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    辣椒炭疽病原菌生物學特性研究

    2015-12-01 09:09:44程勛東隋益虎
    安徽科技學院學報 2015年1期
    關鍵詞:孢子菌絲菌落

    程勛東,隋益虎

    (安徽科技學院 生命科學學院,安徽 鳳陽 233100)

    辣椒(Capsicum spp.)種植面積居我國蔬菜作物第二位,是市場上最為常見的蔬菜之一[1]。常見辣椒病害主要有炭疽病、疫病、病毒病等[2],尤其炎熱潮濕的氣候條件有利炭疽病發(fā)生,發(fā)病后會造成大量落葉和爛果,通常減產20% ~50%,嚴重影響辣椒商品性[3]。據(jù)報道各地辣椒炭疽病致病的病原菌有一定的差異,主要有辣椒叢刺盤孢菌(Vermicularia capsici Syd)、辣椒盤長孢菌(G.piperatum Ell.et EV)、膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)等[4],本研究通過對本地辣椒炭疽菌進行初步鑒定,并進行生物特性研究,為辣椒果實炭疽病的栽培預防及防治提供基礎性資料,以期提高辣椒果實質量。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    表現(xiàn)為典型炭疽病癥狀的辣椒果實取自安徽科技學院種植科技園3號溫室。

    1.2 病原菌的分離和純化

    首先將試驗材料用自來水將表面的泥漬等洗凈后晾干,接著用70%的酒精進行表面消毒30 s,然后用0.1%的氯化汞將材料消毒6 min,迅速用滅菌水沖洗3次。用手術刀片于果實表面切口,用接種針挑取內部病害部位病原菌接種至PDA培養(yǎng)基(組份為葡糖糖20 g、瓊脂20 g、去皮土豆200 g,蒸餾水1000 mL,煮沸30 min,自然pH值),28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3~4 d。觀察培養(yǎng)皿中各菌落的生長狀況,包括菌落的大小、形狀、顏色等形態(tài)特征,挑取單菌落在培養(yǎng)基上28℃進行純培養(yǎng),并將各菌株劃線純培養(yǎng)于PDA試管斜面保存,為下列試驗提供原始菌株。

    1.3 病原菌產孢誘導及鑒定

    為了鑒定材料中分離得到的病原菌,首先對其誘導產孢,根據(jù)唐景美[5]等對辣椒炭疽病菌生物學特性以及分生孢子的特性研究,設計了幾種誘導產孢的方法(如表1),其中PDA+辣椒培養(yǎng)基為上述PDA培養(yǎng)基中添加辣椒葉片50 g。待菌落產孢后,觀察菌落的形態(tài)特征,并利用數(shù)碼顯微鏡(Motic,BA210)觀察孢子和孢子梗的形態(tài)特點并拍照,進行病原菌初步鑒定。

    表1 促進病原菌產孢的處理方式Table 1 Treatment combinations of inducing pathogen to spore

    1.4 溫度對病原菌菌絲生長影響

    將直徑為4 mm的菌齡相同生長旺盛的菌餅無菌操作轉移到PDA培養(yǎng)基平板的中央,分別置于15、20、25、30、35和40℃溫度梯度下連續(xù)培養(yǎng),每種處理3次重復。5 d后采用十字相交的方式測量各菌落的直徑并計算3次重復的平均值。比較不同溫度條件下病原菌菌絲生長速率。

    1.5 培養(yǎng)基成分對病原菌菌絲生長影響

    將大蒜、芥菜、小白菜、番茄、辣椒5種不同種類蔬菜的葉片洗凈晾干后各自稱取5 g,分別與土豆20 g,葡糖糖2 g,瓊脂2 g,蒸餾水100 mL制成相應的PDA復合培養(yǎng)基,對照培養(yǎng)基成分為土豆25 g(去皮),葡糖糖2 g,瓊脂2 g,蒸餾水100 mL。將直徑為4 mm菌齡相同生長旺盛的菌餅無菌操作轉移到6種不同成分培養(yǎng)基平板的中央,置于28℃條件下連續(xù)培養(yǎng),每種處理3次重復,菌落直徑測量方法同上。比較含不同種類蔬菜成分的培養(yǎng)基中病原菌菌絲生長速率。

