人參皂苷Rd對(duì)高糖致人牙周膜干細(xì)胞成骨分化抑制作用的影響

王慧麗，謝 冰，李 欣，藺燕萍，張 朋

1)鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院口腔科 鄭州450007 2)鄭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院修復(fù)科 鄭州450052

△女，1974年12月生，本科，主治醫(yī)師，研究方向:牙體牙髓牙周病，E-mail:wanghl501@163．com

牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)是牙周組織中存在的未分化的間充質(zhì)細(xì)胞，具有自我更新和多向分化等特點(diǎn)。21 世紀(jì)以來(lái)，糖尿病已成為世界各國(guó)共同面對(duì)的一項(xiàng)公共健康問(wèn)題，而糖尿病會(huì)大大增加牙周炎的發(fā)病率［1］。人參皂苷Rd (ginsenoside Rd，GSRd)是人參皂苷的主要活性單體之一，具有廣泛的生物活性，如保護(hù)心血管及腎臟功能、促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)等［2-3］。作者觀察了高糖誘導(dǎo)條件對(duì)PDLSCs 增殖及分化的影響，進(jìn)一步分析GSRd 對(duì)高糖誘導(dǎo)PDLSCs 成骨分化的影響，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1．1 試劑及儀器 胎牛血清、2．5 g/L 胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶、Dispase 酶(HyClone 公司，美國(guó))，GSRd(廣東泰和生物制藥有限公司)，α 極限必需培養(yǎng)基(α-MEM)、Trizol Reagent(Invitrogen 公司，美國(guó))，骨橋蛋白(OPN)抗體、超氧化物歧化酶(SOD)抗體、過(guò)氧化氫酶(CAT)抗體、內(nèi)參抗體、羊抗兔抗體(Abcam 公司，美國(guó))，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、即用型混合液(Roche 公司，瑞士)，倒置顯微鏡(Olympus 公司，日本)，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Biorad 公司，美國(guó))，PCR 儀(Aplied Biosystems 公司，美國(guó))。

1．2 PDLSCs 的分離、培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 經(jīng)患者知情同意后，取根中1/3 牙周膜組織，剪成約1 mm×1 mm×1 mm 的組織塊，移入15 mL 離心管，加入3 g/L 的Ⅰ型膠原酶和4 g/L 的Dispase 酶，37℃消化1 h。將細(xì)胞移于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、青霉素及鏈霉素各1 ×105U/L 的α-MEM 培養(yǎng)液重懸。調(diào)整細(xì)胞密度為1 ×107L－1，接種于6 孔板，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2孵箱中。每3 d 換液1次，棄去未貼壁的細(xì)胞。細(xì)胞達(dá)80%左右融合時(shí)，用胰蛋白酶消化傳代。實(shí)驗(yàn)均取第4～7 代細(xì)胞，均重復(fù)6次。觀察高糖對(duì)堿性磷酸酶(ALP)活性影響時(shí)，設(shè)對(duì)照組和高糖組，觀察時(shí)間為第4、7天;觀察正常條件下GSRd 對(duì)ALP 活性的影響時(shí)，設(shè)對(duì)照組和0．1、1．0、10．0、40．0、100．0 μmol/L GSRd 處理組;觀察高糖條件下GSRd 對(duì)ALP、骨鈣蛋白(OCN)、OPN、SOD、CAT 表達(dá)的影響時(shí)，設(shè)高糖組、對(duì)照組和高糖+10(或40)μmol/L GSRd 處理組，ALP 活性檢測(cè)時(shí)間為第4、7、14天。

