窄譜中波紫外線聯(lián)合干擾素治療蕈樣肉芽腫療效及其與Treg/Th17細胞相關性研究

侯秀麗 王平 黎釗 聶慧瓊 劉東銀

窄譜中波紫外線聯(lián)合干擾素治療蕈樣肉芽腫療效及其與Treg/Th17細胞相關性研究

侯秀麗 王平 黎釗 聶慧瓊 劉東銀

目的 觀察窄譜中波紫外線（NB-UVB）單獨或聯(lián)合干擾素治療覃樣肉芽腫（MF）的療效，探討外周血調節(jié)性T（Treg）細胞和輔助性T細胞17（Th17）細胞與療效的相關性。方法 33例ⅠA期-ⅡA期MF患者按照治療方法分為兩組，分別應用NB-UVB單獨照射（照射組）和NB-UVB照射聯(lián)合重組人干擾素（INF）-α-2b肌內注射（聯(lián)合組）治療。于治療前和治療9個月后分別采集患者外周血，流式細胞儀檢測Treg細胞和Th17細胞百分率。以10例健康人外周血為對照組（健康對照組）。結果 平均治療時間9個月，照射組15例中，完全緩解6例，部分緩解3例，無效6例，聯(lián)合組18例中，完全緩解12例，部分緩解5例，無效1例，聯(lián)合治療效果顯著優(yōu)于單獨治療（P=0.023）。治療前兩組患者外周血Treg和Th17細胞百分率均明顯高于健康人（均P＜0.05），兩患者組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；治療后兩患者組Treg和Th17細胞百分率均顯著下降，但仍高于健康對照組（均P＜0.05）。聯(lián)合組Treg和Th17細胞降幅均大于照射組（均P＜0.05）。7例治療無效患者治療后外周血Treg細胞較治療前亦有降低（P＜0.05），Th17細胞無顯著下降（P＞0.05）。結論 NB-UVB照射聯(lián)合INF-α-2b肌內注射治療MF臨床療效優(yōu)于單獨使用NB-UVB，療效可能與外周血Treg和Th17細胞降幅有關。

紫外線療法；干擾素α；治療結果；T淋巴細胞，調節(jié)性；Th17細胞；蕈樣肉芽腫

蕈樣肉芽腫（MF）是一種低度惡性皮膚T細胞淋巴瘤（CTCL），大多起源于記憶性輔助性T細胞（CD4+T細胞），約占CTCL的50%［1］。典型 MF呈慢性惰性病程，經(jīng)歷紅斑期、斑塊期到腫瘤期可達幾十年時間，因此，多數(shù)MF采用非化學藥物治療，其中，紫外線照射和干擾素注射治療是早期MF最經(jīng)典有效的治療方法［2］。研究發(fā)現(xiàn)，外周血和皮損組織中調節(jié)性T（Treg）細胞和輔助性T細胞17（Th17）與MF病程密切相關［3］，且在MF等腫瘤性疾病的發(fā)生、發(fā)展及治療評估方面發(fā)揮重要作用［4-5］。本研究對33例早期MF病例長期隨訪，比較窄譜中波紫外線（NB-UVB）和 NB-UVB 聯(lián)合干擾素（INF）-α-2b治療早期MF的療效，比較治療前后外周血Treg和Th17細胞與療效的動態(tài)變化，分析外周血Treg和Th17細胞與療效的相關性。

對象與方法

一、對象

1.臨床資料：33例可隨訪患者均為我院皮膚科2008年7月至2013年7月經(jīng)臨床、組織病理、免疫表型和（或）基因重排克隆分析確診的MF病例，且無其他合并癥。男21例，女12例，發(fā)病年齡（31.7±16）歲，病程6月至17年，按TNMB分級均為MF早期（ⅠA期-ⅡA期）病例，對所有病例均進行登記、拍照、跟蹤隨訪。按照抽簽法隨機分為兩組：照射組15例采用單獨NB-UVB照射治療，男10例，女5例，平均年齡（30.8±12）歲，ⅠA～IB期10例，ⅡA期5例；聯(lián)合組18例采用NB-UVB照射聯(lián)合INF-α-2b注射治療，男11例，女7例，平均年齡（31.9±14）歲，ⅠA～ⅠB期11例，ⅡA期7例。平均治療時間約9個月，治療后隨訪時間3個月至3年。組間患者年齡、性別及病情嚴重程度差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。另外設健康對照組，男6例，女4例，年齡（32.2±2.1）歲，均來自同期健康體檢人員，年齡與照射組、聯(lián)合組差異也無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。本研究獲得杭州市第三人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，入選病例均簽署知情同意書。

