過(guò)表達(dá)NF-E2相關(guān)因子2對(duì)白癜風(fēng)黑素細(xì)胞PIG3V線粒體生物合成和功能的影響

朱龍飛 田軍 堅(jiān)哲 劉邦民 肖茜 李春英 高天文

過(guò)表達(dá)NF-E2相關(guān)因子2對(duì)白癜風(fēng)黑素細(xì)胞PIG3V線粒體生物合成和功能的影響

朱龍飛 田軍 堅(jiān)哲 劉邦民 肖茜 李春英 高天文

目的 探討過(guò)表達(dá)NF-E2相關(guān)因子2（Nrf2）對(duì)黑素細(xì)胞線粒體合成和功能的影響。方法 構(gòu)建含有人Nrf2基因全長(zhǎng)的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒Nrf2-pEX-1，用該質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染白癜風(fēng)患者表皮黑素細(xì)胞系（PIG3V）。實(shí)驗(yàn)分為空白組（不含質(zhì)粒）、對(duì)照組（轉(zhuǎn)染pEX-1空質(zhì)粒）、過(guò)表達(dá)組（轉(zhuǎn)染pEX-1-Nrf2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒）。過(guò)表達(dá)Nrf2后，RT-PCR和Western印跡法檢測(cè)PIG3V線粒體生物合成相關(guān)的Nrf2、核呼吸因子1（NRF1）、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（TFAM）mRNA和蛋白水平的變化；RT-PCR檢測(cè)線粒體DNA（mtDNA）拷貝數(shù)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體膜電位（MMP）；熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞ATP含量。采用兩樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果 Nrf2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PIG3V細(xì)胞后24 h，Nrf2 mRNA、NRF1 mRNA水平較對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001），而TFAM mRNA水平與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；48 h后Nrf2 mRNA、TFAM mRNA水平較對(duì)照組升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而NRF1 mRNA水平與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western印跡法顯示，轉(zhuǎn)染后24 h，過(guò)表達(dá)組Nrf2、NRF1、TFAM蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，48 h后過(guò)表達(dá)組Nrf2、NRF1、TFAM蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。過(guò)表達(dá)組MMP在轉(zhuǎn)染24 h后較對(duì)照組升高2.313%（t=5.546，P=0.005），48 h后升高14.872%（t=8.537，P=0.001）。線粒體合成指標(biāo)相對(duì)mtDNA拷貝數(shù)，在轉(zhuǎn)染24 h后兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），48 h后過(guò)表達(dá)組明顯高于對(duì)照組（t=5.760，P=0.005）；細(xì)胞ATP含量在轉(zhuǎn)染后24 h兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），48 h后過(guò)表達(dá)組ATP含量較對(duì)照組明顯升高（t=22.040，P=0.008）。結(jié)論 過(guò)表達(dá)Nrf2可以促進(jìn)黑素細(xì)胞線粒體生物合成相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)線粒體生物合成，上調(diào)線粒體功能相關(guān)的指標(biāo)。

白癜風(fēng)；黑素細(xì)胞；線粒體；NF-E2相關(guān)因子2；腺苷三磷酸

白癜風(fēng)是一種獲得性色素脫失性疾病，其發(fā)病機(jī)制不明，黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷在白癜風(fēng)的發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用［1］。線粒體是細(xì)胞內(nèi)重要的能源工廠和活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）來(lái)源，也是氧化應(yīng)激損傷首當(dāng)其沖的攻擊靶點(diǎn)［2］。白癜風(fēng)患者皮損周?chē)谒丶?xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞和朗格漢斯細(xì)胞以及外周血單一核細(xì)胞中線粒體形態(tài)及功能均發(fā)生異常［3］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，線粒體刺激劑聯(lián)合抗氧化劑可有效改善穩(wěn)定期白癜風(fēng)患者癥狀，使皮損區(qū)色素得到恢復(fù)［4］。核因子 E2相關(guān)因子 2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）通路是細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化通路，可促進(jìn)下游多種抗氧化因子的表達(dá)，發(fā)揮抗氧化作用。在過(guò)表達(dá)Nrf2后線粒體生物合成增加，功能改善，小鼠肝臟細(xì)胞壞死、凋亡減少［5］。Nrf2在肝臟、心肌細(xì)胞中促進(jìn)線粒體生物合成、改善線粒體功能的作用，在白癜風(fēng)黑素細(xì)胞是否存在［5-6］。本研究采用過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)上調(diào)白癜風(fēng)患者表皮黑素細(xì)胞系（PIG3V）Nrf2的表達(dá)，探討對(duì)線粒體生物合成和功能的影響。