1．3 PDLSCs 表面標(biāo)記物的檢測(cè) 取第4 代PDLSCs，2．5 g/L 胰蛋白酶消化并離心，棄上清液，用冷PBS 洗3次后再用含體積分?jǐn)?shù)30%的胎牛血清的PBS 重懸，調(diào)細(xì)胞密度至2 ×109L－1;將細(xì)胞懸液分裝于EP 管中(100 μL/管)，設(shè)定其中一管為裸細(xì)胞作為對(duì)照，其余分別加入相應(yīng)的抗體2 μL，室溫避光孵育1 h，離心棄上清后冷PBS 洗3次，用500 μL 含體積分?jǐn)?shù)30%胎牛血清的PBS 重懸，4℃避光保存。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD34、CD29、CD90、CD45、CD146 等表面標(biāo)記物的表達(dá)情況。

1．4 PDLSCs 的成骨分化 將PDLSCs 轉(zhuǎn)移到含體積分?jǐn)?shù)5%胎牛血清的α-MEM 培養(yǎng)基，培養(yǎng)基同時(shí)含50 mg/L 抗壞血酸、1 μmol/L 地塞米松及3 mmol/L β-磷酸甘油。細(xì)胞孵育時(shí)分別添加5 mmol/L D-葡萄糖(正常組)或30 mmol/L D-葡萄糖(高糖組);GSRd 濃度分別為0．1、1．0、10．0、40．0、100．0 μmol/L。培養(yǎng)基每2 d 換液1次。

1．5 ALP 活性測(cè)定 細(xì)胞用PBS 洗滌2次并溶解在含體積分?jǐn)?shù)1% Triton X-100 和1 mmol/L PMSF的Tris-HCl 緩沖液(pH 7．0)中。使用Bradford 方法進(jìn)行總蛋白定量，在405 nm 波長(zhǎng)處測(cè)吸光度值，并用總蛋白標(biāo)準(zhǔn)化ALP 活性。

1．6 ALP、OCN、SOD、CAT mRNA 表達(dá)的檢測(cè)用Trizol Reagent 提取細(xì)胞總RNA。ALP 上游引物5'-GCAGTATGAATTGAATCGGAACAAC-3'，下 游 引物5'-ATGGCCTGGTCCATCTCCAC-3';OCN 上游引物5'-ACCATCTTTCTGCTCACTCTGCT-3'，下游引物5'-CCTTATTGCCCTCCTGCTTG-3';SOD 上游引物5'-TCAATCAAGAGGGTGAAAAGAAGCC-3'，下游引物5'-TGACAAAGTTAGCATTGCATCCTCG-3';CAT 上游引物5'-AGCGACCAGATGAAGCAGTG-3'，下游引物5'-TCCGCTCTCTGTCAAAGTGTG-3';內(nèi)參β-actin 上游引物5'-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3'，下游引物5'-ATGGAGCCACCGATCCACA-3'。將每個(gè)樣本的總RNA(1 μg)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)體系的體積為20 μL，包括10 μL 2 ×FastStart Universal SYBR Green Master、1 μL cDNA、0．5 μL 上游引物、0．5 μL 下游引物及8 μL 雙蒸水。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性2 min;94℃15 s，56℃10 s，72℃30 s，共39個(gè)循環(huán);72℃延伸8 min，并采用2－ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1．7 OPN、SOD、CAT 蛋白表達(dá)的檢測(cè) 將提取的總蛋白(20 μg)使用100 g/L 的SDS-PAGE 分離膠分離，并轉(zhuǎn)移到NC 膜。TBST 洗膜，50 g/L 脫脂奶液封閉1 h。滴加一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST 洗膜，滴加二抗孵育1 h，TBST 洗膜，曝光。采用Image J 圖像分析軟件測(cè)定蛋白條帶的灰度值。

1．8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17．0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對(duì)照組和高糖組ALP 活性的比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn);其他指標(biāo)不同組間的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0．05。

2 結(jié)果

2．1 PDLSCs 的形態(tài)學(xué)觀察 牙周膜組織用酶消化法培養(yǎng)3～7 d 后，可見(jiàn)長(zhǎng)梭形、多角形的類(lèi)成纖維樣細(xì)胞從組織塊中爬出，2 周左右達(dá)70%～80%融合(圖1)。

