一株毒死蜱降解菌的固定化條件優(yōu)化研究

段海明，余 利，張 揚(yáng)，張 耀

(安徽科技學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，安徽 鳳陽(yáng) 233100）

毒死蜱，化學(xué)名稱O，O－二乙基－O－(3，5，6－三氯－2－吡啶基)硫代磷酸酯，是一種在世界范圍內(nèi)使用長(zhǎng)達(dá)約50年的殺蟲劑，又名樂斯本、白蟻清等，主要用于多種大田作物、果樹和蔬菜害蟲的防治[1]。但是，毒死蜱的廣泛生產(chǎn)和使用，已經(jīng)直接或間接的造成對(duì)水體、土壤和大氣的污染[2]。眾多研究證明，毒死蜱能夠通過(guò)皮膚進(jìn)入人體，并且在人體內(nèi)有累積現(xiàn)象。據(jù)報(bào)道，毒死蜱在無(wú)明顯毒性效應(yīng)下即可對(duì)大腦發(fā)育或功能產(chǎn)生影響，低劑量就可引起DNA或蛋白質(zhì)合成的特異性抑制，長(zhǎng)期或重復(fù)施予亞毒性劑量可對(duì)細(xì)胞、神經(jīng)軸突等產(chǎn)生影響，甚至可引起行為的改變。此外，毒死蜱可能為一種疑似致畸劑，引起令人擔(dān)憂的出生缺陷和生殖細(xì)胞的DNA損傷等[3]。因此，毒死蜱污染環(huán)境的生物修復(fù)研究對(duì)于生態(tài)安全和人類健康具有重要意義。

研究表明，固定化細(xì)胞對(duì)各種外界因素的適應(yīng)能力加強(qiáng)，微生物固定后不僅保持了生命活力，還可大幅度提高菌體密度，且便于固液分離，降解效率得以較大提高[4]。朱魯生等[5]采用海藻酸鈉溶膠把分離到的莠去津降解菌Arthrobacter sp.HB－5進(jìn)行了固定化，并對(duì)土壤中含有的莠去津進(jìn)行了降解試驗(yàn)，降解效果較好;Bazot S等[6]也采用海藻酸鈉對(duì)Arthrobacter sp.N4和Delftia acidovorans W34兩菌株進(jìn)行了共固定化，探討固定化菌對(duì)敵草隆的降解特性。本實(shí)驗(yàn)室已分離出降解毒死蜱的高效降解菌－蠟狀芽孢桿菌，并已對(duì)其降解特性進(jìn)行了研究，游離化菌在一定條件下對(duì)100mg/L毒死蜱的降解率達(dá)到64.8%[7]。

本研究在探明不同菌齡的游離化菌對(duì)毒死蜱降解的影響基礎(chǔ)之上，系統(tǒng)開展了固定化蠟狀芽孢桿菌對(duì)毒死蜱的降解曲線以及不同的包埋比、固定化時(shí)間、成型劑的濃度和海藻酸鈉溶膠的濃度對(duì)固定化菌降解毒死蜱的影響研究，最后采用正交試驗(yàn)的方法優(yōu)選出固定化菌的最佳制作方法，以期為固定化微生物降解毒死蜱提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試降解菌株 以從山東某農(nóng)藥企業(yè)生化廢水處理池中分離到的蠟狀芽孢桿菌為研究對(duì)象，在Genbank上的注冊(cè)登錄號(hào)為eu915686。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 普通培養(yǎng)基、基礎(chǔ)培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基的配制參照參考文獻(xiàn)[8－9]。

1.1.3 供試藥品 95.9%毒死蜱原藥(山東華陽(yáng)農(nóng)藥化工集團(tuán)有限公司)配成48%毒死蜱乳油于4℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?按試驗(yàn)方案配制不同濃度海藻酸鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)溶膠，115℃滅菌15 min后備用;無(wú)水CaCl2(江蘇宜興第二化學(xué)試劑廠)用去離子水配成2%的CaCl2溶液，用作海藻酸鈉固定化菌的成型劑;石油醚(AR，天津市永大化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 降解菌的培養(yǎng)和菌體的制備 無(wú)菌條件下將菌株接種到普通培養(yǎng)基平板上，在32℃恒溫箱中培養(yǎng)72 h，待菌苔長(zhǎng)出后取2接菌環(huán)于100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于33℃，150 r·min－1搖培20 h，將培養(yǎng)好的菌體置于低溫冷凍離心機(jī)中離心、洗滌后獲取菌體備用。