資料與方法

一、資料與試劑

1.細(xì)胞來(lái)源：白癜風(fēng)患者表皮黑素細(xì)胞系PIG3V，由美國(guó)伊利諾斯州芝加哥Loyola大學(xué)Caroline Le Poole博士贈(zèng)送。該細(xì)胞系運(yùn)用反轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染16型人乳頭狀瘤病毒E6和E7開(kāi)放讀碼框得來(lái)，與正常黑素細(xì)胞生物學(xué)特性相似。

2.主要儀器和試劑：254培養(yǎng)基、HMGS、脂質(zhì)體Lipofectamine 2000為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品。Nrf2基因全長(zhǎng)過(guò)表達(dá)質(zhì)粒由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)、合成，基因長(zhǎng)度1 770 bp，克隆載體為pEX-1，克隆位點(diǎn)為XhoI/BamHI；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒、SYBR Premix Ex Taq II試劑盒為大連TaKaRa公司產(chǎn)品；Nrf2、核呼吸因子 1（NRF1）、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（TFAM）、ND4引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。Nrf2、NRF1、TFAM兔抗人單克隆抗體為美國(guó)Abcom公司產(chǎn)品?？功录?dòng)蛋白鼠單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物（HRP）標(biāo)記羊抗兔（羊抗鼠）IgG產(chǎn)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。MitoTracker?Red CMXRos為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品。Enliten?ATP檢測(cè)試劑盒產(chǎn)自美國(guó)Promego公司。Bio-rad IQ5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。BD FACSAria流式細(xì)胞分選儀。美國(guó)promega公司E5311熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)。

二、方法

1.Nrf2基因全長(zhǎng)過(guò)表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PIG3V細(xì)胞體系的建立：轉(zhuǎn)染需用無(wú)抗生素?zé)o血清的培養(yǎng)基，所用槍頭、微量離心管均需用DEPC水做無(wú)核酶、無(wú)DNA處理。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染同時(shí)在6孔板和25 cm2培養(yǎng)瓶中進(jìn)行，以便用于線粒體合成相關(guān)基因和蛋白表達(dá)、mtDNA拷貝數(shù)、線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）、細(xì)胞 ATP含量等檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)分為空白組（不含質(zhì)粒）、對(duì)照組（轉(zhuǎn)染pEX-1空質(zhì)粒）、過(guò)表達(dá)組（轉(zhuǎn)染pEX-1-Nrf2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒）。6 孔板每孔質(zhì)粒 4 μg，脂質(zhì)體 12 μl；25 cm2培養(yǎng)瓶每瓶質(zhì)粒 12 μg，脂質(zhì)體 30 μl。按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后無(wú)血清254培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)，6 h后換液，24 h觀察熒光。本質(zhì)粒帶綠色熒光，成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在藍(lán)光激發(fā)下胞質(zhì)顯示顆粒狀綠色熒光。

