利拉魯肽對(duì)小鼠脂肪細(xì)胞脂肪因子、炎癥因子及其信號(hào)通路的影響*

崔智慧，崔 巖，孫高潔，王 姣，王守俊

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科鄭州450052

肥胖易引起相關(guān)機(jī)體紊亂，如胰島素抵抗、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓和慢性腎臟病變等，并且增加心血管病的發(fā)病率和病死率［1］。研究［2］稱(chēng)約90%的2 型糖尿病患者超重或肥胖。機(jī)體肥胖狀態(tài)時(shí)最主要的病理學(xué)改變是脂肪組織增生肥大和脂肪細(xì)胞功能受損，由此可誘發(fā)脂肪細(xì)胞炎癥反應(yīng)和胰島素抵抗。越來(lái)越多的研究［3］證實(shí)脂肪組織能夠生成和分泌大量的細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和活性肽等。因此，脂肪組織被認(rèn)為是一種十分重要的內(nèi)分泌器官，其所分泌的脂肪因子不僅參與生理狀態(tài)下糖脂代謝、免疫及心血管功能的維持與調(diào)控，而且在肥胖、炎癥、代謝綜合征和心血管疾病等的發(fā)生和發(fā)展中扮演著重要的角色［4］。對(duì)脂肪因子瘦素、脂聯(lián)素、CTRP3 和炎癥因子TNF-α、IL-6 的研究，為未來(lái)糖尿病及肥胖相關(guān)性疾病的治療提供了新的思路［5］。該研究旨在觀(guān)察新型降糖制劑胰高血糖素樣肽-1 類(lèi)似物利拉魯肽對(duì)小鼠脂肪細(xì)胞脂肪因子、炎癥因子的影響，探討利拉魯肽改善胰島素抵抗的分子機(jī)制及其對(duì)炎癥信號(hào)通路影響的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 細(xì)胞和試劑 小鼠前脂肪細(xì)胞株3T3-L1 細(xì)胞購(gòu)自武漢博士德公司。地塞米松(Dex)、胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-isobuthyl-1-methylxanthine，IBMX)購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司;Trizol 試劑盒購(gòu)自Invitrogen 公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher Scientific 公司;熒光定量PCR 試劑盒購(gòu)自Roche 公司;IKK-β 抗體、磷酸化IKK-β(ser181)抗體及辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG 均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1．2 細(xì)胞的培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化成熟 將3T3-L1 前脂肪細(xì)胞接種于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM高糖雙抗培養(yǎng)基中，于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至完全融合，48 h 后換用含1 μmol/L Dex、0．5 μmol/L 胰島素、0．5 mmol/L IBMX的DMEM 高糖培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化，3 d 后換用含1 μmol/L Dex、0．5 μmol/L 胰島素的DMEM 高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每2 d 換液1次，至第10天，約90%的細(xì)胞呈脂肪細(xì)胞表型時(shí)行下一步處理。

1．3 實(shí)驗(yàn)分組及處理 將利拉魯肽溶于培養(yǎng)基中，配成終濃度為10－5mol/L 的溶液。0(對(duì)照)、1、10和100 nmol/L 利拉魯肽處理細(xì)胞48 h 后收集細(xì)胞備用，100 nmol/L 利拉魯肽分別處理細(xì)胞0、8、24 和48 h 后收集細(xì)胞備用，每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1．4 qRT-PCR 檢測(cè)各因子的表達(dá)水平 根據(jù)GenBank 中的瘦素、脂聯(lián)素、CTRP3、TNF-α、IL-6 和內(nèi)參β-actin 的基因序列設(shè)計(jì)引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。使用Trizol 法分別提取上述各組脂肪細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后行qRT-PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系:上、下游引物(1 μmol/L)各4 μL，SYBR Green 10 μL，Rnase-free 水10 μL，cDNA 2 μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10 min;95℃變性10 s，60℃退火/延伸10 s。每次延伸步驟結(jié)束后，通過(guò)檢測(cè)反應(yīng)體系中SYBR Green 與雙鏈DNA 結(jié)合后所發(fā)出的熒光強(qiáng)度來(lái)定量PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物大小。

表1 PCR 引物序列

1．5 IKK-β 及ser181 蛋白表達(dá)的檢測(cè) 收集0、1、10 和100 nmol/L 利拉魯肽處理48 h 后的細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度，采用Western blot檢測(cè)IKK-β 及ser181 蛋白的表達(dá)。SDS-PAGE 膠上樣，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗稀釋1 000 倍后使用，搖床4℃孵育過(guò)夜，TBST 洗膜5 min ×3次，加HRP 標(biāo)記的稀釋1 000 倍的二抗孵育1 h，DAB 顯色。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17．0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，不同濃度利拉魯肽作用于3T3-L1 脂肪細(xì)胞和100 nmol/L 利拉魯肽作用于3T3-L1 脂肪細(xì)胞0、8、24、48 h 對(duì)脂肪因子和炎癥因子mRNA 表達(dá)的影響，以及不同濃度利拉魯肽對(duì)3T3-L1 脂肪細(xì)胞IKK-β 及ser181 蛋白表達(dá)的影響采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0．05。