    取紫色辣椒7036、9007-1、1127、1121P -3和綠色辣椒1123G -3、1126-2、1116-2、111SL -1共8種不同品種的辣椒葉片洗凈晾干,利用隋益虎等[6]紫色辣椒葉片色素的優(yōu)化提取方法,比較不同品種辣椒葉片色素的相對含量。將8個品種的辣椒葉片洗凈晾干后各稱取5 g,分別與土豆20 g(去皮),葡糖糖2g,瓊脂2g,蒸餾水100 mL,制成相應的PDA復合培養(yǎng)基。以含25 g去皮土豆的PDA培養(yǎng)基為對照培養(yǎng)基。將直徑4 mm菌齡相同生長旺盛的菌餅菌絲面朝下無菌操作轉移到6種含有不同辣椒葉片成分的培養(yǎng)基中央,置于28℃條件下連續(xù)培養(yǎng),每種處理3次重復,菌落直徑測量方法同上。比較含不同品種辣椒成分培養(yǎng)基中病原菌菌絲生長速率。

    1.6 光照條件對病原菌菌絲生長影響

    將直徑為4 mm的菌齡相同生長旺盛的菌餅菌絲面朝下無菌操作轉移到PDA培養(yǎng)基中央,分別置于24 h完全光照、12 h光暗交替、24 h完全黑暗3種光照條件28℃條件下連續(xù)培養(yǎng),每種處理3次重復,菌落直徑測量方法同上。比較不同光照條件下病原菌菌絲生長速率。

    1.7 數(shù)據(jù)分析

    所得的數(shù)據(jù)均采用Microsoft Excel 2003進行方差分析和SPSS 16.0進行單因素多重比較處理。

    2 結果與分析

    2.1 病原菌誘導產孢及鑒定

    經過分離純化的病原菌在PDA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)5 d后,觀察可知各菌落形態(tài)基本一致,菌落直徑約為66.67 mm,邊緣較圓整,菌落呈同心圓形狀,生長初期菌絲為白色,后期變?yōu)榛野咨翜\褐色(圖1)。誘導產孢試驗表明,病原菌在PDA培養(yǎng)基上正常培養(yǎng)不產孢子或產生極少量孢子,在光暗交替以及先低溫后高溫培養(yǎng)下能促進產孢,而其他處理組均未觀察到明顯的孢子產生。可能是因為不利的溫光環(huán)境條件或不當?shù)臓I養(yǎng)元素比例,能促進該病原菌產生孢子。

    顯微鏡下觀察病原菌分生孢子和孢子梗的特征,分生孢子呈圓柱狀,無色,部分孢子兩端為弧形,部分孢子一端尖一端弧形,孢子梗直立呈短圓柱形,具有2~4個隔膜(圖2)。根據(jù)這些病原菌的形態(tài)特征,參考鄭建秋[7]、吳文平[4]和陸家云[8]等的描述,初步鑒定可知分離純化的病原菌為膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)。

    2.2 溫度對病原菌生長的影響

    在所設置的6種溫度條件下連續(xù)培養(yǎng)5 d發(fā)現(xiàn),在15~35℃范圍內病原菌菌絲均能生長。但是不同的溫度條件下,菌落直徑大小各不相同。在15~25℃范圍內,菌落直徑和溫度高低呈正相關關系;在25~35℃范圍內,菌落直徑和溫度高低呈負相關關系;40℃高溫對該菌菌絲的生長有明顯的抑制作用;25℃時菌落直徑最大??芍?個溫度梯度中,25℃為該病原菌的最適生長溫度,最適溫度范圍為25~30℃,而菌絲能否生長的高溫臨界溫度在35~40℃之間(表2)。

    表2 不同溫度條件下炭疽菌落的直徑Table 2 Diameter of the colony under the different temperature gradient

    2.3 培養(yǎng)基對病原菌生長的影響

    2.3.1 不同種類蔬菜成分對病原菌生長的影響 供試的含有不同蔬菜成分的PDA固體培養(yǎng)基上,該病原菌在含有芥菜和大蒜葉片成分的培養(yǎng)基中菌落直徑最小,與含有辣椒、小白菜和番茄3種葉片成分的培養(yǎng)基上的菌落直徑相比有顯著差異;在含有大蒜成分的培養(yǎng)基上生長狀況顯著差于在含有其他4種成分培養(yǎng)基上的生長狀況;而含有辣椒、小白菜、番茄葉片成分的培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基的生長狀況沒有顯著差異(表3)。

