SIRT2的亞細胞定位及其對293T細胞增殖的影響

王旋，仲念念，趙盼雄，季少平

河南大學 醫(yī)學院，河南 開封 475004

Sirtuins 是NAD+依賴的蛋白質(zhì)去乙?；竅1-2]，在哺乳動物中由7個成員組成，即SIRT1～SIRT7[3]，包含一個約275 個氨基酸的保守催化核心區(qū)[4-5]。它們調(diào)節(jié)許多細胞功能，例如基因組維護、壽命和新陳代謝。已明確SIRT1 和SIRT6 和DNA 修復或DNA 損傷反應信號通路相連[6]。除了SIRT4，其他成員已經(jīng)被認為具有去乙?；饔肹7]。據(jù)報道，SIRT2 去乙?；墙M蛋白蛋白[8]，如α微管蛋白[9]、p53[10]、鈣黏著蛋白1（Cdh1）[11]、細胞分裂周期蛋白20（CDC20）等，參與調(diào)節(jié)細胞穩(wěn)態(tài)。SIRT2 在腫瘤發(fā)生過程中也扮演了重要角色，有時促進腫瘤的生成，有時抑制腫瘤的生成，這取決于細胞環(huán)境或腫瘤種類[8]。SIRT2 還是抑制細胞分化的少突神經(jīng)膠質(zhì)蛋白[12]，在大腦中高度表達[13]。蛋白質(zhì)功能的發(fā)揮通常與其亞細胞定位密切相關[13]，它們常通過在不同亞細胞環(huán)境里的運動發(fā)揮作用。故而，進行細胞亞定位研究，將為揭示SIRT2蛋白的功能提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人胚腎細胞株293T 由本實驗室保存；大腸桿菌Top10、帶有目的基因的克隆載體為本實驗室保存；DMEM 來自GIBCO 公司；胎牛血清來自浙江天杭生物科技有限公司；蛋白定量BCA 試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司；出核轉(zhuǎn)運抑制劑細霉素B（leptomycin B）購自碧云天生物技術研究所；anti-SIRT2 抗體購自Sigma 公司；anti-eGFP 抗體、anti-LMNB1 抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司；antiβ-actin 抗體、羊抗兔二抗購自武漢博士德生物工程有限公司；質(zhì)粒小量抽提試劑盒及凝膠回收試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司；pMD19-T 載體，限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ、KpnⅠ，T4DNA 連接酶，DNA 分子量標準DL2000 均購自大連寶生物工程有限公司；DNA分子量標準Marker Ⅳ購自上海萊楓生物科技有限公司；陽離子脂質(zhì)體LipofectAMINE 2000 購自Invitrogen 公司；核漿分離試劑（PBS，Tris，氯化鎂，NP-40）為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 PCR擴增目的基因及克隆

根據(jù)GenBank 中的基因序列（NM_001008368），應用軟件Primer Premier 5.0設計用于克隆SIRT2基因的上游引物（5'-GAATTCGAGATGGACTTCCTAC GG-3'）和下游引物（5'-GGTACCCTAGTGTTCCTCT TTCTCTTTG-3'），上、下游引物中分別引入EcoRⅠ、KpnⅠ酶切位點，擴增片段為1052 bp。引物由金唯智生物科技有限公司合成。

以本實驗室的SIRT2-pIRES為模板進行PCR反應。反應體系：模板1 μL，10×PCR 緩沖液5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）1 μL，滅菌蒸餾水40.5 μL，rTaq（5 U/μL）0.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL。反應條件：94℃5 min；94℃40 s，56℃40 s，72℃2 min，擴增32 個循環(huán)。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定，切膠回收后純化。用pMD19-T 載體連接試劑盒（TaKaRa 公司）將回收純化的PCR 產(chǎn)物與pMD19-T 載體連接（SolutionⅠ5 μL，pMD19-T DNA 0.5 μL，PCR產(chǎn)物4.5 μL，16℃反應2 h），取連接產(chǎn)物3 μL 轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌Top10，經(jīng)藍白斑篩選出陽性重組子，小量提取質(zhì)粒DNA，EcoRⅠ、KpnⅠ雙酶切鑒定有無插入片段，并取10 μL質(zhì)粒送生工公司測序。

1.3 重組質(zhì)粒SIRT2-pEGFP-C2的構(gòu)建及鑒定

用EcoRⅠ、KpnⅠ分別雙酶切重組pMD19-T/SIRT2質(zhì)粒及pEGFP-C2空載體，凝膠電泳后回收目的基因片段，用T4DNA 連接酶將pEGFP-C2 和SIRT2 目的片段在16℃反應過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10，挑選重組質(zhì)粒，用EcoRⅠ和KpnⅠ雙酶切鑒定。

1.4 重組質(zhì)粒在293T細胞中的表達

293T 細胞系在含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，于37℃、5% CO2飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)。