2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)與線粒體合成相關(guān)的 Nrf2、NRF1、TFAM mRNA 水平：提取處理后PIG3V細(xì)胞的mRNA，定量，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR引物序列：Nrf2 正向：5′-CTTGGCCTCAGTGATTCTG AAGTG-3′，反向：5′-CCTGAGATGGTGACAAGGGT TGTA-3′；NRF1 正向：5′-CCACGTTACAGGGAGGT GAG-3′，反向：5′-TGTAGCTCCCTGCTGCATCT-3′；TFAM 正向：5′-ACAGGATGATGACTATGGAA-3′，反向：5′-CAACTCTGAATACAATGTGAATT-3′；β 肌動(dòng)蛋白正向 5′-CGGGAAATCGTGCGTGACAT-3′，反向：5′-GAAGGAAGGcTGGAAG AGTG-3′。PCR 擴(kuò)增體系包括：cDNA模板2μl，引物正向和反向各1μl，SYBR Premix Ex Taq II 12.5 μl，ddH2O 8.5 μl。擴(kuò)增條件：預(yù)變性 95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，共 40 個(gè)循環(huán)，95℃ 1 min，65 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，1 個(gè)循環(huán)。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上讀取Ct值。以β肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參照。采用2-ΔΔCt法計(jì)算對(duì)特異性擴(kuò)增的目的基因進(jìn)行相對(duì)定量。

3.Wesrern印跡法檢測(cè)線粒體合成相關(guān)蛋白的表達(dá)：提取處理后PIG3V細(xì)胞總蛋白。蛋白定量，煮沸變性，電泳并用半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，封閉，分別加入兔抗人 Nrf2、NRF1、TFAM 抗體，4 ℃搖床上過(guò)夜，洗膜，加二抗，室溫2 h，洗膜，曝光顯影。以β肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參照對(duì)所得蛋白條帶圖進(jìn)行灰度分析。

4.線粒體生物合成檢測(cè)：通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞全基因組中mtDNA拷貝數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)線粒體生物合成水平，選擇線粒體DNA特征性基因ND4作為檢測(cè)的目標(biāo)基因，設(shè)計(jì)引物。PCR引物序列：ND4基因正向：5′-CCATTCTCCTCCTATCCCTCAAC-3′，反向：5′-CAC AATCTGATGTTTTGGTTAAACTATATTT-3′。提取處理后細(xì)胞總DNA，定量。PCR擴(kuò)增體系包括：DNA模板 0.36 μg（體積不同），10 μmol/L ND4引物 F 端和 R 端各 1 μl，SYBR Ⅱ Premix Ex TaqTM12.5 μl，加ddH2O適量補(bǔ)足反應(yīng)體系至25 μl。擴(kuò)增條件、結(jié)果分析同上文。相對(duì)mtDNA拷貝數(shù)=ND4基因DNA拷貝數(shù)/β肌動(dòng)蛋白基因拷貝數(shù)。

5.MMP檢測(cè)：常規(guī)消化細(xì)胞，生理氯化鈉液洗1遍，將MitoTracker?Red CMXRos按1∶5 000用無(wú)血清254培養(yǎng)基稀釋?zhuān)孟♂屢褐貞壹?xì)胞，37℃孵育30 min，每10分鐘振蕩1次，其后生理氯化鈉液洗3遍，用適量生理氯化鈉液重懸，上流式細(xì)胞儀，檢測(cè)PE通道的平均熒光強(qiáng)度值。MMP與平均熒光強(qiáng)度值正相關(guān)。

6.線粒體ATP產(chǎn)量檢測(cè)：將各組細(xì)胞常規(guī)消化，用254培養(yǎng)基重懸，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，每組各取4 500個(gè)細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。向細(xì)胞中加入2%三氯乙酸50 μl/管，室溫靜置10 min后向管中加入50 μl 4%三羥甲基氨基甲烷中和，1 000×g離心3 min，取上清液。使用Enliten?ATP檢測(cè)試劑盒，用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)RLU值。用試劑盒中ATP標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)立ATP濃度梯度RLU值，建立RLU值-ATP濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照擬合公式計(jì)算各樣品ATP含量。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：用graphpad prism 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。mRNA表達(dá)水平比較、mtDNA拷貝數(shù)、MMP、ATP含量比較采用兩樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、Nrf2基因全長(zhǎng)過(guò)表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PIG3V細(xì)胞體系的建立