2 結(jié)果

2．1 不同濃度利拉魯肽作用于3T3-L1 脂肪細(xì)胞48 h 后對(duì)脂肪因子、炎癥因子mRNA 表達(dá)的影響見(jiàn)表2。

表2 不同濃度利拉魯肽對(duì)3T3-L1 脂肪細(xì)胞脂肪因子和炎癥因子mRNA 表達(dá)的影響(n=3)

2．2 100 nmol/L 利拉魯肽作用于3T3-L1 脂肪細(xì)胞不同時(shí)間對(duì)脂肪因子及炎癥因子mRNA 表達(dá)的影響 見(jiàn)表3。

表3 100 nmol/L 利拉魯肽作用不同時(shí)間對(duì)3T3-L1 脂肪細(xì)胞脂肪因子和炎癥因子mRNA 表達(dá)的影響(n=3)

2．3 不同濃度利拉魯肽對(duì)3T3-L1 脂肪細(xì)胞IKKβ、ser181 蛋白表達(dá)的影響 0、1、10 和100 nmol/L利拉魯肽作用于3T3-L1 脂肪細(xì)胞48 h 后對(duì)IKK-β蛋白的表達(dá)水平無(wú)影響，而對(duì)IKK-β 蛋白的磷酸化有抑制作用，且呈劑量依賴(lài)性。見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度利拉魯肽對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞IKK-β、ser181 蛋白表達(dá)的影響

3 討論

2 型糖尿病患者常伴有肥胖、血脂紊亂、非酒精性脂肪肝等代謝相關(guān)性疾病［6］。新型抗糖尿病藥物利拉魯肽不僅具有控制血糖、減輕體重、改善胰島素抵抗和降低心血管疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的作用，還具有潛在的抗炎作用，能夠改善肥胖患者的慢性炎癥狀態(tài)。

該研究結(jié)果顯示利拉魯肽能夠降低3T3-L1 脂肪細(xì)胞瘦素、TNF-α、IL-6 mRNA 的表達(dá)。瘦素是由肥胖基因所編碼的一種分泌型蛋白質(zhì)，其表達(dá)的增加與胰島素抵抗呈正相關(guān)。TNF-α 可對(duì)脂肪細(xì)胞的生理功能產(chǎn)生多種影響，如活化細(xì)胞因子的基因表達(dá)、加速胰島素抵抗的發(fā)生等［7］。IL-6 可介導(dǎo)肥胖誘發(fā)的慢性炎癥和胰島素抵抗。利拉魯肽降低3T3-L1 脂肪細(xì)胞TNF-α、IL-6 mRNA 表達(dá)的結(jié)果表明其在體外有抗炎作用。該研究結(jié)果亦顯示利拉魯肽能夠增加3T3-L1 脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素和CTRP3 mRNA 的表達(dá)。脂聯(lián)素在體內(nèi)的生理作用主要是增加胰島素的敏感性和促進(jìn)糖脂代謝［8］，并且通過(guò)與其他炎癥因子的相互調(diào)節(jié)控制炎癥反應(yīng)。CTRP3 是近年發(fā)現(xiàn)的新型脂肪因子，與脂聯(lián)素高度同源［9］。相關(guān)研究［10］表明，CTRP3 基因敲除的類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎小鼠的關(guān)節(jié)病變更為嚴(yán)重，證實(shí)CTRP3 具有抗炎作用。該研究結(jié)果表明利拉魯肽可通過(guò)增加抗炎脂肪因子的表達(dá)而改善機(jī)體的炎癥狀態(tài)。

IKK/Iκ/NF-κ 通路是體內(nèi)主要的炎癥信號(hào)通路。IKK-β 可以直接刺激IRS-1 導(dǎo)致絲氨酸抑制性磷酸化，損害胰島素信號(hào)傳導(dǎo)［11］，更重要的是IKKβ 激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，后者激活包括TNF-α 和IL-6 在內(nèi)的多種細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步抑制胰島素信號(hào)傳導(dǎo)［12］。因此，IKK-β 信號(hào)通路的激活是導(dǎo)致細(xì)胞炎癥反應(yīng)和胰島素抵抗的重要調(diào)節(jié)因素。該研究中利拉魯肽在一定的濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴(lài)性地抑制ser181 蛋白表達(dá)，而不改變IKK－β 蛋白的表達(dá)，推測(cè)利拉魯肽可能通過(guò)降低IKK－β 的磷酸化水平發(fā)揮改善機(jī)體炎癥狀態(tài)的功能。

綜上所述，利拉魯肽不僅能夠減少炎癥因子TNF－α、IL－6 的表達(dá)，而且能夠增加抗炎脂肪因子脂聯(lián)素、CTRP3 的表達(dá)，而這些作用可能通過(guò)抑制IKK－β 的磷酸化實(shí)現(xiàn)。

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