重組抗CD52人源化單克隆抗體ELISA檢測方法的建立

李金龍 ，胡百卉，許先興，張代超，劉運龍，陳知航，程遠國

1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，吉林 長春 130062；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 微生物與流行病研究所，北京 100071；3.第二炮兵總醫(yī)院 藥學(xué)部，北京 100088

慢性B 淋巴細胞白血病（chronic lymphocytic leukemia，CLL）是一種B 淋巴細胞克隆性增殖的腫瘤性白血病，特點為血液、骨髓和淋巴組織中大量單克隆的成熟小B 淋巴細胞的增殖[1]。CLL 在西方國家是最常見的成人白血病類型，在亞洲國家少見[2]。

CD52 是細胞表面的一種相對分子質(zhì)量為21×103～28×103的糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidyl inositol，GPI）錨定糖蛋白抗原，但去掉糖基后它的相對分子質(zhì)量只有8×103～9×103[3]。成熟CD52 的蛋白結(jié)合部分僅含12 個氨基酸殘基（GQNDTSQTSSPS），C 端通過GPI 錨定分子連接于細胞膜表面，N 端3 位天冬酰胺殘基連接有一個復(fù)雜的糖基，在其四角巖藻糖基化的甘露糖核心上有幾個唾液酸化的多聚乳糖胺單位[4-6]。CD52分布比較廣泛，一般表達于正常及惡性的B 和T 淋巴細胞、NK 細胞、單核細胞、巨噬細胞表面及男性的生殖系統(tǒng)組織中[7]。多個志愿者來源的樣本分析表明CD52 不表達于紅細胞與造血干細胞[8]。

Campath 是一種抗CD52 的單克隆抗體，通過哺乳動物細胞（CHO）懸浮培養(yǎng)制備而得，為IgG1 亞型，具有人類抗體可變區(qū)的框架區(qū)及恒定區(qū)和鼠單克隆抗體（Campath-1G）互補決定區(qū)，相對分子質(zhì)量約為150×103。Campath 作為一種抗CD52 的單克隆抗體，能特異地識別表達在所有淋巴細胞和單核細胞表面的CD52 抗原，并與之結(jié)合殺傷淋巴細胞[9]，其作用機制可能包括與白血病細胞表面的CD52 抗原結(jié)合后直接誘導(dǎo)凋亡、通過補體介導(dǎo)的細胞毒作用殺傷靶細胞（CDC 作用），以及抗體依賴的溶細胞作用殺傷靶細胞（ADCC 作用），從而達到治療相關(guān)疾病的目的。

目前已報道的檢測血清中抗CD52 單克隆抗體的方法很多，多數(shù)為ELISA，其他方法還有免疫熒光法、細胞放射免疫法等。但這些方法存在檢測復(fù)雜、耗時長、靈敏度低等問題，如ELISA 的定量限（LOQ）為0.5～6.6 μg/mL，流式細胞法的LOQ 為0.1～1 μg/mL[10]。在本研究中，我們擬于建立一種靈敏、特異、快速的雙抗夾心ELISA 法，用于檢測食蟹猴血清中抗CD52 單克隆抗體的濃度。我們采用的包被抗體與檢測抗體都是猴血清吸附的羊抗人IgG，此多抗既可捕獲又可用于檢測抗CD52單克隆抗體，而且該多抗是經(jīng)過猴血清吸附特殊處理過的，這樣可以將與猴IgG 結(jié)合的那部分羊抗人IgG 除去。這種測定方法的靈敏度、準確性和特異性都非常高，并可成功地用于支持抗CD52 單克隆抗體臨床前動物試驗研究的藥代動力學(xué)分析。

1 材料和方法

1.1 材料

重組抗CD52 單克隆抗體體注射液（HS020）由浙江海正藥股份有限公司提供，濃度為30 mg/mL，于4℃保存；猴血清吸附的羊抗人IgG（1 mg/kg）、猴血清吸附的羊抗人IgG-HRP（1 mg/kg）購于Bethyl公司；牛血清白蛋白（BSA）購于羅氏公司；CHAPS購于Sigma 公司；Proclin300 購于Supelco Analytical 公司；四甲基聯(lián)苯胺（TMB 顯色液）購于Aladdin 公司；聚苯乙烯96 孔酶標板購于Costar 公司；酶標儀購于BIO-RAD公司；其他常規(guī)試劑為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