轉(zhuǎn)染后24 h在倒置熒光顯微鏡下觀察，對(duì)比白光和藍(lán)光激發(fā)后圖像（圖1）。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)顆粒狀綠色熒光，胞核部位不顯示熒光，提示質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。

二、Nrf2過(guò)表達(dá)對(duì)線粒體合成相關(guān)基因mRNA和蛋白水平的影響

Nrf2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PIG3V細(xì)胞后24 h，過(guò)表達(dá)組Nrf2 mRNA、NRF1 mRNA水平均較對(duì)照組明顯升高（均P＜0.001），而TFAM mRNA水平較對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。48 h后Nrf2 mRNA、TFAM mRNA水平較對(duì)照組升高（均P＜0.05），而NRF1 mRNA水平較對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。Western印跡法結(jié)果顯示（圖 2），轉(zhuǎn)染后 24 h 時(shí)，過(guò)表達(dá)組 Nrf2、NRF1、TFAM蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；48 h 時(shí)，過(guò)表達(dá)組 Nrf2、NRF1、TFAM 蛋白均較對(duì)照組明顯升高（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

三、Nrf2過(guò)表達(dá)后細(xì)胞相對(duì)mtDNA拷貝數(shù)變化

圖1 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后細(xì)胞熒光圖（×400）：本質(zhì)粒帶綠色熒光，成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在藍(lán)光激發(fā)下，胞質(zhì)呈現(xiàn)綠色顆粒狀熒光，胞核無(wú)熒光 1A：pEX-1空質(zhì)粒組白光下圖像；1B：pEX-1空質(zhì)粒組藍(lán)光激發(fā)下圖像；1C：轉(zhuǎn)染pEX-1-Nrf2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組白光下圖像；1D：轉(zhuǎn)染pEX-1-Nrf2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組藍(lán)光下圖像

轉(zhuǎn)染后24 h，過(guò)表達(dá)組相對(duì)mtDNA拷貝數(shù)（0.247±0.172）與對(duì)照組（0.515±0.422）相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.820，P=0.473）；轉(zhuǎn)染后 48 h，過(guò)表達(dá)組（8.167±1.620）高于對(duì)照組（2.779±0.013），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.760，P=0.005）。

表1 黑素細(xì)胞過(guò)表達(dá)Nrf2后相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量（2-ΔΔCt，±s）

表1 黑素細(xì)胞過(guò)表達(dá)Nrf2后相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量（2-ΔΔCt，±s）

注：n=4。Nrf2：核因子E2相關(guān)因子2；NRF1：核呼吸因子1；TFAM：線粒體轉(zhuǎn)錄因子A

組別 24 h 48 h Nrf2 NRF1 TFAM Nrf2 NRF1 TFAM對(duì)照組 1.213±0.571 0.827±0.329 1.433±0.521 1.459±0.203 2.221±1.215 1.194±0.410過(guò)表達(dá)組 56.216±2.024 33.462±2.921 1.876±0.915 5.625±0.322 2.323±1.332 2.041±0.205 t值 45.301 19.230 0.729 18.956 0.098 3.200 P值 ＜0.001 ＜0.001 0.507 ＜0.001 0.927 0.033

四、Nrf2過(guò)表達(dá)后MMP的變化

Nrf2過(guò)表達(dá)后24 h，過(guò)表達(dá)組MMP平均熒光強(qiáng)度值（73.974±0.44）較對(duì)照組（72.302±0.28）升高2.313%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.546，P=0.005）。48 h后過(guò)表達(dá)組 MMP（16.537± 0.38）較對(duì)照組（14.396±0.21）升高14.872%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.537，P=0.001）。

五、Nrf2過(guò)表達(dá)后線粒體ATP產(chǎn)量的變化

圖2 過(guò)表達(dá)Nrf2后線粒體合成相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化1：過(guò)表達(dá)組；2：對(duì)照組。Nrf2：核因子E2相關(guān)因子2；NRF1：核呼吸因子1；TFAM：線粒體轉(zhuǎn)錄因子A

