培哚普利對(duì)心肌肥厚大鼠心肌組織中肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A表達(dá)的影響

琚肖肖，趙玉蘭，董 靜，黃亞萍

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科鄭州450014

目前，舒張性心力衰竭的發(fā)病率、病死率不斷上升，已成為心血管病研究的熱點(diǎn)。而心肌肥厚是舒張性心力衰竭的主要病因，是心臟為適應(yīng)血流動(dòng)力學(xué)超負(fù)荷而發(fā)生的增生。雖然心肌肥厚早期改變對(duì)于維持正常心功能有一定的代償意義，但它本身也會(huì)增加心肌耗氧量，降低心肌順應(yīng)性，長(zhǎng)期心肌肥厚會(huì)導(dǎo)致心力衰竭并增加猝死發(fā)生率［1］。心肌肥厚是心肌細(xì)胞對(duì)多種刺激因素產(chǎn)生的適應(yīng)性反應(yīng)，是一個(gè)復(fù)雜的病理反應(yīng)過(guò)程。肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A(myocyte enhancer factor 2A，MEF2A)是MEF2 家族中的重要一員，在骨骼肌、心肌、平滑肌的分化及血管的發(fā)育中起著重要作用［2-3］。該研究旨在通過(guò)建立大鼠心肌肥厚模型，觀察MEF2A 在正常大鼠、心肌肥厚大鼠、藥物干預(yù)大鼠心肌組織中的表達(dá)情況，了解MEF2A 影響心肌肥厚發(fā)生發(fā)展的機(jī)制及培哚普利對(duì)其影響。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 健康雄性SPF 級(jí)Wistar 大鼠30只，體重300～350 g，由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室提供。鹽酸異丙腎上腺素(ISO)注射液，2 g/L，上海合豐制藥有限公司生產(chǎn);培哚普利，8 mg/片，施維雅制藥有限公司生產(chǎn)。RT-PCR試劑盒(Transgene 公司)，瓊脂糖(西班牙生化試劑公司)，PCR 引物(北京博大泰克公司)，SP 試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，MEF2A 抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

1．2 動(dòng)物模型制備 30只Wistar 大鼠應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，每組10只。①模型組:大鼠皮下注射ISO 3 mg/(kg·d)。②藥物干預(yù)組:大鼠皮下注射ISO 3 mg/(kg·d)，培哚普利1 mg/(kg·d)溶于2 mL 飲用水中灌胃。③對(duì)照組:大鼠皮下注射與ISO 等劑量的生理鹽水，灌胃與培哚普利等劑量的生理鹽水。各組均連續(xù)處理10 d。

1．3 心臟重量參數(shù)測(cè)定 10 d 后，測(cè)量3組大鼠的體重，麻醉后開(kāi)胸取出心臟，剪去心臟周圍的血管及組織，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗，濾紙吸干水分，然后稱全心重量，沿冠狀溝剪去左心房，再沿室間溝剪去右室游離壁，稱左心室重量，計(jì)算全心重量/體重比(HW/BW)、左心室重量/體重比(LVW/BW);將左心室心肌組織分為兩部分，一部分放入液氮中儲(chǔ)存，另一部分放入40 g/L 多聚甲醛中固定24 h。

1．4 心肌組織的HE 染色 將多聚甲醛固定的心肌組織石蠟包埋，4 μm 厚切片，脫蠟后行常規(guī)HE染色，鏡下觀察各組心肌組織的形態(tài)學(xué)變化。

1．5 RT-PCR 檢測(cè)心肌組織中MEF2A mRNA 的表達(dá) 以GAPDH 為內(nèi)參，上游引物5'-CGGCAAGT TCAACGGCACGC-3'，下游引物5'-GCCTGCTTCAC CACCTTCTT-3'，擴(kuò)增片段大小636 bp;MEF2A 上游引物5'-TTCACTCGTGTCACCGTCTT-3'，下游引物5'-TCTGGTTTCCGACTGTTCAT-3'，擴(kuò)增片段大小333 bp。提取心肌組織總RNA，按說(shuō)明書步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。PCR 擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性2 min;94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán);72℃延伸6 min，55℃退火15 s。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物與緩沖液混合后加入瓊脂糖凝膠的加樣孔中，進(jìn)行電泳。EB 染色后，在紫外線投射儀下觀察電泳條帶，用D-140 圖像記錄分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，MEF2A mRNA 的相對(duì)表達(dá)量以MEF2A 和GAPDH條帶灰度值的比值表示。