1.2.2 不同菌齡的蠟狀芽孢桿菌對(duì)毒死蜱降解的影響 為了明確不同菌齡的游離化降解菌對(duì)毒死蜱降解的影響，菌株在LB培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)10、15、20、25和30 h，以獲取不同菌齡的菌體。然后于4℃、8000 r·min－1離心10 min收集菌體，用滅菌蒸餾水洗滌3次后離心獲取菌體，最后采用滅菌蒸餾水調(diào)節(jié)接種菌懸液的OD600=2.5備用，接種量為10%(V/V)，基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制的毒死蜱初始濃度為50 mg/L，降解反應(yīng)液的總體積為10 mL。上述配制好的反應(yīng)液裝于50 mL滅菌三角瓶中，于33℃，150 r·min－1搖培24 h，以不接菌的含有50 mg/L毒死蜱的基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為對(duì)照，每一處理重復(fù)3次。培養(yǎng)結(jié)束后提取測(cè)定培養(yǎng)液中毒死蜱的殘留量，計(jì)算降解率。

1.2.3 固定化菌的制備方法 海藻酸鈉溶膠先在115℃下滅菌15 min，冷卻至室溫后把2 mL菌懸液加入10 mL海藻酸鈉溶膠中，充分?jǐn)嚢杌靹?，然后用容積為20 mL的玻璃注射器(針頭內(nèi)徑為0.6 mm)吸取菌體和溶膠的混合液滴入到2%(m/V)的CaCl2溶液中造粒。造粒完畢后，固定化小球繼續(xù)保持在上述CaCl2溶液中于4℃冰箱中交聯(lián)24 h，最后用0.85%的滅菌生理鹽水洗滌、過(guò)濾固定化菌，在無(wú)菌濾紙上晾干后備用。

1.2.4 固定化蠟狀芽孢桿菌對(duì)毒死蜱的降解曲線 在50 mL三角瓶中加入10 mL采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制的毒死蜱初始濃度為50 mg/L的藥液，將預(yù)先制備好的固定化菌以80g/L的接菌量接種，于33℃、150 r·min－1搖培12、15、18、21、24和27 h，以不接種固定化菌的含藥基礎(chǔ)培養(yǎng)基為空白對(duì)照，每一處理重復(fù)3次，確定固定化菌對(duì)毒死蜱的降解曲線。

1.2.5 不同包埋比對(duì)固定化菌降解毒死蜱的影響 分別稱取以1.2.1的方法獲得的菌體0.1g、0.2 g、0.25 g、0.33 g、0.5 g 和1.0 g 加入到2.0 mL 0.85%的滅菌生理鹽水中混勻，然后將菌液加入 10 mL 2.5%的海藻酸鈉溶膠中，充分?jǐn)嚢杈鶆?，使包埋?菌體質(zhì)量與溶膠的體積比:m/V)分別為1∶100、1∶50、1∶40、1∶30、1∶20和1∶10。依照1.2.3的方法造粒，于4℃冰箱中固定化24 h。在50mL三角瓶中加入10mL初始濃度為50mg/L的毒死蜱，固定化菌的接種量為80g/L，于33℃、150 r·min－1搖培24 h，以不接種固定化菌的含藥基礎(chǔ)培養(yǎng)基為空白對(duì)照，每一處理重復(fù)3次，檢測(cè)不同的包埋比對(duì)毒死蜱降解的影響。

1.2.6 不同固定化時(shí)間對(duì)固定化菌降解毒死蜱的影響 稱取以1.2.1的方法獲得的菌體以包埋比為1∶20的比例混合均勻，依照1.2.3的方法制備固定化菌，于4℃冰箱中分別交聯(lián)8 h、16 h、20 h、24 h、28 h、32 h和40 h，其它同1.2.5。檢測(cè)不同固定化時(shí)間對(duì)毒死蜱降解的影響。

1.2.7 不同濃度的成型劑對(duì)固定化菌降解毒死蜱的影響 稱取以1.2.1的方法獲得的菌體以包埋比為1∶20的比例混合均勻，然后用容積為20 mL的玻璃注射器(針頭內(nèi)徑為0.6 mm)吸取菌體和溶膠的混合液，分別滴入濃度為1.5%、2%、3%、3.5%、4%和5%的CaCl2溶液中固定化，于4℃冰箱中交聯(lián)28 h，其它同1.2.5。檢測(cè)不同濃度的成型劑對(duì)毒死蜱降解的影響。