按照LipofectAMINE 2000 的說明書分別轉(zhuǎn)染SIRT2-pEGFP-C2 和pEGFP-C2 至293T 細胞，并設立空白對照，24 h 后在熒光顯微鏡下觀察，48 h 后收集細胞進行Western印跡。

1.5 SIRT2的亞細胞定位

將細胞接種在60 mm 的細胞培養(yǎng)皿中，分為7組；待各培養(yǎng)皿中的細胞長到50%～60%時，用LipofectAMINE 2000 轉(zhuǎn)染SIRT2-pEGFP-C2，同時設置pEGFP-C2 的空載體對照，24 h 后在熒光顯微鏡下觀察；加入細霉素B后5 h，在熒光顯微鏡下觀察；將培養(yǎng)基換成含10%胎牛血清的DMEM 后培養(yǎng)19 h，在熒光顯微鏡下觀察；收集細胞，用核漿分離試劑分離漿蛋白和核蛋白，并進行Western印跡。

分組如下：①轉(zhuǎn)染SIRT2-pEGFP-C2；②轉(zhuǎn)染pEGFP-C2；③未轉(zhuǎn)染的細胞；④轉(zhuǎn)染SIRT2-pEGFP-C2后加細霉素B；⑤轉(zhuǎn)染pEGFP-C2后加細霉素B；⑥轉(zhuǎn)染SIRT2-pEGFP-C2，加細霉素B 5 h 后更換為完全培養(yǎng)基；⑦轉(zhuǎn)染pEGFP-C2，加細霉素B 5 h后更換為完全培養(yǎng)基。

1.6 MTT法檢測SIRT2對293T細胞增殖的影響

將293T 細胞接種于6 孔板中，分別轉(zhuǎn)染SIRT2-pEGFP-C2 和pEGFP-C2，并設立空白對照組。轉(zhuǎn)染18 h 后消化細胞，分別按6000/孔重新接種96 孔板，24 h 后加細霉素B（終濃度為20 ng/mL），分組為a（轉(zhuǎn)染SIRT2-pEGFP-C2 未加細霉素B）、b（轉(zhuǎn)染pEGFP-C2 未加細霉素B）、c（空白對照未加細霉素B）、d（轉(zhuǎn)染SIRT2-pEGFP-C2 并加細霉素B）、e（轉(zhuǎn)染pEGFP-C2 并加細霉素B）、f（空白對照并加細霉素B），每組4 個平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入200 μL 新鮮的DMEM 及20 μL 濃度為5 mg/mL 的MTT，避光溫育4 h。棄去孔中培養(yǎng)基和MTT，所有孔中加入150 μL DMSO，振蕩10 min，測定D490nm值并計算細胞增殖抑制率，用不含細胞的孔調(diào)零。實驗重復4次。

細胞增殖抑制率=（1-實驗組D490nm/空白對照組D490nm）×100%

1.7 統(tǒng)計學處理

用SPSS 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用單因素方差分析和LSD-t檢驗及兩獨立樣本的t檢驗。實驗數(shù)據(jù)用x±s的形式表示。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的獲得

PCR 擴增獲得SIRT2 編碼基因，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，產(chǎn)物約1000 bp，與預期大小一致（圖1）。

2.2 T載體克隆的鑒定

目的基因與T 載體連接后，質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定與目的基因大小相符。質(zhì)粒對應的測序結(jié)果顯示，裝入T 載體的序列與GenBank上登錄的序列也相符（圖2）。

2.3 真核表達載體的構(gòu)建與鑒定

用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切重組質(zhì)粒得到的目的基因插入pEGFP-C2 空質(zhì)粒，獲得真核表達質(zhì)粒，該質(zhì)粒再經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，片段大小正確，表明構(gòu)建成功（圖3）。

2.4 重組質(zhì)粒在293T細胞中的表達

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞，48 h后可見綠色熒光主要分布在細胞質(zhì)中，而轉(zhuǎn)染空載體的綠色熒光基本均勻分布（圖4）。收集細胞進行Western 印跡，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細胞高表達SIRT2 蛋白，轉(zhuǎn)染空載體和沒有轉(zhuǎn)染的細胞幾乎不表達SIRT2 蛋白（圖5）。

圖1 SIRT2目的基因的PCR產(chǎn)物

圖2 T-SIRT2載體的鑒定

圖3 SIRT2-pEGFP-C2載體的鑒定

2.5 SIRT2的亞細胞定位

在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，293T 細胞中轉(zhuǎn)染SIRT2-pEGFP-C2 后，SIRT2 主要分布在細胞質(zhì)中，加入細霉素B 后，SIRT2 在核內(nèi)有明顯聚集，撤去細霉素B后，SIRT2 還是主要分布在細胞質(zhì)中（圖6）；進一步通過Western 印跡檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染SIRT2-pEGFP-C2后SIRT2 主要在細胞質(zhì)中表達，細胞核內(nèi)幾乎沒有，加入細霉素B 后，SIRT2 在細胞質(zhì)中依舊表達很高，在核內(nèi)的表達也明顯升高，撤去細霉素B 后，和加細霉素B之前的情況基本一致（圖7）。