試劑配制：①pH7.4 磷酸鹽緩沖液（PBS）：稱取16 g NaCl、0.4023 g KCl、2.84 g Na2HPO4、0.544 g KH2PO4，溶解于2 L ddH2O，pH7.4；②包被液：取0.2 mol/L 碳酸鈉水溶液16 mL 和0.2 mol/L 碳酸氫鈉水溶液34 mL，加蒸餾水至200 mL；③封閉液：PBS，2% BSA，0.05% P20，0.05% Proclin300，0.25% CHAPS，5 mmol/L EDTA，0.35 mol/L NaCl，pH8.0，總體積200 mL；④稀釋液：PBS，0.5% BSA，0.05% P20，0.05% Proclin300，0.25% CHAPS，5 mmol/L EDTA，0.35 mol/L NaCl，pH8.9，總體積200 mL；⑤TMB 顯色液：將A 液與B 液等體積混合，現(xiàn)用現(xiàn)配；⑥終止液（1 mol/L 硫酸）：將10.4 mL 硫酸（98%）緩慢加入189.6 mL 蒸餾水中，邊加入邊攪拌，總體積200 mL；⑦ELISA 洗板液：將0.5 mL Tween-20加入999.5 mL磷酸鹽緩沖液中；⑧標準曲線溶液：先將重組抗CD52 單克隆抗體稀釋至500 ng/mL，之后再梯度稀釋至7.81 ng/mL。

1.2 檢測步驟

①包被：用pH9.6 的碳酸鹽緩沖液包被猴血清吸附的羊抗人IgG 單克隆抗體，稀釋至5 μg/mL，100 μL/孔，4℃過夜；②封閉：用洗液洗板3 次，拍干酶聯(lián)板，加封閉液200 μL/孔，室溫封閉2 h；③加樣：用洗液洗板4 次，拍干酶聯(lián)板，用20%的食蟹猴空白血清稀釋不同濃度的標準品和待測樣品，每孔加100 μL，室溫孵育1 h；④加二抗：用洗液洗板6次，拍干酶聯(lián)板，每孔加100 μL 猴血清吸附的羊抗人IgG-HRP（1∶40 000 稀釋），室溫孵育1 h；⑤顯色：用洗液洗板6次，拍干酶聯(lián)板，加1∶1混合的TMB顯色液A、B 液，100 μL/孔，室溫孵育15 min；⑥終止：加終止液100 μL/孔，30 min 內(nèi)讀數(shù)；⑦比色：分別讀取D450nm和D560nm值。

2 結(jié)果

2.1 標準曲線與線性范圍

將重組抗CD52 單克隆抗體用20%猴血清稀釋至500、250、125、62.5、31.25、15.63 及7.81 ng/mL，取100 μL 樣品，依據(jù)上述步驟檢測。以D值為縱坐標、各標準管濃度為橫坐標，對其進行非線形回歸運算。測得重組抗CD52 人源化單克隆抗體在7.81～500 ng/mL 范圍內(nèi)，蛋白濃度（ng/mL）的對數(shù)值與免疫反應(yīng)光吸收（D值）呈S 狀形曲線，經(jīng)四參數(shù)Logistic 函數(shù)曲線模型擬合，求得曲線斜率、EC50，及上下端漸進線間的近線性范圍。擬合曲線見表1 和圖1。其數(shù)學(xué)模型為：

2.2 方法的靈敏度與最低檢測濃度

按照制備標準曲線的方法制成7.8 ng/mL 的重組抗CD52人源化單克隆抗體，同樣按上述方法進行測定，重復(fù)6 次，由同一板上的標準曲線回歸方程計算出的濃度為抗CD52 單抗檢出量。最低定量下限滿足方法學(xué)要求，CV為4.9%，RE為+10.8%，確定檢測的最低定量下限為7.8 ng/mL。

2.3 方法的精密度與準確度

同樣按上述方法測定400、62.5、15.6 ng/mL 高、中、低三種濃度，每個濃度平行測定6 次，共測定3次，分別計算批內(nèi)與批間的CV值與RE值。結(jié)果顯示在高、中、低三種濃度水平下測定的批內(nèi)與批間CV值均小于10%，說明檢測方法具有較高的精密度；批內(nèi)與批間的RE值均小于10%，說明檢測方法具有較高的準確度。