    表3 含有不同蔬菜葉片成分的培養(yǎng)基中菌落的直徑Table 3 Diameter of the colony growing in the PDA-based culture medium supplemented with different composition of various vegetables

    2.3.2 不同品種辣椒成分對病原菌生長的影響 葉片色素的吸光度值測定表明,不同品種的辣椒中色素含量差別很大,紫色辣椒花青素含量較普通綠色辣椒高,但含有不同辣椒葉片成分的培養(yǎng)基中,病原菌菌絲均能夠正常生長,培養(yǎng)5 d后菌落直徑沒有顯著差異,各處理菌落的形態(tài)較為一致(表4)。

    表4 含有不同花青素成分的辣椒品種培養(yǎng)基中菌落的直徑Table 4 Diameter of the colony growing in the PDA-based culture medium supplemented with different content of anthocyanin in chilli pepper varieties

    2.4 光照對病原菌生長的影響

    在不同的光照條件下,病原菌菌絲均能夠生長,各處理菌落直徑和菌絲顏色較為一致。24h完全光照、12h光暗交替和 24h完全黑暗處理菌落直徑分別為 67.50 ±2.12、66.67 ±1.53和 66.00 ±2.00(mm),方差分析表明3種光照處理下菌落直徑大小無顯著性差異,可見病原菌菌絲的生長不受光照條件的影響。

    3 結論與討論

    通過對辣椒炭疽病果實中分離得到的病原菌誘導產孢,根據(jù)形態(tài)學特征對其進行初步鑒定。結果表明經分離純化得到的菌株均為膠孢炭疽菌,該病原菌在28℃下培養(yǎng)僅能產生少量的孢子,而在光暗交替或者冷熱交替條件下培養(yǎng),能產生大量的孢子。病原菌菌絲的生長不受光照條件的影響。

    溫度在15~35℃之間病原菌菌絲均可以生長,在25~30℃之間菌絲生長速率相較其它培養(yǎng)溫度最快,25℃時速率最大即為最適溫度,35~40℃為菌絲生長高溫臨界溫度。該試驗結果和張海英等[9]對引起草莓上膠孢炭疽病以及范曉龍等[10]對紅豆杉上的膠孢炭疽菌的研究結果基本一致。由于試驗當中溫度梯度范圍有限,只獲得該病原菌的最適生長溫度范圍和高溫臨界溫度范圍,可通過在25~30℃之間以及15℃以下設置系列濃度梯度,以更精確地獲知該病原菌的生長最適溫度和低溫臨界溫度。

    試驗發(fā)現(xiàn)大蒜和芥菜對膠孢炭疽菌生長均有較強的抑制作用。有研究[11-13]表明大蒜中含有大蒜素,它是由大蒜體內的大蒜酶催化大蒜氨酸轉化產生,具有強烈的刺激性氣味,有較強的抗菌消炎作用,能夠抑制或殺滅多種病菌。芥菜中含有揮發(fā)性的芥子油成分,該成分具有一定的刺激性,可能與抑菌作用有關,其具體的作用機制還有待進一步研究[14]。由于本研究在培養(yǎng)基滅菌過程中,會使得部分大蒜素和芥子油分解或揮發(fā),從而削弱了二者的抑菌殺菌作用。若采用組織培養(yǎng)的方法獲得大蒜和芥菜的無菌苗,無菌操作研磨并提取大蒜素和芥子油加入到供試培養(yǎng)基當中,則二者對該病原菌的抑制作用可能更強。同時,二者在大面積保護地或露地栽培中是否也有良好的抑菌作用,還有待進一步研究驗證。

    不同品種的辣椒葉片花青素的含量各不相同,7036、9007-1、1127、1121P-3等4個品種為紫色辣椒,紫色辣椒的莖、葉、花、幼果等器官中因富含花青素均表現(xiàn)為紫色,與普通的綠色辣椒相比,紫色辣椒植株表現(xiàn)出許多優(yōu)良特性,比如抗病、抗逆性強[15-16]等,這可能與其中包含較高含量花青素有關。但在含有紫色辣椒成分的培養(yǎng)基中并未表現(xiàn)出對病原菌的抑制作用,可能與培養(yǎng)基滅菌的過程中該成分高溫高壓分解有關。因此尚需通過組織培養(yǎng)獲得無菌植株,在無菌操作下獲取研磨液再加入高溫高壓滅菌后的培養(yǎng)基中,才能確定紫色辣椒中花青素組分是否對該病原菌具有抑制作用。

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