2.主要儀器和試劑：Waldmann Medizintechnik UV7001 UV.B（德國Waldmann公司），SS-05紫外線光療儀（上海希格瑪高技術有限公司），波長311 nm。人Treg/Th17試劑盒以及同型對照抗體均產自美國BD公司。佛波酯、離子霉素混合液產自杭州聯(lián)科生物技術有限公司。淋巴分離液產自美國Sigma公司；RPMI1640培養(yǎng)液產自美國Gibco公司；胎牛血清產自浙江天杭生物科技有限公司。

二、治療方法

1.NB-UVB治療：照射組和聯(lián)合組均接受此治療。起始劑量為500 mJ/cm2，根據(jù)皮膚反應情況增減劑量，以10%～20%為宜。每周照射2～3次。如果單一增加劑量達不到療效，可增加照射次數(shù)至隔天1次，直至皮膚微紅后維持該劑量照射，最大劑量不超過2.0 J/cm2。30次為1個療程，此后維持治療，1周或2周照射1次。2010年前，7例（照射組3例，聯(lián)合組4例）維持治療，2010年后，26例（照射組12例，聯(lián)合組14例）不再維持治療，若有復發(fā)反復治療。

2.干擾素治療：聯(lián)合組18例患者接受重組人INF-α-2b（商品名因特芬，沈陽三生制藥有限責任公司）治療，采用300萬IU肌內注射，每周2～3次，3～6個月癥狀明顯緩解后，逐漸減至每周1次肌內注射，維持3～6個月，平均治療時間9個月。

3.療效評價［6］：治療 9 個月，完全緩解：皮損完全消退，并維持4周以上；部分緩解：皮損消退≥50%，并維持4周以上；無效：皮損消退＜50%或無變化。

三、外周血Treg/Th17細胞檢測

于治療前及治療9個月后采集患者肘靜脈血5 ml，入組時采集健康對照組肘靜脈血5 ml，肝素抗凝，3 000 r/min（半徑5 cm），離心15 min分離血漿。將下層血細胞與PBS緩沖液1∶1混合后緩慢加入4 ml淋巴細胞分離液中,獲得外周血單一核細胞（PBMC）。用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液重懸PBMC，加入4 μl佛波酯、離子霉素混合液（250X）和4 μl蛋白轉運抑制劑（包含莫能星），在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h。離心，應用胎牛血清（美國BD公司配套染色緩沖液）洗滌1遍，調整細胞濃度為2×106/ml，按照Th17/Treg PhenotyPing試劑盒說明操作，應用流式細胞儀進行檢測。

四、統(tǒng)計學處理

結 果

一、臨床療效

照射組15例中，完全緩解6例，部分緩解3例，無效6例。聯(lián)合組18例中，完全緩解12例，部分緩解5例，無效1例。照射組和聯(lián)合組患者平均30次照射治療，皮損情況明顯好轉，斑塊、斑片逐漸消退，瘙癢減輕，外觀皮膚基本正常，恢復時間2.5～3個月。其中照射組2例部分緩解患者和聯(lián)合組1例部分緩解患者病情有反復，重復治療后療效明顯。Fisher確切概率法顯示兩組有效率差異有統(tǒng)計學意義（P=0.023），聯(lián)合組療效優(yōu)于照射組。

二、患者組治療前后和對照組外周血Treg和Th17細胞水平比較

照射組和聯(lián)合組早期MF患者外周血Treg及Th17細胞百分率治療前差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），但顯著高于對照組（均P＜0.05）。治療后，照射組患者外周血Treg和Th17細胞百分率較治療前明顯下降（t值分別 為 4.954、3.828，均P＜ 0.05），聯(lián)合組亦顯著下降（t值分別為11.813、12.582，均P＜0.05），且聯(lián)合組Treg和Th17細胞降幅大于照射組（均P＜0.05）。見表 1，圖1。

表1 健康人及蕈樣肉芽腫患者治療前后外周血Treg及Th17細胞百分率比較（%，±s）

表1 健康人及蕈樣肉芽腫患者治療前后外周血Treg及Th17細胞百分率比較（%，±s）

注：a：與治療前比較，P ＜ 0.01；與照射組降幅比較，b：P ＜ 0.05，c：P ＜ 0.01

照射組 15 7.71±0.90 5.84±2.24a 1.88±1.47 3.41±1.20 2.68±1.52a 0.72±0.73聯(lián)合組 18 7.03±1.27 4.26±2.01a 2.78±1.00b 3.17±0.95 1.69±1.10a 1.48±0.50c健康對照組 10 0.69±0.24 - - 0.41±0.27 - -F值 174.691 - - 35.203 - -P值 ＜0.01 - - ＜0.01 - -