2.4 方法的回收率

按照制備標準曲線的方法制成400、62.5、15.6 ng/mL（高、中、低）三個濃度的受試品重組抗CD52人源化單克隆抗體的質(zhì)控樣品，同樣按上述方法進行測定，重復(fù)6 次，由同一板上的標準曲線回歸方程計算出的濃度為重組抗CD52 人源化單克隆抗體的檢出量。

2.5 方法的特異性

分別做PEG-EPO（促紅細胞生成素）、IL-2（白細胞介素2）、GH（生長激素）和受試品抗CD52 單抗的校正標準曲線，結(jié)果表明抗CD52單抗沒有與前三者發(fā)生交叉反應(yīng)（圖2）。

圖1 重組抗CD52人源化單克隆抗體的四參數(shù)校正曲線

圖2 受試品CD52與PEG-EPO、GH、IL-2的校正曲線

2.6 樣品的穩(wěn)定性

從標準曲線選取高、中、低三個濃度的質(zhì)控樣品，每個濃度6 個樣本，在-20℃冰箱中冷凍后取出，室溫融化，反復(fù)3 次，測定其濃度，確定凍融穩(wěn)定性；室溫保持4 h 后，測定其濃度，確定室溫穩(wěn)定性；4℃冰箱中放置24 h后，測定其濃度，確定4℃24 h短期穩(wěn)定性；-80℃冰箱中冷凍120 d 后取出，室溫融化，測定其濃度，確定長期穩(wěn)定性。結(jié)果表明，重組抗CD52 單克隆抗體在血清中凍融3 次、室溫放置4 h、4℃冰箱中放置24 h、-80℃長期保存均不影響其穩(wěn)定性。

2.7 樣品稀釋率的影響

將重組抗CD52 單克隆抗體稀釋至100 μg/mL后，分別進行1/250、1/1600、1/6400 稀釋，每個濃度6個復(fù)孔進行測定，結(jié)果見表6，各稀釋率對樣品檢測無影響，不存在稀釋效應(yīng)。

2.8 小結(jié)

上述方法學(xué)確證結(jié)果表明，本研究建立的方法的特異性、板內(nèi)和板間精密度、最低定量下限、回收率、穩(wěn)定性及樣品稀釋率的影響均滿足生物樣品分析要求，可用于重組抗CD52單克隆抗體的藥代動力學(xué)研究。

表1 標準曲線與線性范圍

表2 ELISA檢測加入猴血清中受試物的抗體的靈敏度

表3 ELISA檢測加入猴血清中受試物的抗體的精密度與準確度

表4 ELISA檢測加入猴血清中受試物的抗體的回收率

表5 重組抗CD52人源化單克隆抗體的穩(wěn)定性

表6 樣品稀釋率的影響

3 討論

檢測生物樣本中重組抗CD52 單克隆抗體的方法很多，但各有優(yōu)缺點。抗體依賴細胞毒性（ADCC）法的靈敏度較高，檢測抗體濃度可達0.01 μg/mL 以下，但此方法需用新鮮血作為效應(yīng)細胞，而供血者之間的差異很難使檢測方法標準化，也很難保證方法的精確度。補體介導(dǎo)細胞毒（CDC）法的優(yōu)點是供血者之間補體變化不大，可獲得大量試驗用血清，但血清中補體抑制因子變異較大，當血清濃度過高時可抑制CDC 反應(yīng)，因此在檢測時必須盡量稀釋血清樣品，或在加入血清樣品和補體過程中增加清洗步驟，因而檢測靈敏度大大降低。放射免疫法是將人的T細胞固定在微孔板上，加入稀釋的重組抗CD52單克隆抗體或待測血清，然后加入放射性標記的重組抗CD52 單克隆抗體，檢測靈敏度較高，可達0.1 μg/mL，但中和抗體的出現(xiàn)會嚴重干擾試驗結(jié)果。免疫熒光法功能強大，無論是靈敏度、精密度還是準確度都能滿足檢測需求，檢測CD52單抗的最低檢測限可達0.5 μg/mL，但流式細胞檢測方法相對復(fù)雜，并且耗時較長，該方法的一個特點是只有具有抗原結(jié)合位點和Fc 片段的生物活性抗體才能被檢測，已通過突變結(jié)合位點試驗加以證明，潛在的干擾是靶細胞與人血清中正常的IgG 及其他人抗體結(jié)合。ELISA法檢測治療性單克隆抗體可用重組抗原或抗獨特型抗體捕獲待檢抗體，但實際上如果沒有特異性的捕獲抗體和檢測抗體，那么抗CD52單抗必然會與正常猴IgG 發(fā)生交叉反應(yīng)，且使本底值升高，靈敏度下降，其檢測靈敏度為0.06～6.6 μg/mL，這就是ELISA靈敏度不高的原因。