1.2.8 不同濃度的海藻酸鈉對(duì)固定化菌降解毒死蜱的影響 稱取以1.2.1的方法獲得的菌體0.5 g加入2.0 mL 0.85%的滅菌生理鹽水中混合均勻，然后把菌液加入到10 mL濃度分別為2%、2.5%、3%、3.5%和4%的海藻酸鈉溶膠中，充分?jǐn)嚢杈鶆?。其它?.2.7。檢測(cè)不同濃度的海藻酸鈉對(duì)固定化菌降解毒死蜱的影響。

1.2.9 正交試驗(yàn)優(yōu)化固定化菌的包埋條件 本試驗(yàn)選擇海藻酸鈉濃度、CaCl2濃度和固定化時(shí)間為3個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平，以1.2.3的方法制備固定化菌，以制得的固定化菌對(duì)50 mg/L毒死蜱的降解率為目標(biāo)函數(shù)，采用L9(34)的正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)(表1)，通過(guò)分析得出各因素對(duì)毒死蜱降解的影響次序和各因素應(yīng)選取的最優(yōu)水平。

表1 正交試驗(yàn)表設(shè)計(jì)Table 1 Orthogonal experiment designment

1.3 毒死蜱殘留測(cè)定方法和數(shù)據(jù)分析

固定化菌降解毒死蜱結(jié)束之后，取5 mL反應(yīng)液用等體積的石油醚提取2次，合并2次提取液后檢測(cè)。利用毒死蜱在λ=290 nm[10]左右處有紫外吸收峰的特性，通過(guò)紫外分光光度計(jì)掃描確定在λ=292 nm處測(cè)定樣品的OD292，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中毒死蜱的含量，計(jì)算毒死蜱的降解率。試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌齡的游離化菌對(duì)毒死蜱降解的影響

由圖1可見，游離化蠟狀芽孢桿菌的菌齡從10 h增至20 h時(shí)，降解率逐漸上升，菌齡為20 h時(shí)獲得的菌體(菌體密度為OD600=2.5)對(duì)毒死蜱的降解率達(dá)60.3%，而培養(yǎng)時(shí)間從20 h增至30 h時(shí)，降解率則逐漸下降。因此，在本研究中蠟狀芽孢桿菌降解毒死蜱的菌齡為20 h。

2.2 固定化菌對(duì)毒死蜱的降解曲線

從圖2可見，固定化菌對(duì)毒死蜱降解的反應(yīng)時(shí)間從12 h增至27 h，降解率逐漸上升，24 h對(duì)毒死蜱的降解率達(dá)到75.4%，24 h之后固定化菌對(duì)毒死蜱的降解速率減慢，降解率增幅較小。因此，確定下一步試驗(yàn)固定化菌對(duì)50 mg·L－1毒死蜱的反應(yīng)時(shí)間為24 h。

2.3 不同包埋比對(duì)毒死蜱降解的影響

由圖3可見，菌體和海藻酸鈉溶膠的包埋比從1∶100增加到1∶20時(shí)對(duì)50 mg/L毒死蜱的降解率逐漸增大，包埋比為1∶20達(dá)最大為76.8%，包埋比繼續(xù)增大降解率則呈下降的趨勢(shì)。因此，確定包埋比為1∶20時(shí)對(duì)50 mg/L毒死蜱的降解率最高。

2.4 不同固定化時(shí)間對(duì)毒死蜱降解的影響

由圖4可見，蠟狀芽孢桿菌的固定化時(shí)間從8 h增至28 h，降解率呈上升趨勢(shì)，固定化時(shí)間為28 h時(shí)，降解率達(dá)最大為81.7%，28 h之后降解率則逐漸下降。因此，為提高蠟狀芽孢桿菌對(duì)毒死蜱的的降解效果，確定蠟狀芽孢桿菌菌液在海藻酸鈉溶膠中的固定化時(shí)間為28 h。