圖1 1例蕈樣肉芽腫患者治療前后Th17、Treg細胞比例 1A：治療前；1B：治療9個月后

三、不同療效患者外周血Treg和Th17細胞水平比較

33例患者根據(jù)療效分為3組，其中完全緩解組18例，部分緩解組8例和無效組7例，3組治療后Treg細胞百分率較治療前均顯著下降（均P＜0.05）；完全緩解組與部分緩解組Th17細胞百分率治療后較治療前均顯著下降（P＜0.05），而無效組Th17細胞下降不明顯（P＞0.05）。方差分析顯示，3組間Treg和Th17細胞降幅差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）；完全緩解患者外周血Treg細胞降幅大于部分緩解患者和無效患者（均P＜0.05）；完全緩解和部分緩解患者Th17細胞降幅顯著大于無效患者（均P＜0.01），但完全緩解和部分緩解患者之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 療效不同的蕈樣肉芽腫患者治療前后外周血Treg及Th17細胞百分率比較（%，±s）

表2 療效不同的蕈樣肉芽腫患者治療前后外周血Treg及Th17細胞百分率比較（%，±s）

注：a：與治療前比較，P ＜ 0.05；b：與無效組比較，P ＜ 0.05

Treg細胞 Th17細胞治療前 治療后 降幅 治療前 治療后 降幅完全緩解組 18 6.52±0.70 3.17±0.72a 3.35±0.63b 2.54±0.75 1.19±0.50a1.35±0.57b部分緩解組 8 8.04±0.81 6.23±0.80a 1.82±0.38b 3.79±0.25 2.36±0.35a1.44±0.33b無效組 7 8.65±0.54 8.19±0.59a 0.46±0.28 4.60±0.53 4.34±0.94 0.26±0.74 F值 28.748 140.009 82.476 31.279 72.688 10.868 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01組別 例數(shù)

四、不良反應

聯(lián)合組2例患者首次注射INF-α-2b出現(xiàn)輕微流感樣反應，低熱，繼續(xù)治療后不良反應消失。照射組無不良反應發(fā)生。

討 論

NB-UVB與長波紫外線相比，療效相當，但副作用明顯減少，不易灼傷皮膚，患者依從性較強［7-8］。NB-UVB可以逆轉以及提高機體免疫功能，促成表皮細胞的再生以及恢復，其治療MF機制可能與抑制表皮朗格漢斯細胞的抗原提呈功能、直接誘導表皮中T淋巴細胞凋亡并抑制真皮T淋巴細胞浸潤有關［9］。雖然高劑量和低劑量NB-UVB都能減少表皮中朗格漢斯細胞數(shù)量，但低劑量相對高劑量效果更好。因此，在減少表皮中朗格漢斯細胞數(shù)量上，小劑量慢速遞增的照射方法優(yōu)于快速遞增的方法［10］。干擾素是一種由單核細胞和淋巴細胞產生的具有多種功能的活性蛋白［11］，其抑制細胞分裂的活性有明顯的選擇性，對腫瘤細胞的活性抑制作用比正常細胞大上千倍。INF-α-2b抗腫瘤可直接抑制腫瘤細胞增殖，也可通過調節(jié)宿主免疫機制抑制腫瘤的生長，它對體液免疫、細胞免疫均有調節(jié)作用，對巨噬細胞及自然殺傷（NK）細胞也有一定的免疫增強作用［12］。干擾素是臨床上治療MF的一種經(jīng)典有效的手段，通常低劑量不引起或者只引起輕微不良反應［13］。本研究選擇的33例早期MF患者分組后分別用NB-UVB治療和INF-α-2b聯(lián)合NB-UVB治療，結果顯示聯(lián)合治療具有更好的療效。

Treg細胞和Th17細胞均參與自身免疫性疾病、腫瘤等疾病的發(fā)生和發(fā)展。研究表明，其在炎癥性疾病和腫瘤性疾病發(fā)展過程中呈遞增趨勢［14-15］，成為近年來醫(yī)學研究的一個熱點。Treg細胞和Th17細胞在炎癥反應中的作用可能相反。我們［3］對MF各期Treg細胞和Th17細胞的關系進行研究，發(fā)現(xiàn)早期MF患者外周血中Treg細胞與Th17細胞的數(shù)量呈正相關，表明二者存在相互作用。