綜上所述，為了提高檢測靈敏度，縮短檢測時長，使檢測方法更便捷，我們研究了一種生物分析藥代動力學(xué)測定法——雙抗夾心ELISA，用于檢測食蟹猴血清中抗CD52 單克隆抗體的濃度。此方法不依賴于抗CD52單抗的特異性，包被抗體和檢測抗體都是羊抗人IgG，該抗體既可用于捕獲又可檢測抗CD52抗體，且經(jīng)猴血清吸附過后可排除猴血清成分的干擾，提高測定的特異性、準確性和靈敏度。因為此方法是以人IgG 為特異性的，而不僅僅是以抗CD52 單抗為特異性的，所以該法的應(yīng)用性更廣泛，不僅可支持抗CD52 單抗猴實驗研究的藥代動力學(xué)分析，同時也可測定非靈長類和嚙齒類動物血清中的人IgG 或人源化IgG 分子，如Cetuximab（西妥昔單抗）、Trastuzumab（曲妥珠單抗）等。但是，當動物被給予多種人源化單抗時，此檢測方法只能檢測出生物體內(nèi)總的單抗水平，無法得出單一單抗水平。

總之，應(yīng)用此方法，我們可以快速、準確地檢測出食蟹猴血清中人源化IgG，而無須特異性試劑。

[1]Sabattini E，Bacci F，Sagramoso C，et al.WHO classification of tumours ofhaematopoietic and lymphoid tissues in 2008:an overview[J].Pathologica,2010,102(3):83-87.

[2]StatBite:estimated new cases for the four major leukemias,2008[J].J Natl Cancer Inst,2009,101(6):371.

[3]屈浩,CD52抗原的研究進展及其抗體在臨床中的應(yīng)用[J].國外醫(yī)學(xué)免疫學(xué)分冊,2005,11(8):367-373.

[4]Rowan W,Tite J,Topley P,et al.Cross-linking of the CAMPATH-1 antigen(CD52) mediates growth inhibition in human B-and T-lymphoma celllines,and subsequent emergence of CD52-deficient cells[J].Immunology,1998,95:427-436.

[5]Hederer R A,Guntermann C,Miller N,et al.CD45 tyrosine phosphatase regulates Campath-1H(CD52)-induced TCR-dependent signal transduction in human T cells[J].Int Immunol,2000,12:505-516.

[6]Nuckel H,Frey U H,Roth A,et al.Alemtuzumab induces enhanced apoptosis in vitro in B-cells from patients with chronic lymphocytic leukemia by antibody-dependent cellular cytotoxicity[J].Eur J Pharmacol,2005,514(2-3):217-224.

[7]Ginaldi L,De Martinis M,Matutes E,et al.Levels of expression of CD52 in normal and leukemic B and T cells:correlation with in vivo therapeutic responses to Campath-1H[J].Leukemia Res,1998,22(2):185-191.

[8]Quigley M M,Bethel K J,Sharpe R W,et al.CD52 expression in hairy cell leukemia[J].Am J Hematol,2003,74(4):227-230.

[9]Rowan W,Tite J,Toplly P,et al.Cross-linking of the CAMPATH-1 antigen(CD52) mediates growth inhibition in human B-and T-lymphoma cell lines,and subsequent emergence of CD52-deficient cells[J].Immunology,1998,95(3):427-436.

[10]Kümler I,Tuxen M K,Nielsen D L,et al.A systematic review of dual targeting in HER2-positive breast cancer[J].Cancer Treatment Rev,2013,9:1-12.

[11]Cartron C,Blasco H,Paintaud C,et al.Pharmacokinetics of rituximab and its clinical use;thought for the best use[J].Crit Rev Oncol/Hematol,2007,62:43-52.

[12]Yang Jihong,Ng C,Lowman H,et al.Quantitative determination of humanized monoclonal antibody rhuMAb2H7 in eynomolgus monkey serum using a genric immunoglobulin pharmacokinetic assay[J].J Immunol Methods,2008,335:8-20.