miR-155 對人肝癌細胞系SK-HEP-1 及MHCC-97H 增殖與浸潤能力的影響

傅春江 ，毛廷森，曾泉，陳琳，周軍年，賈雅麗，岳文

1.房山區(qū)中醫(yī)院，北京 102400；2.軍事醫(yī)學科學院 野戰(zhàn)輸血研究所，全軍干細胞與再生醫(yī)學重點研究室，北京 100850

小干擾RNA（miRNA）在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演的角色近年來成為腫瘤研究領域的熱點，并取得一系列突破性進展。miRNA 被證明在機體的正常發(fā)育過程中，以及包括腫瘤在內的疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[1-2]。研究表明，miRNA 參與干細胞的干性維持以及向成熟細胞的定向分化過程，對上皮間質轉化過程具有調控作用，并通過不同的信號通路調控腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲及轉移，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后密切相關[3-5]。值得關注的是，多種miRNA 被發(fā)現(xiàn)在肝癌中異常表達，并對肝癌細胞的生物學行為產生影響，從而在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。對這些miRNA 的深入研究，將有望為發(fā)現(xiàn)新的肝腫瘤標志物及新的診療靶標提供理論基礎[6-7]。

原發(fā)性肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我國最常見的惡性腫瘤之一，居我國癌癥死亡原因第2 位，在全世界范圍內為發(fā)病率最高的第五大惡性腫瘤，其死亡率在惡性腫瘤死亡順位中居第3 位。肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展是一個多步驟、多因素的復雜過程，涉及眾多生長因子、癌基因和抑癌基因的異常表達或激活，乙肝病毒和丙肝病毒所導致的癌變，酒精所致的肝損傷等[8-10]。除此之外，近年越來越多的研究表明，腫瘤微環(huán)境在肝癌的演進過程中有不容忽視的重要作用[11-12]。肝癌微環(huán)境由多種基質細胞組成，包括間充質干細胞、肝星狀細胞、內皮細胞、成纖維細胞、肌成纖維細胞、脂肪細胞、巨噬細胞、炎癥細胞等，它們能夠分泌大量的生長因子、細胞因子、基質金屬降解酶等，參與腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移及耐藥[13-14]。我們的前期工作發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境中間質細胞呈激活狀態(tài)并高表達EPM、S-100A4 等因子，繼而引起腫瘤細胞系列基因表達的改變及生物學行為的改變[15]。我們系統(tǒng)地對間質細胞引起的MHCC-97H 等肝癌細胞中miRNA 表達的改變進行篩選與分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞的miR-155在間質細胞的刺激下明顯表達上調。本實驗中，我們通過在肝癌細胞系SK-HEP-1 及MHCC-97H 中過表達miR-155，研究其對肝腫瘤細胞增殖與浸潤等生物學行為的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌細胞系SK-HEP-1 及MHCC-97H 由本室保存；pcDNA3.0-miR-155真核表達載體由軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所鄭曉飛教授饋贈；限制性內切酶、核酸分子量標記等購自寶生物公司；引物合成由上海英駿公司完成；反轉錄試劑盒及實時定量用SYBR Green 染料購自QIAGEN 公司；CCK8購自日本同仁株式會社；高糖培養(yǎng)基購自Gibco 公司；胎牛血清購自Hyclone 公司；TRIzol 及LipofectAMINE 2000試劑購自Invitrogen公司。

1.2 細胞培養(yǎng)與轉染

將SK-HEP-1 及MHCC-97H 細胞接種于6 孔板中，用含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。采用LipofectAMINE 2000 轉染細胞，每孔加入溶解于opti-MEM 的10 μL LipofectAMINE 2000 和4 μg pcDNA3.0-miR-155 質粒DNA，對照組加入與實驗組等量的LipofectAMINE 2000和pcDNA3.0質粒DNA。轉染第2 d換液，72 h后收獲轉染細胞用于miRNA的實時定量PCR檢測。

1.3 實時定量PCR 檢測miR-155 在細胞中的表達水平

用QIAGEN 公司的miScriptⅡRT 試劑盒進行RNA 反轉錄得到cDNA 后，采用SYBR Green 法實時定量PCR 檢測，上游引物為5'-TTAATGCCTAATC GTGATAGGGGTC-3',下游引物為5'-GATTGAATC GAGCACCAGTTAC-3'。PCR 條件：95℃ 15 min；95℃15 s，55℃30 s，72℃30 s，40 個循環(huán)。以U6基因為內參，上游引物為5'-CGCTTCGGCAGCACA TATACTA-3'，下游引物為5'-GATTGAATCGAGCA CCAGTTAC-3'，PCR 條件同上。各組PCR 均進行3復孔重復。

1.4 CCK8法及克隆形成實驗檢測細胞增殖

將轉染24 h 的細胞以每孔2×103/100 μL 的密度接種于96 孔板，培養(yǎng)24、72 和120 h 后分別進行CCK8 檢測。加入10 μL CCK8，繼續(xù)在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)4 h，檢測D450nm值，每組均進行6 復孔重復。增殖倍數(shù)計算公式：每一次測定的吸光度值/第一次測定的吸光度值。

轉染后將細胞以2×103/孔的密度接種于6孔板，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，每3 d 換液，2 周后棄去培養(yǎng)液，PBS 洗3 次，加入0.1%結晶紫溶液（含10%福爾馬林）固定20 min，棄去結晶紫溶液后用自來水柔和沖洗，自然干燥后照相保存。