本研究結果顯示，早期MF患者外周血Treg及Th17細胞百分率高于健康對照，提示Treg及Th17細胞可能在MF發(fā)病中起作用，經(jīng)聯(lián)合治療癥狀緩解后患者外周血Treg及Th17細胞百分率均明顯降低,提示MF的病情活動度與外周血Treg及Th17細胞百分率有一定關聯(lián)。另外，本文結果發(fā)現(xiàn)：聯(lián)合治療療效顯著優(yōu)于單獨治療，且聯(lián)合治療外周血Treg和Th17細胞降幅顯著高于單獨治療，可能與干擾素通過抑制Treg細胞功能提高機體的免疫功能狀態(tài)有關。無效患者也有Treg細胞的下降，且部分緩解和完全緩解組之間，Th17降幅差異無統(tǒng)計學意義，提示MF生物學行為的復雜性，Treg細胞與Th17細胞并非是決定MF治療反應的唯一因素。

本研究表明，重組人INF-α-2b聯(lián)合NB-UVB組治療效果明顯優(yōu)于單純NB-UVB治療組，雖有不良反應但可耐受，是一種安全有效的治療方法。

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2014-07-14）

（本文編輯：尚淑賢）

Therapeutic effect of narrow band-utraviolet B combined with interferon-alpha-2b for the treatment of mycosis fungoides and its correlation with Treg/Th17 cells

Hou Xiuli*,Wang Ping,Li Zhao,Nie Huiqiong,Liu Dongyin.*Department of Dermatology,Hangzhou Clinical College Affiliated to Anhui Medical University,Hangzhou 310009,China

Wang Ping,Email：dermwang@aliyun.com

ObjectiveTo evaluate the therapeutic effect of narrow band-ultraviolet B （NB-UVB）alone or in combination with interferon-alpha-2b（INF-alpha-2b）for mycosis fungoides（MF）,and to assess the correlation between the therapeutic effect and peripheral blood regulatory T （Treg）/T helper type 17 （Th17）cells.MethodsThirty-three patients with stage IA to IIA MF were randomly divided into two groups：NB-UVB group （n=15）receiving NB-UVB radiation alone,combined group （n=18）treated with NB-UVB radiation and intramuscular injection of INF-alpha-2b.Ten healthy volunteers were selected as the control group.Peripheral blood samples were collected before and 9 months after the start of treatment.Flow cytometry was performed to determine the percentages of Treg cells and Th17 cells.Statistical analysis was carried out by usingttest,one-way analysis of variance,and Fisher′s exact test.ResultsThe average treatment duration was 9 months among these patients.Therapeutic outcomes were significantly better in the combined group than in the NB-UVB group （P=0.023）.Among the 15 patients in the NB-UVB group,6 achieved complete remission,3 partial remission,6 showed no response;of the 18 patients in the combined group,12 experienced complete remission,5 partial remission,and 1 showed no response.Before the treatment,the percentages of both Treg and Th17 cells in peripheral blood were significantly higher in the NB-UVB group and combined group than in the control group（bothP＜ 0.05）,but similar between the NB-UVB group and combined group（bothP＞ 0.05）.After the treatment,the percentages of both Treg and Th17 cells in the NB-UVB group and combined group significantly decreased compared with those before the treatment,but were still higher than those in the control group （bothP＜0.05）.Additionally,the degree of decrease in the percentages of Treg and Th17 cells was significantly greater in the combined group than in the NB-UVB group（bothP＜ 0.05）.The seven patients with no response also showed a significant decrease in the percentage of Treg cells（P＜ 0.05）,but no obvious changes in that of Th17 cells（P＞ 0.05）after the treatment.ConclusionsThe therapeutic effect of NB-UVB radiation combined with intramuscular INF-alpha-2b is superior to that of NB-UVB radiation alone for MF,which may be associated with the degree of decrease in peripheral blood Treg and Th17 cells.

Ultraviolet therapy;Interferon-alpha;Treatment outcomes;T-lymphocytes,regulatory;Th17 cells;Mycosis fungoides

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.06.003

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目（2014KYB200）；杭州市醫(yī)學重點?？茖２№椖浚?0100733Q08、20140733Q19）

310009杭州，安徽醫(yī)科大學附屬杭州臨床學院皮膚科（侯秀麗、王平、聶慧瓊）；杭州市第三人民醫(yī)院皮膚科（黎釗、劉東銀）

王平，Email：dermwang@aliyun.com