圖1 PDLSCs 形態(tài)(×100)

2．2 PDLSCs 表面標(biāo)記物鑒定結(jié)果 PDLSCs 表面標(biāo)記物陽(yáng)性表達(dá)率為:CD90 (99．32 ± 0．03)%、CD29 (98．35 ±0．05)%、CD146 (93．38 ±0．02)%、CD34 (2．77 ±0．01)%、CD45 (2．21 ±0．01)%，符合間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)特點(diǎn)。

2．3 高糖對(duì)PDLSCs ALP 活性的影響 結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 高糖對(duì)PDLSCs ALP 活性的影響 mol/g

2．4 GSRd 對(duì)PDLSCs ALP 活性的影響 結(jié)果見(jiàn)表2、3。

表2 正常條件下GSRd 對(duì)PDLSCs ALP 活性的影響 mol/g

表3 高糖條件下GSRd 對(duì)PDLSCs ALP 活性的影響 mol/g

2．5 GSRd 對(duì)高糖誘導(dǎo)PDLSCs 成骨相關(guān)因子ALP、OCN、OPN 表達(dá)的影響 結(jié)果見(jiàn)表4。

2．6 GSRd 對(duì)高糖誘導(dǎo)PDLSCs SOD、CAT 表達(dá)的影響 結(jié)果見(jiàn)表5。

表4 GSRd 對(duì)高糖誘導(dǎo)PDLSCs ALP、OCN 及OPN 表達(dá)的影響

表5 GSRd 對(duì)高糖條件下CAT、SOD mRNA 及蛋白表達(dá)的影響

3 討論

流行病學(xué)研究［4-5］發(fā)現(xiàn)糖尿病與牙周病之間的關(guān)聯(lián)度很高，甚至牙周炎被提議作為糖尿病的第六并發(fā)癥。糖尿病患者的高血糖水平可以改變PDLSCs 的再生能力，從而影響牙周組織的修復(fù)和再生。在該研究中，作者首先證實(shí)高糖條件對(duì)PDLSCs成骨分化的抑制效應(yīng)，在高糖組的第4 和7天，ALP的活性較對(duì)照組顯著下降，預(yù)示著高糖減低了PDLSCs 的成骨活性。接著，作者對(duì)PDLSCs 應(yīng)用GSRd 進(jìn)行預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)10、40 μmol/L GSRd 抑制了由高糖誘導(dǎo)的ALP 活性的下降，改善了高糖條件下PDLSCs 成骨分化的能力，提示GSRd 可以用于治療伴糖尿病型牙周炎。

為了進(jìn)一步探討GSRd 在高糖對(duì)PDLSCs 成骨分化影響中的作用，作者通過(guò)PCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)成骨基因ALP 和OCN 表達(dá)量在高糖條件下較對(duì)照組顯著下降，而應(yīng)用10、40 μmol/L GSRd 預(yù)處理后ALP 和OCN mRNA 的表達(dá)量較高糖組顯著提高。同樣通過(guò)免疫印跡的方法作者發(fā)現(xiàn)，高糖組OPN 蛋白表達(dá)量較對(duì)照組顯著下降，應(yīng)用10、40 μmol/L GSRd 預(yù)處理后OPN 蛋白表達(dá)量較高糖組升高。ALP、OCN、OPN 被認(rèn)為是組織發(fā)生礦化［6］、成骨細(xì)胞活性［7］的重要指標(biāo)。這些結(jié)果說(shuō)明GSRd 對(duì)高糖致PDLSCs成骨分化抑制起到了改善作用。

