馬立克氏病病毒分子生物學研究進展

李曉青 （河北省任丘市畜牧水產(chǎn)局 062550）

馬立克氏病病毒分子生物學研究進展

李曉青 （河北省任丘市畜牧水產(chǎn)局 062550）

馬立克氏病(Marek′s disease, MD)是由雞的馬立克氏病病毒(Marek′s disease virus, MDV)引起的雞的一種腫瘤性疾病，以淋巴細胞增生和腫瘤的形成為主要特征，以外周神經(jīng)、生殖腺、臟器、免疫器官中單核細胞浸潤以及由于外周神經(jīng)腫瘤細胞的集聚而引起的半癱瘓或完全癱瘓為典型特征。匈牙利著名的獸醫(yī)病理學家馬立克在1907年首先報道了該病，英國科學家Biggs在1961年倡導開始使用馬立克氏病這一名稱[1]。上世紀二、三十年代，隨著商品雞的死亡數(shù)目的明顯增加，人們開始逐步關注馬立克氏病。1967年，Churchill等首次報道從接種病雞細胞的培養(yǎng)物中分離到了皰疹病毒[2]。1970年，Calnek等發(fā)現(xiàn)MDV可以以一種具有感染性的游離細胞形式從羽毛囊排出[3]，由于馬立克氏病毒在雞舍環(huán)境中能夠相對穩(wěn)定存在，易感雞呼吸系統(tǒng)接觸到空氣中帶有病毒的灰塵或羽屑，都可以引起MD的自然傳播。

直到上世紀80年代，對MD腫瘤細胞的T細胞特性，腫瘤誘導的成淋巴細胞樣細胞系的建立，疾病的溶細胞期和免疫抑制期的確定等研究取得了重大的科研成果。CVI988與SB-1等疫苗株的分離鑒定以及廣泛使用，更使得MD成為第一個可以用疫苗免疫的腫瘤性疾病。隨著MDV不斷的遺傳變異，毒力不斷的增強，越來越多的疫苗也隨之被研制應用。近年來發(fā)現(xiàn)在MDV的疫苗免疫后仍有很高腫瘤發(fā)病率的雞群中，依然能分離到MDV，并且大多數(shù)病例是MDV和REV的共感染，即在腫瘤病雞同時存在著這兩種病毒的病毒血癥[4]。同時大量的試驗已經(jīng)證實MDV和REV以及其它反轉錄病毒可以進行病毒的基因重組。2000年以來，隨著生物學技術的發(fā)展，對MDV的研究更是突飛猛進，目前已繪制出了MDV強毒標準株GA株的全基因組結構圖[5]。Schumacher、Reddy分別構建了含有MDV全基因組的感染性克隆，對進一步研究MDV基因功能以及全基因組測序提供了更可靠的途徑。

1. MDV基因組結構

通過全基因組測序證實，三種血清型的MDV基因組相似，由線性的雙股DNA組成，長約175kb，分別由末端長重復序列(TRL)、長獨特區(qū)(UL)、內(nèi)部長重復序列(IRL)、內(nèi)部短重復序列(IRS)、短獨特區(qū)(US)和末端短重復序列(TRS)組成，其中TRL、IRL、IRS、TRS為倒置重復序列。MDV基因組結構模式為TRL-UL-IRL-IRS-USTRS見圖1。

2000年，Lee等首次繪制了I型MDV GA株的全基因組圖譜(圖2)，為今后MDV全基因組分析提供了可參考的依據(jù)。通過比較超強毒Md5與GA株基因組，發(fā)現(xiàn)I型MDV結構差異很小，GA的基因組比Md5稍微小一點，主要是由于Md5基因組中的TRL和IRL區(qū)域內(nèi)直接重復序列拷貝數(shù)的增加以及IRS和TRS區(qū)域長度的增加。

圖2 I型MDV GA株的全基因組結構圖

2 MDV結構蛋白及相關基因

I型MDV編碼一百多個蛋白質，雖然已經(jīng)對MDV基因組上的70～80個特異的基因或區(qū)域的生物學功能進行相關研究，但至今通過對MDV感染細胞的提取物進行免疫沉淀試驗得到鑒定僅有46個MDV特異性的多肽[6]。其中僅有為數(shù)不多的幾個基因在MDV抗原和功能上是有重要作用的。因此將MDV基因根據(jù)在抗原和功能上的作用分為三大類即：（1）與致腫瘤相關基因：meq、pp38/pp24、v-IL8、和1.8Kb基因家族等[7]；（2）糖蛋白基因：gB、gC、gD、gE、gM、gI、gK、gL；（3）其它基因。