轉(zhuǎn)染后24 h，Nrf2過(guò)表達(dá)組ATP含量（1.593±2.122）×10-13mol/細(xì)胞與對(duì)照組（1.111±0.902）×10-13mol/細(xì)胞相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.418，P=0.691）；轉(zhuǎn)染后 48 h，Nrf2過(guò)表達(dá)組 ATP含量（12.820±0.561）×10-13mol/細(xì)胞較對(duì)照組（7.437±0.556）× 10-13mol/細(xì)胞明顯升高 （t=22.040，P=0.008）。

討 論

穩(wěn)定期白癜風(fēng)患者白斑區(qū)皮膚內(nèi)角質(zhì)形成細(xì)胞線粒體腫脹，線粒體嵴崩裂［7］。進(jìn)展期白癜風(fēng)患者白斑周邊皮膚內(nèi)黑素細(xì)胞線粒體腫脹，線粒體嵴重排；白斑周邊皮膚內(nèi)角質(zhì)形成細(xì)胞中的大部分線粒體內(nèi)膜、膜間隙和基質(zhì)腫脹，線粒體嵴重排，而正常對(duì)照皮膚相應(yīng)細(xì)胞中線粒體結(jié)構(gòu)正常［3］。線粒體損傷誘導(dǎo)的線粒體凋亡途徑是細(xì)胞凋亡主要途徑之一。因?yàn)榫€粒體損傷后MMP下降，ATP產(chǎn)生減少，膜通透性轉(zhuǎn)換小孔開(kāi)放，細(xì)胞色素C（Cyt-C）釋放至胞質(zhì)，形成Cyt-C/Apaf-1/procaspase-3凋亡復(fù)合體，引起procaspase-3激活成凋亡蛋白Caspase-3，進(jìn)而引起細(xì)胞的凋亡［8］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，黃芩素可以抑制線粒體Cyt-C釋放，從而減少氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的人黑素細(xì)胞凋亡，提示改善線粒體功能可提高黑素細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力［9］。

表2 黑素細(xì)胞過(guò)表達(dá)Nrf2后相關(guān)蛋白灰度分析（±s）

表2 黑素細(xì)胞過(guò)表達(dá)Nrf2后相關(guān)蛋白灰度分析（±s）

注：n=4。Nrf2：核因子E2相關(guān)因子2；NRF1：核呼吸因子1；TFAM：線粒體轉(zhuǎn)錄因子A

組別 24 h 48 h Nrf2 NRF1 TFAM Nrf2 NRF1 TFAM對(duì)照組 1.092±0.007 0.82±0.045 1.475±0.137 1.207±0.017 1.165±0.034 1.208±0.011過(guò)表達(dá)組 1.127±0.022 0.836±0.033 1.480±0.056 1.717±0.852 1.589±0.089 1.879±0.051 t值 1.530 0.293 0.032 5.870 4.464 12.850 P值 0.201 0.784 0.976 0.004 0.011 ＜0.001

研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2可直接調(diào)節(jié)小鼠神經(jīng)元和成纖維細(xì)胞線粒體呼吸作用，上調(diào)Nrf2后MMP升高，ATP生成增加，氧化磷酸化效率提高［10］。本研究在白癜風(fēng)患者黑素細(xì)胞中觀察到，過(guò)表達(dá)Nrf2后，MMP升高，細(xì)胞內(nèi)ATP含量增加，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果類(lèi)似［10］。在心肌細(xì)胞中，Nrf2入核與抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE）啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，使NRF1上調(diào)，上調(diào)的NRF1促進(jìn)TFAM表達(dá)，TFAM使線粒體合成增加［6］。本研究發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染Nrf2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后24 h，NRF1 mRNA即明顯升高，而TFAM mRNA無(wú)明顯變化；在48 h后NRF1 mRNA降至正常水平時(shí)，TFAM mRNA卻明顯升高。TFAM mRNA升高滯后于NRF1 mRNA升高的現(xiàn)象，提示NRF1是作為上游基因調(diào)控TFAM的升高，與小鼠肝臟細(xì)胞、心肌細(xì)胞內(nèi)的研究結(jié)果一致［5-6］。

