外輻射的頻率，即可利用振動光譜來估算蛋白質(zhì)中二級結(jié)構(gòu)的含量。尤其是酰胺Ⅰ帶（80%為C=O伸縮振動，1 650 cm－1附近）、Ⅱ帶（60% N—H彎曲振動，1 550 cm－1附近）和Ⅲ帶（40% C—N伸縮振動，30% N—H 彎 曲 振 動，1 300 cm－1附近）通常被用來研究蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。Tadpitchayangkoon等[49]采用傅里葉變換紅外-拉曼光譜分析研究了條紋鯰魚（Pangasius hypophthalmus）肌漿蛋白經(jīng)酸堿處理過程中結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果顯示肌漿蛋白經(jīng)酸處理α-螺旋轉(zhuǎn)化為β-折疊，而堿處理卻對α-螺旋無影響。據(jù)推測，酸處理主要中斷氫鍵的重排導(dǎo)致β-折疊形成。蛋白質(zhì)分子的聚合已被證實(shí)涉及分子間的反平行β-折疊結(jié)構(gòu)的形成[50-51]。這表明酸誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)變性程度比堿誘導(dǎo)的高。

2.3.2 肌漿蛋白的三級結(jié)構(gòu)在分離過程中的變化

針對肌漿蛋白三級結(jié)構(gòu)研究的很少。Tadpitchayangkoon等[52]研究了條紋鯰魚（Pangasius hypophthalmus）肌漿蛋白在不同pH值處理下構(gòu)象變化。其中分別使用ANS和PRODAN外源熒光探針測定肌漿蛋白在不同pH值處理的表面疏水性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)極端酸性（pH 2～4）誘導(dǎo)肌漿蛋白的巰基氧化，導(dǎo)致蛋白聚集和表面疏水性下降；而在堿性pH值條件下肌漿蛋白結(jié)合外部熒光探針的能力增強(qiáng)，說明肌漿蛋白在堿性下暴露的疏水基團(tuán)增多，增大蛋白質(zhì)展開程度。

表1 不同品種的魚蛋白經(jīng)等電點(diǎn)沉淀法分離后結(jié)構(gòu)變化的研究回顧Table 1 Overview on conformational changes of proteins from different fi sh species induced by acid and alkaline protein isolation

綜上所述，如表1，無論是酸溶還是堿溶，均會導(dǎo)致肌肉蛋白空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而后在等電點(diǎn)沉淀發(fā)生重折疊。這些變化影響蛋白質(zhì)表面界面活性和巰基含量等。因此，研究提取分離中蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化規(guī)律，對于通過調(diào)控蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化機(jī)制來改善分離魚蛋白功能特性有重要意義。

3 結(jié) 語

雖然基于等電點(diǎn)絮凝沉淀原理的蛋白質(zhì)分離技術(shù)經(jīng)過十余年的發(fā)展，在魚蛋白利用領(lǐng)域取得了較快的發(fā)展，但是還存在一系列的科學(xué)瓶頸問題有待進(jìn)一步探索。目前國內(nèi)外研究主要集中于分離魚蛋白提取和功能特性的表征，對魚蛋白在分離過程中結(jié)構(gòu)的變化研究還較少，且結(jié)論各異。而且如前所述，研究的魚類品種還較少，因此很難找到魚蛋白在分離過程中結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律及其作用機(jī)理。因此，我們需要從魚蛋白分子空間結(jié)構(gòu)變化規(guī)律出發(fā)，在表征魚蛋白的功能特性前提下，進(jìn)一步研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律以及其與功能特性的相互關(guān)系。

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Advances in Research on Structural and Functional Variation of Fish Protein Isolate Extracted by Isoelectric Precipitation

WANG Wei, LIU Junrong*, MA Yongsheng, WU Zhong, TIAN Yuanyong
(College of Food Science and Engineering, Dalian Ocean University, Dalian 116023, China)

The current status of studies on the extraction and processing of isolated proteins is reviewed systematically with emphasis on fi sh protein isolate. Various food protein ingredients extracted from different raw materials based on isoelectric precipitation method are discussed with particular emphasis on the development and utilization of fi sh protein. The present analysis is focused on the conform ation and structure of the protein molecules during isolation. Research has shown that large changes in conformation and structure are always accompanied by signifi cant changes in functional properties of the protein isolates. Therefore, it is essential to explore the mechanism of protein molecular structure during isolation in order to r egulate specifi c functional properties of the fi sh protein ingredients.

protein isolation; food protein ingredients; functional properties; fi sh protein

TS254.1

A

1002-6630（2015）01-0250-06

10.7506/spkx1002-6630-201501048

2014-03-01

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31271980）

王偉（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。E-mail：wangwei889331@163.com

*通信作者：劉俊榮（1963—），女，教授，博士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品加工與質(zhì)量安全。E-mail：ljunrong@dlou.edu.cn