2.5 不同濃度成型劑對(duì)毒死蜱降解的影響

由圖5可見，隨著成型劑CaCl2濃度的增大，固定化菌對(duì)毒死蜱的降解率先上升后下降。CaCl2濃度為2%降解率達(dá)最大為82.6%。然而，隨著成型劑濃度的再次升高，固定化菌對(duì)50 mg/L毒死蜱的降解率則逐漸下降，在CaCl2濃度上升到5%達(dá)到最低為68.4%。因此，可以確定，固定化菌成型劑濃度為2%時(shí)對(duì)50 mg/L毒死蜱的降解率最高，效果較好。

2.6 不同濃度海藻酸鈉包埋對(duì)降解率的影響

由圖6可見，隨著包埋劑海藻酸鈉濃度的增大，固定化菌對(duì)毒死蜱的降解率先上升后降低。海藻酸鈉濃度為3%時(shí)降解率達(dá)最大為85.7%，包埋劑濃度從2.5%上升到3.5%時(shí)降解率分布在83% ～86%之間(p＜0.05)。因此，可以根據(jù)固定化菌不同的使用要求和條件而采用不同濃度的海藻酸鈉溶膠包埋。

2.7 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS13.0分析軟件方差分析，結(jié)果表明，海藻酸鈉濃度(p=0.003)、CaCl2濃度(p=0.004)和交聯(lián)時(shí)間(p=0.001)三因素對(duì)固定化菌降解毒死蜱的影響都達(dá)到顯著水平，影響次序依次為固定化時(shí)間＞海藻酸鈉濃度＞CaCl2濃度。通過(guò)正交試驗(yàn)選出的最優(yōu)水平分別為:海藻酸鈉濃度為3.0%，CaCl2濃度為1.5%，固定化時(shí)間為32 h。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

固定化降解菌能夠保持細(xì)胞的濃度和純度，對(duì)于農(nóng)藥污染的消除與其它方法相比具有不可比擬的優(yōu)勢(shì)[11]。在固定化微生物降解農(nóng)藥的過(guò)程中，降解菌的菌齡、包埋比和海藻酸鈉濃度、成型劑CaCl2濃度和固定化時(shí)間等因素會(huì)影響微生物的活性、含菌量、固定化菌的機(jī)械強(qiáng)度、傳質(zhì)效果等，最終決定了對(duì)目標(biāo)污染物降解效率的高低。肖巧巧等[12]報(bào)道了一株惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)對(duì)微囊藻毒素－LR具有較好的降解作用，其中降解菌的菌齡對(duì)降解有著較大的影響，菌齡為36 h降解效果最佳。Feng等[13]研究利用硅藻土固定化假單胞菌株M285時(shí)發(fā)現(xiàn)，固定化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌體比處于穩(wěn)定期的降解菌對(duì)TCP的去除效果更佳，這就說(shuō)明菌齡的大小對(duì)于固定化菌降解污染物具有重要作用。竇晶晶等[14]研究了固定化產(chǎn)堿菌對(duì)多菌靈的降解效果，并采用正交試驗(yàn)對(duì)海藻酸鈉濃度、氯化鈣濃度和交聯(lián)時(shí)間三因素進(jìn)行了條件優(yōu)化，得出對(duì)降解效果影響的次序依次為交聯(lián)時(shí)間、海藻酸鈉濃度和CaCl2濃度，優(yōu)選得出的條件為海藻酸鈉濃度2%，CaCl2濃度4%以及固定化時(shí)間24 h。本研究得出的影響毒死蜱降解率的上述三因素的次序是相同的，但是優(yōu)化指標(biāo)不同，故海藻酸鈉和氯化鈣的最適濃度以及固定化時(shí)間要根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)來(lái)選擇確定。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步綜合分析得出，固定化時(shí)間所影響的海藻酸鈉與鈣離子所形成的鈣凝膠的強(qiáng)度是影響固定化菌降解農(nóng)藥的決定性因素之一，若固定化時(shí)間不足，固定化菌的機(jī)械強(qiáng)度較小，則會(huì)影響菌株的附著和生長(zhǎng);固定化時(shí)間若過(guò)長(zhǎng)，凝膠的強(qiáng)度過(guò)高，影響固定化菌的傳質(zhì)性能，也無(wú)法獲得良好的降解效果。除此之外，海藻酸鈉濃度越高，包埋后的小球傳質(zhì)性能越差，氧氣和目標(biāo)污染物向固定化菌內(nèi)部的擴(kuò)散阻力越大，從而導(dǎo)致微生物的活性下降、底物不能有效的和菌體相接觸，從而使得降解率不斷下降。但是，若海藻酸鈉濃度較低，制得的固定化菌在使用過(guò)程中容易破碎，菌體外泄，固定化可使降解菌抗毒性能和耐受力增強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)也得不到充分發(fā)揮[15]。