Nrf2通路是細(xì)胞內(nèi)抗氧化應(yīng)激的主要通路。Nrf2在合成后與Keap1結(jié)合而處于無(wú)功能狀態(tài)，在ROS的作用下其與Keap1解離，進(jìn)而被磷酸化而激活。磷酸化的Nrf2發(fā)生核轉(zhuǎn)位，與ARE相結(jié)合，促進(jìn)一系列的抗氧化基因的表達(dá)，NRF1就是其中之一。NRF1上調(diào)后進(jìn)一步促進(jìn)TFAM表達(dá)，進(jìn)而使線粒體生物合成增加，功能障礙改善。另外，Nrf2基因可被 PI3K、PKC、JNK、ERK、P38 等信號(hào)分子激活［11-12］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)Nrf2可對(duì)氧化應(yīng)激作用下人黑素細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用，并且我們證實(shí)血紅素單加氧酶-1（heme oxygenase，HO-1）等抗氧化因子的上調(diào)是其發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制［12-13］。作為細(xì)胞內(nèi)作用廣泛的轉(zhuǎn)錄因子，Nrf2保護(hù)黑素細(xì)胞的機(jī)制可能不僅限于此。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)我們證實(shí)，在白癜風(fēng)黑素細(xì)胞中Nrf2改善線粒體功能，間接抑制線粒體凋亡途徑，可能是其抗氧化應(yīng)激作用的另一重要機(jī)制。

［1］Denat L,Kadekaro AL,Marrot L,et al.Melanocytes as instigators and victims of oxidative stress［J］.J Invest Dermatol,2014,134（6）：1512-1518.

［2］Murphy MP.How mitochondria produce reactive oxygen species［J］.Biochem J,2009,417（1）：1-13.

［3］Prignano F,Pescitelli L,Becatti M,et al.Ultrastructural and functional alterations of mitochondria in perilesional vitiligo skin［J］.J Dermatol Sci,2009,54（3）：157-167.

［4］Rojas-Urdaneta JE,Poleo-Romero AG.Evaluation of an antioxidant and mitochondria-stimulating cream formula on the skin of patients with stable common vitiligo［J］.Invest Clin,2007,48（1）：21-31.

［5］MacGarvey NC,Suliman HB,Bartz RR,et al.Activation of mitochondrial biogenesis by heme oxygenase-1-mediated NF-E2-related factor-2 induction rescues mice from lethalStaphylococcus aureussepsis［J］.Am J Respir Crit Care Med,2012,185（8）：851-861.

［6］Piantadosi CA,Carraway MS,Babiker A,et al.Heme oxygenase-1 regulates cardiac mitochondrial biogenesis via Nrf2-mediated transcriptional control of nuclear respiratory factor-1［J］.Circ Res,2008,103（11）：1232-1240.

［7］Panuncio AL,Vignale R.Ultrastructural studies in stable vitiligo［J］.Am J Dermatopathol,2003,25（1）：16-20.

［8］Stevens JM.Cytochrome c as an experimental model protein［J］.Metallomics,2011,3（4）：319-322.

［9］Liu B,Jian Z,Li Q,et al.Baicalein protects human melanocytes from H2O2-induced apoptosis via inhibiting mitochondriadependent caspase activation and the p38 MAPK pathway［J］.Free Radic Biol Med,2012,53（2）：183-193.

［10］Holmstr?m KM,Baird L,Zhang Y,et al.Nrf2 impacts cellular bioenergetics by controlling substrate availability for mitochondrial respiration［J］.Biol Open,2013,2（8）：761-770.