2.1 與致腫瘤相關基因 （1）meq：I型MDV的基因組中含有兩個拷貝的meq基因，meq基因由339個氨基酸組成，在其N末端含有一個與jun/fos致癌基因家族相似的亮氨酸拉鏈(bZIP)結構域，而在C末端富含與WT-1腫瘤抑制基因相似的脯氨酸的重復區(qū)域[8]。Meq蛋白在淋巴瘤細胞和腫瘤細胞系的細胞核中恒有表達[9]，在S期的細胞漿中也有表達。Meq蛋白在大鼠細胞中過量表達可以引起大鼠細胞凋亡抑制[10]，并且與細胞調控因子CDK2的相互作用[11,36]，證實meq基因與MDV致腫瘤性密切相關。與致病型的I型MDV不同，MDV疫苗CVI988/Rispens中有一段178bp的插入序列，導致C末端編碼富含脯氨酸結構域的閱讀框架發(fā)生移位[12]。大量的試驗都已證實MDV基因組中的meq基因與其致瘤作用密切相關[13]。Reddy等人利用粘粒作為載體，構建了Md5株的感染性克隆[14]，Lupiani等人在此基礎上利用同源重組的方法敲除掉Md5感染性克隆中的兩個meq基因，構建的重組病毒完全喪失了原始毒株的致腫瘤作用[15]，而且敲除了meq基因的重組病毒rMd5?meq可以作為疫苗有效的預防超強毒甚至特超強毒的攻擊[16]。（2）pp38/pp24：MDV磷酸化蛋白復合物，通常稱之為pp38/pp24，由位于TRL和UL區(qū)域的pp24基因和位于IRL和UL區(qū)域的pp38基因編碼[17]，是MD腫瘤細胞及細胞系中唯一能檢出的的一種MDV特異性抗原[18]。試驗表明，pp38基因能夠引起雞的免疫抑制[19]，在MDV感染的早期就能檢測到其表達[20]。Reddy研究表明，pp38基因對MDV的復制有非常重要的作用，但是并不影響腫瘤的形成[21]。研究表明pp38/pp24對其上游的雙向啟動子的活性有調控作用[22]，可以調控pp38/pp24和1.8kb基因家族的轉錄。（3）v-IL8：致腫瘤毒株(RB1B、Md5)的vIL-8基因的缺失證實vIL-8并不影響MDV的轉化和潛伏期，但是與早期的裂解性復制和靶細胞的吸引有關[23]。v-IL8基因缺失突變株能顯著降低感染雞的腫瘤率[24]。（4）1.8kb基因家族：幾個極早期轉錄子起源于1.8kb基因家族(又稱1.8kb mRNA)。1.8kb mRNA包含3個外顯子，位于MDV基因組的UL和IRL連接區(qū)。雖然1.8kb基因家族能轉錄不同的mRNA，但是僅在MDV強毒株中表現(xiàn)出很強的轉錄活性。1.8kb mRNA對其上游雙向啟動子活性具有增強作用，其開放閱讀框A和C對雞的致瘤性有一定的影響。1.8kb mRNA轉錄方向與pp38基因相反，轉錄起始位點位于相對pp38起始位點的-670到-680處[25]。試驗研究證實，隨著MDV的連續(xù)傳代，其基因組中的132bp串聯(lián)重復序列拷貝數(shù)增加，導致1.8kb mRNA基因家族會發(fā)生擴增。隨著MDV的連續(xù)傳代，導致1.8kb mRNA轉錄產(chǎn)物丟失，病毒致病性也會逐漸減弱。由于具有致瘤性的MDV強毒株中只有2～3個拷貝的132bp重復序列，而在非致瘤毒株中這一132bp重復序列的拷貝數(shù)不等[26]，同時敲除掉致病性MDV 基因組中2個拷貝的132bp串聯(lián)重復序列后，其致腫瘤性以及MDV早期的復制能力均沒有變化，連續(xù)傳代后，MDV毒力也能夠致弱，這說明病毒的致弱機制與132bp串聯(lián)重復序列是無關的[27]，也進一步表明1.8kb基因家族的轉錄產(chǎn)物或者它們編碼的蛋白質與MDV的致瘤性密切相關。

2.2 糖蛋白基因 MDV的糖蛋白B是一種重要的MDV中和性抗原，能夠誘導雞體產(chǎn)生中和抗體，與保護性免疫應答相關，對于細胞吸附和MDV進入很重要。糖蛋白B不具有分泌特性，僅存在于細胞的胞漿中。（1）gB基因：MDV的糖蛋白B是一種重要的MDV中和性抗原，能夠誘導雞體產(chǎn)生中和抗體，與保護性免疫應答相關，對于細胞吸附和MDV進入很重要。糖蛋白B不具有分泌特性，僅存在于細胞的胞漿中。（2）gC基因：MDV糖蛋白gC由UL44編碼，同時被稱為MDV的“A抗原”[28]。雖然糖蛋白gC也涉及到細胞對病毒的吸附，但是其同時具有干擾其他糖蛋白的功能。MDV在CEF細胞上經(jīng)過連續(xù)的傳代培養(yǎng)，病毒毒力減弱，糖蛋白C的表達水平明顯降低。盡管糖蛋白gC的表達和毒力有明顯的聯(lián)系，但是在某些弱毒中糖蛋白gC的表達量卻維持在一個較高的水平，因此至今沒有證實gC涉及到MDV的毒力[29]。（3）gD基因：gD是由US6編碼的，對于它的功能至今不明確。試驗研究表明gD在體外不能很好的表達甚至完全不表達。（4）gE、gI、gK、gL、gM：試驗證實gEgI復合物和gMUL49.5復合物對于MDV的排出有關。如果缺失MDV基因組中的gE或gI基因，重組病毒不能夠在雞的成纖維細胞間傳播，不再形成MDV特有的細胞病變。因此gE基因和gI基因是MDV在細胞與細胞之間傳播所必需的。2.3 其它基因 近年來，隨著各種生物學技術的發(fā)展，越來越多的MDV基因功能被人們所認識，但是還有一些基因的功能不能確定，只是根據(jù)其它皰疹病毒的同源物推斷得出。如：UL36、UL45、UL46、UL47、UL48、UL49、及US1、US2、US10等衣殼蛋白類基因；UL12、UL13、UL23、UL30等具有調控活性或者酶活性的蛋白質基因。

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