3.2 結(jié)論

(1)游離化蠟狀芽孢桿菌菌體的菌齡為20 h時(shí)對(duì)50 mg/L毒死蜱的降解率達(dá)最高。

(2)海藻酸鈉固定化菌降解毒死蜱的反應(yīng)時(shí)間為24 h對(duì)50 mg/L毒死蜱的降解率達(dá)到75.4%，菌體和海藻酸鈉溶膠的包埋比(m/V)為1∶20時(shí)對(duì)毒死蜱的降解率達(dá)最高為76.8%，菌株在成型劑2%CaCl2溶液中固定28 h對(duì)毒死蜱的降解率達(dá)最高。海藻酸鈉溶膠濃度為3%對(duì)毒死蜱的降解率達(dá)最大為85.7%。

(3)通過(guò)正交試驗(yàn)得出，海藻酸鈉濃度(A)、CaCl2濃度(B)和固定化時(shí)間(C)對(duì)50 mg/L毒死蜱降解率的影響次序?yàn)镃＞A＞B，最優(yōu)水平分別為:海藻酸鈉濃度3.0%、CaCl2濃度1.5%和固定化時(shí)間32 h。

[1]LAKSHMI C V，KUMAR M，KHANNA S.Biodegradation of chlorpyrifos in soil by enriched cultures[J].Current Microbiology，2009，58(1):35－38.

[2]劉騰飛，鄧金花，周峰杰，等.毒死蜂在土壤中的降解及分析研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2014，30(9):26－34.

[3]PERERA F P，RAUH V，WHYATT R M，et al.A summary of recent findings on birth outcomes and developmental effects of prenatal ETS，PAH，and pesticide exposures[J].Neurotoxicology，2005，26(4):573 －587.

[4]QIAO L，WEN D H，WANG J L.Biodegradation of pyridine by Paracoccus sp.KT－5 immobilized on bamboo－based activated carbon[J].Bioresource Technology，2010，101:5229 －5234.

[5]朱魯生，辛承友，王倩，等.莠去津高效降解細(xì)菌HB－5的固定化研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2006，25(5):1271－1275.

[6]Bazot S，Bois P，Joyeux C，et al.Mineralization of diuron[3－(3，4－dichlorophenyl)－1，1－dimethylurea]by co－immobilized Arthrobacter sp.and Delftia acidovorans[J].Biotechnology Letters，2007，29(5):749 －754.

[7]段海明.蠟狀芽孢桿菌不同菌株降解有機(jī)磷農(nóng)藥的特性分析[J].生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào)，2012，21(9):1608－1613.

[8]段海明，王開運(yùn)，于彩虹.耐鹽性毒死蜱降解菌HY－1的產(chǎn)酶培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化[J].微生物學(xué)通報(bào)，2011，38(3):335－361.

[9]郭新強(qiáng)，李榮，林棟青，等.三唑磷降解菌株 GS－1的分離鑒定及其降解特性的研究[J].微生物學(xué)通報(bào)，2009，36(8):1143－1149.

[10]王金花，朱魯生.3株真菌對(duì)毒死蜱的降解特性[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2005，11(2):211－214.

[11]陳銘，周曉云.固定化細(xì)胞技術(shù)在有機(jī)廢水處理中的應(yīng)用與前景[J].水處理技術(shù)，1997，23(2):98－104.

[12]肖巧巧，尹華，葉錦韶，等.一株微囊藻毒素－LR降解菌的降解特性[J].環(huán)境化學(xué)，2014，33(9):1594－1600.

[13]Feng Y，Racke K D，Bollag J M.Use of immobilized bacteria to treat industrial wastewater containing a chlorinated pyridinol[J].Applied Microbiology and Biotechnology，1997，47(1):73－77.

[14]竇晶晶，馮貴穎，呼世斌，等.一株多菌靈降解菌包埋條件及降解特性[J].中國(guó)環(huán)境科學(xué)，2011，31(3):431－436.

[15]董怡華，胡筱敏，張玉革，等.包埋固定化Rhodopseudomonas palustris對(duì)鄰氯苯酚的降解[J].中南大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2014，45(4):1369－1376.