［11］No JH,Kim YB,Song YS.Targeting nrf2 signaling to combat chemoresistance［J］.J Cancer Prev,2014,19（2）：111-117.

［12］Jian Z,Li K,Song P,et al.Impaired activation of the Nrf2-ARE signaling pathway underminesH2O2-induced oxidative stress response：a possible mechanism for melanocyte degeneration in vitiligo［J］.J Invest Dermatol,2014,134（8）：2221-2230.

［13］Jian Z,Li K,Liu L,et al.Heme oxygenase-1 protects human melanocytes from H2O2-induced oxidative stress via the Nrf2-ARE pathway［J］.J Invest Dermatol,2011,131（7）：1420-1427.

2014-10-15）

（本文編輯：顏艷）

Effects of up-regulation of NF-E2-related factor 2 on mitochondrial biosynthesis and function in an immortalized human vitiligo melanocyte cell line PIG3V

Zhu Longfei,Tian Jun,Jian Zhe,Liu Bangmin,Xiao Qian,Li Chunying,Gao Tianwen.Department of Dermatology,Xijing Hospital,Fourth Military Medical University,Xi′an 710032,China

Gao Tianwen,Email：gaotw@fmmu.edu.cn

ObjectiveTo explore the effects of NF-E2-related factor 2（Nrf2）overexpression on mitochondrial biosynthesis and function in melanocytes.MethodsAn immortalized human vitiligo melanocyte cell line PIG3V was used in this study.An overexpression plasmid Nrf2-pEX-1 containing the full-length Nrf2 gene was constructed.PIG3V cells were divided into 3 groups：blank group receiving no treatment,control group transfected with the pEX-1 plasmid,overexpression group transfected with the Nrf2-pEX-1 plasmid.After transfection,real-time quantitative reverse transcription-PCR （RT-PCR） and Western blot were performed to determine the mRNA and protein levels of mitochondrial biosynthesis-related factors（including Nrf2,nuclear respiratory factor 1 （NRF1）and mitochondrial transcription factor A （TFAM））respectively;RT-PCR was also conducted to measure the copy number of mitochondrial DNA（mtDNA）,and flow cytometry to estimate mitochondial membrane potential（MMP）;luciferase reporter system was used to estimate the intracellular adenosine triphosphate（ATP）level.Statistical analysis was carried out by using a twosamplet-test.ResultsAfter transfection,a significant increase was observed in the mRNA expression levels of Nrf2 and NRF1 at 24 hours（bothP＜0.001）and in those of Nrf2 and TFAM at 48 hours（bothP＜0.05）,but no significant change was noted in the mRNA expression level of TFAM at 24 hours（P＞0.05）or in that of NRF1 at 48 hours（P＞0.05）in the overexpression group compared with the control group.In the case of Nrf2,NRF1 and TFAM protein levels,the overexpression group showed significant increases compared with the control group at 48 hours after transfection（allP＜ 0.05）,while no significant difference was noted between the two groups at 24 hours.Compared with the control group,MMP in the overexpression group increased by 2.313%at 24 hours（t=5.546,P=0.005）and by 14.872%at 48 hours（t=8.537,P=0.001）after transfection.Both the relative copy number of mtDNA and ATP level were similar between the overexpression group and control group at 24 hours after transfection （bothPgt;0.05）,but significantly higher in the overexpression group than in the control group at 48 hours （t=5.760,P=0.005;t=22.040,P=0.008）.ConclusionUp-regulation of Nrf2 pathway can improve mitochondrial function and biosynthesis in PIG3V cells likely by promoting the expressions of mitochondrial biosynthesis-related genes and proteins.

Vitiligo;Melanocytes;Mitochondria;NF-E2-related factor 2;Adenosine triphosphate

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.06.002

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81373844）；國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金（81102669、81402599）

710032西安，第四軍醫(yī)大學(xué)西京皮膚醫(yī)院

高天文，Email：gaotw@fmmu.edu.cn