2.6 SIRT2對293T細胞增殖的影響

組a 和組b 間差別顯著（P＜0.05，n=4），組a 和組c 間差別顯著（P＜0.05，n=4），組b 和組c 間無顯著差別，說明轉(zhuǎn)染SIRT2后細胞增殖受到抑制。組d和組e 間差別顯著（P＜0.05，n=4），組d 和組f 間差別顯著（P＜0.05，n=4），組e 和組f 間無顯著差別，說明轉(zhuǎn)染SIRT2 并加入細霉素B 后，細胞增殖仍然受到抑制。組a 和組c 間差別顯著（P＜0.05，n=4），組b 和組d 間無顯著差別，說明SIRT2 進入核后對細胞增殖的抑制作用減弱。

3 討論

圖4 熒光顯微鏡下觀察SIRT2在293T細胞中的表達（400×）

圖5 Western印跡檢測SIRT2在293T細胞中的表達

圖6 熒光顯微鏡下觀察細霉素B對SIRT2亞細胞定位的影響（400×）

圖7 Western印跡分析細霉素B對SIRT2亞細胞定位的影響

蛋白質(zhì)是生命活動的基礎，對生物體來說具有至關重要的作用。由于細胞各部分都有特定的蛋白質(zhì)組分，合成的蛋白質(zhì)必須定向地、準確無誤地進行運送，才能保證細胞活動的正常進行。不同的蛋白質(zhì)通常分布在細胞的不同部位，具有不同的功能。即使同一個蛋白在不同的組織細胞中及在不同的生長發(fā)育階段，也可能具有不同的功能[14]。因此，要想真正了解蛋白質(zhì)的功能，通常還需要知道蛋白質(zhì)所處的空間位置。并且，了解蛋白質(zhì)的亞細胞定位信息，可對蛋白質(zhì)的其他研究如相互作用、進化等也能提供必要的信息[15]。研究表明，蛋白質(zhì)的功能與其亞細胞定位密切相關，因此闡明蛋白質(zhì)的定位情況將為其功能研究提供重要的理論依據(jù)。例如，有研究指出，隨著p21 由細胞核到細胞質(zhì)移位，肝癌腫瘤細胞的惡性程度增加，腫瘤轉(zhuǎn)移加快。可見，了解SIRT2 的亞細胞定位情況，對于進一步研究其功能具有重大的指導意義。

蛋白和mRNA 在細胞核和細胞質(zhì)之間的運輸稱為入核和出核，它是維持細胞動態(tài)穩(wěn)定的重要因素。這種運輸需要一些其他蛋白因子的輔助，并要求有一特定的可識別定位序列。蛋白和mRNA 的運輸則需要信號介導并消耗能量。CRM1（染色體區(qū)維持蛋白1）是主要的出核介導物。細霉素B是一種抗真菌化合物，通過抑制NES（核輸出信號）和CRM1的相互作用，強效地、特異性地阻止NES相關的核蛋白輸出[16]。

GFP 能自發(fā)熒光，不必外加底物或破碎組織，不需要目的蛋白的抗體或原位雜交技術，通過熒光顯微鏡即可觀察與熒光蛋白融合的蛋白在活細胞的空間和時間定位。GFP 已被廣泛應用于基因表達調(diào)控、蛋白定位、遷移變化、轉(zhuǎn)基因動物等基因功能方面的研究[17]。EGFP 是GFP 的突變型，其熒光強度比GFP 高4～35 倍。通過構(gòu)建目的基因與綠色熒光蛋白的融合表達載體對蛋白進行亞細胞定位研究，靈敏度高，易操作，實驗周期短，很適于活體實時定位和動態(tài)研究。

為明確并驗證SIRT2 的亞細胞定位情況，我們以EGFP 為標記物，分析了SIRT2 在293T 細胞中的表達、定位情況。熒光顯微鏡觀察結(jié)果及Western印跡結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染SIRT2-pEGFP-C2 后，SIRT2 主要分布在細胞質(zhì)中，加入細霉素B 后，SIRT2 在細胞質(zhì)中依舊表達很高，在核內(nèi)的表達也明顯升高，撤去細霉素B 后，SIRT2 主要分布在細胞質(zhì)中。這表明SIRT2 具有核質(zhì)穿梭功能，它的亞細胞定位是動態(tài)變化過程，為進一步研究SIRT2的功能奠定了基礎。

MTT 實驗檢測細胞活力的結(jié)果表明SIRT2 對細胞增殖起抑制作用，其亞細胞定位影響抑制作用的強弱。然而，這個結(jié)論還需要多方面的驗證，并且SIRT2 的亞細胞定位對其他功能的影響也有待于進一步研究。

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