伴糖尿病型牙周炎患者的PDLSCs 長(zhǎng)期暴露在高濃度葡萄糖中，會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)加劇，從而產(chǎn)生不利影響，使后期缺損牙槽骨的再生能力減弱。因此，去除氧化的因素及提高抗氧化酶的表達(dá)和活性可能會(huì)有利于伴糖尿病型牙周炎患者牙周組織的再生。在該研究中作者發(fā)現(xiàn)，高糖組PDLSCs 抗氧化酶CAT 及SOD 的mRNA 和蛋白表達(dá)量較對(duì)照組顯著下降，而應(yīng)用10、40 μmol/L GSRd 預(yù)處理后mRNA 和蛋白的表達(dá)量較高糖組升高。這些結(jié)果與以前的研究［8-11］結(jié)果類(lèi)似，表明GSRd 可以提高抗氧化酶的表達(dá)和活性，進(jìn)而起到清除氧自由基的作用。

綜上，作者發(fā)現(xiàn)GSRd 對(duì)體外培養(yǎng)的PDLSCs 的成骨分化有一定的促進(jìn)作用，且GSRd 可以減輕高糖條件下氧化應(yīng)激對(duì)PDLSCs 成骨的抑制作用，顯著改善高糖狀態(tài)下ALP、OCN mRNA 及OPN 蛋白表達(dá)量的降低，進(jìn)而對(duì)高糖條件下PDLSCs 的成骨分化提供了保護(hù)作用，為使用GSRd 治療伴糖尿病型牙周炎提供了理論基礎(chǔ)。

［1］程亞瑋，岳二麗，尚偉，等．齦溝液中hs-CRP 和TNF-α水平與2 型糖尿病及慢性牙周炎的關(guān)系［J］．鄭州大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2014，49(3):415

［2］Kimdo Y，Park YG，Quan HY，et al．Ginsenoside Rd stimulates the differentiation and mineralization of osteoblastic MC3T3-E1 cells by activating AMP-activated protein kinase via the BMP-2 signaling pathway［J］．Fitoterapia，2012，83(1):215

［3］Ye R，Li N，Han J，et al．Neuroprotective effects of ginsenoside Rd against oxygen-glucose deprivation in cultured hippocampal neurons［J］．Neurosci Res，2009，64(3):306

［4］Shaw JE，Sicree RA，Zimmet PZ．Global estimates of theprevalence of diabetes for 2010 and 2030［J］．Diabetes Res Clin Pract，2010，87(1):4

［5］Bascones-Martine A，Gonzalez-Febles J，Sanz-Esporrin J．Diabetes and periodontal disease:review of the literature［J］．Am J Dent，2014，27(2):63

［6］安瑩，高麗娜，楊昊，等．氯化鋰對(duì)人牙周膜干細(xì)胞增殖和成骨分化的影響［J］．牙體牙髓牙周病學(xué)雜志，2013，23(1):12

［7］卓靜，馬肅，陳力，等．環(huán)孢素A 對(duì)大鼠牙槽骨內(nèi)DMP1 C 末端和OPN 表達(dá)的影響［J］．臨床口腔醫(yī)學(xué)雜志，2014，30(3):133

［8］韓春，柯杰，趙桂芝．糖尿病性牙周炎與氧化應(yīng)激的研究進(jìn)展［J］．牙體牙髓牙周病學(xué)雜志，2012，22(8):484

［9］尚國(guó)偉，孫京濤，劉宏建，等．富勒醇拮抗地塞米松誘導(dǎo)的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞氧化應(yīng)激和成脂分化［J］．中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2014，31(1):132

［10］Kim WK，Meliton V，Bourquard N，et al．Hedgehog signaling and osteogenic differentiation in multipotent bone marrow stromal cells are inhibited by oxidative stress［J］．J Cell Biochem，2010，111(5):1199

［11］Kim NR，Lim BS，Park HC，et al．Effects of N-acetylcysteine on TEGDMA-and HEMA-induced suppression of osteogenic differentiation of human osteosarcoma MG63 cells［J］．J Biomed Mater Res B Appl Biomater，2011，98(2):300