1．6 免疫組化檢測(cè)心肌組織中MEF2A 蛋白的表達(dá) 采用免疫組化SP 法。石蠟切片經(jīng)脫蠟水化、在PBS 溶液中浸泡、修復(fù)抗原、加入多克隆抗體、DAB 染色、蘇木素復(fù)染等步驟，然后進(jìn)行分色、洗滌、脫水、透明、封片等，最后用顯微鏡進(jìn)行觀察，MEF2A 蛋白染色后在心肌細(xì)胞中呈棕色顆粒。應(yīng)用Lecia 圖像采集系統(tǒng)，在400 倍視野下進(jìn)行觀察，選取5個(gè)染色較均勻區(qū)域測(cè)量陽(yáng)性細(xì)胞的灰度值，結(jié)果取平均值。

1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17．0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。3組間HW/BW、LVW/BW、MEF2A 蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0．05。

2 結(jié)果

2．1 3組大鼠HW/BW 和LVW/BW 的比較 結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 3組大鼠HW/BW、LVW/BW、MEF2A mRNA 及蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較

2．2 3組大鼠心肌組織的病理學(xué)變化 對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞無(wú)明顯改變，細(xì)胞核居中，心肌細(xì)胞排列整齊;模型組可見(jiàn)心肌細(xì)胞明顯肥大，排列紊亂，間質(zhì)纖維結(jié)締組織增生明顯;藥物干預(yù)組心肌細(xì)胞較模型組稍小，間質(zhì)纖維結(jié)締組織增生較少。見(jiàn)圖1。

圖1 3組大鼠心肌組織HE 染色結(jié)果(×400)

2．3 3組大鼠心肌組織中MEF2A mRNA 的表達(dá)RT-PCR 檢測(cè)3組大鼠心肌組織中MEF2A mRNA的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果為:模型組＞藥物干預(yù)組＞對(duì)照組。見(jiàn)圖2 和表1。

2．4 3組大鼠心肌組織中MEF2A 蛋白的表達(dá)MEF2A 蛋白在心肌細(xì)胞中表現(xiàn)為棕色顆粒。對(duì)照組心肌細(xì)胞中可見(jiàn)少量棕色顆粒;模型組中可見(jiàn)大量棕色顆粒;藥物干預(yù)組中可見(jiàn)部分棕色顆粒，較模型組少。見(jiàn)圖3 和表1。

圖2 3組大鼠心肌組織中MEF2A mRNA 的表達(dá)

圖3 3組大鼠心肌組織中MEF2A 蛋白免疫組化染色結(jié)果(SP，×400)

3 討論

心肌肥厚是一種以心臟質(zhì)量增加為特征的病理生理改變，可繼發(fā)于多種心血管疾病，最常見(jiàn)的是高血壓病。在高血壓的初期，心臟后負(fù)荷增加導(dǎo)致心臟泵血阻力增加，心臟代償性肥厚以克服增加的壓力負(fù)荷，但是持續(xù)的壓力超負(fù)荷引起心肌肥厚失代償，進(jìn)而出現(xiàn)猝死、心律失常、心力衰竭等心血管意外［4］。血管緊張素Ⅱ、內(nèi)皮素以及TGF-β 等因子通過(guò)多條通路誘導(dǎo)心肌蛋白合成，使心肌細(xì)胞增大，促進(jìn)心肌肥厚的發(fā)生［5-6］。MEF2A 是p38MAPK 信號(hào)通路下游的重要調(diào)節(jié)因子，在信號(hào)傳導(dǎo)、肌肉組織中結(jié)構(gòu)蛋白的形成中發(fā)揮重要的作用［7-8］。該研究通過(guò)免疫組化及RT-PCR 的方法分別檢測(cè)MEF2A 蛋白及mRNA 的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)MEF2A 蛋白及mRNA 在模型組的表達(dá)均高于對(duì)照組，說(shuō)明MEF2A 可能通過(guò)p38MAPK 信號(hào)通路介導(dǎo)心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展［9］。

該研究通過(guò)比較3組大鼠HW/BW、LVW/BW、MEF2A mRNA 及蛋白相對(duì)表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，培哚普利干預(yù)后，HW/BW、LVW/BW 及MEF2A mRNA 和蛋白的相對(duì)表達(dá)量均低于模型組，提示MEF2A 在心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展中起著促進(jìn)作用，同時(shí)說(shuō)明培哚普利可抑制MEF2A 的表達(dá)，進(jìn)而抑制心肌肥厚的發(fā)生。

綜上所述，培哚普利可減輕肥厚心肌組織的病理改變，通過(guò)調(diào)控MEF2A 的表達(dá)發(fā)揮抑制心肌肥厚的作用。

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