1.5 Transwell實驗檢測細胞的浸潤能力

-20℃保存的Matrigel于4℃過夜融化，用無血清培養(yǎng)基以1∶6 稀釋Matrigel，充分混勻；取400 μL 稀釋的Matrigel 加入Tanswell 板上室，37℃30 min 后Matrigel聚合成膠；細胞用PBS漂洗3次，用無血清培養(yǎng)基制備單細胞懸液，每個小室加入5×105細胞，置于6孔板中，48 h后觀察照相并計數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 pcDNA3.0-miR-155真核表達載體的鑒定

用限制性內切酶HindⅢ/XhoⅠ對pcDNA3.0-miR-155 質粒進行雙酶切，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳，在350 bp 及5.4 kb 左右出現(xiàn)條帶，符合預期結果（圖1）；測序后與GenBank（NR_030784）序列比對一致。

2.2 miR-155 在SK-HEP-1 及MHCC-97H 肝癌細胞系中的表達

將SK-HEP-1 及MHCC-97H 肝癌細胞培養(yǎng)至密度為70%～80%（圖2），細胞狀態(tài)良好，呈長梭形（SK-HEP-1）或多邊形（MHCC-97H）上皮樣細胞狀態(tài)。轉染pcDNA3.0-miR-155 質粒72 h 后，對SKHEP-1 及MHCC-97H 細胞進行實時定量PCR，以檢測miR-155的表達情況，以轉染pcDNA3.0質粒為對照，結果顯示陽性組比對照組表達水平高約424.8±48.5倍（SK-HEP-1，P＜0.01）與63.69±7.8倍（MHCC-97H，P＜0.01）（圖3），這說明pcDNA3.0-miR-155 質粒能有效地高表達成熟的miR-155。

2.3 miR-155高表達對細胞增殖的影響

CCK8 法檢測結果表明，pcDNA3.0-miR-155 質粒轉染SK-HEP-1 及MHCC-97H 細胞24、72、120 h后，與轉染pcDNA3.0 對照載體組相比，在72 h 后細胞增殖受到明顯的促進，miR-155 質粒轉染組SKHEP-1 與對照組在72 h 的增殖倍數(shù)分別為4.59±0.14 與3.04±0.15（P＜0.01），miR-155 質粒轉染組MHCC-97H 與對照組在72 h 的增值倍數(shù)分別為3.78±0.12 與3.35±0.38（P＜0.01）（圖4）?？寺⌒纬蓪嶒炇菍渭毎麘乙阂暂^低的細胞密度接種于培養(yǎng)孔板中，經過相對較長時間的培養(yǎng)來考察單個細胞的增殖能力，miR-155 質粒轉染組SK-HEP-1 與對照組在72 h 的克隆形成數(shù)目分別為410.00±11.36 與189.33 ± 12.66（P＜0.01），miR-155 質粒轉染組MHCC-97H 與對照組在72 h 的克隆形成數(shù)目分別為226.00±6.08與144.33±14.98（P＜0.01）（圖5），說明miR-155促進了肝癌細胞的增殖。

圖1 pcDNA3.0-miR-155質粒的HindⅢ/XhoⅠ雙酶切鑒定

2.4 miR-155高表達促進細胞的浸潤能力

Transwell檢測結果表明，pcDNA3.0-miR-155質粒轉染組SK-HEP-1 與對照組浸潤數(shù)目分別為143.00±9.36與76.00.33±10.67（P＜0.01），二者差異具有顯著意義（P＜0.01）（圖6）。

3 討論

圖2 SK-hep1（A）及MHCC-97H（B）肝癌細胞（×200）

圖3 實時定量PCR檢測轉染pcDNA3.0-miR-155后SK-hep1及MHCC-97H肝癌細胞中miR-155的表達

圖4 miR-155促進SK-hep1及MHCC-97H肝癌細胞增殖

圖5 克隆形成實驗證明miR-155促進SK-HEP-1（A）及MHCC-97H（B）肝癌細胞增殖

圖6 侵襲實驗證明miR-155促進SK-HEP-1細胞的浸潤

越來越多的研究表明，除了腫瘤細胞本身發(fā)生的遺傳學或表觀遺傳學的改變之外，腫瘤細胞所處的微環(huán)境也在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演至關重要的角色[10-11]。腫瘤微環(huán)境包括內皮細胞、間充質干細胞、成纖維細胞、炎癥細胞及脂肪細胞等。我們課題組曾經系統(tǒng)研究肝腫瘤微環(huán)境對肝癌發(fā)生與發(fā)展的影響并取得一定的進展，發(fā)現(xiàn)了肝癌微環(huán)境中的肝星狀細胞及間充質干細胞等在腫瘤細胞的影響下呈現(xiàn)明顯激活狀態(tài)，高表達EPM 及S100-A4 等因子，進而對腫瘤細胞的生物學行為產生明顯影響：促進腫瘤的增殖，明顯增加了腫瘤細胞的浸潤能力，在腫瘤微環(huán)境激活細胞的刺激下，腫瘤細胞肝內轉移甚至肺轉移的能力增加[15]。進一步弄清腫瘤微環(huán)境中的這些因子的分子調控機制，將有望為明確腫瘤發(fā)生發(fā)展的病理機制，以及發(fā)現(xiàn)新的腫瘤診療靶標提供線索。

在前期工作中，我們發(fā)現(xiàn)在肝腫瘤微環(huán)境的刺激下，肝腫瘤細胞的生物學行為發(fā)生了改變，包括細胞的增殖、浸潤與轉移能力的提高等。此外，我們的研究也發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞內的miRNA 表達譜發(fā)生了變化，包括miR-155、miR-301、miR-222、miR-107 等在內的miRNA 的表達明顯上調，其中miR-155 表達的改變最為顯著。miR-155 是一個典型的多功能基因，目前已被報道參與多種生理與病理過程，如炎癥反應、腫瘤的發(fā)生發(fā)展等。在急性髓細胞樣白血病中，miR-155 的表達明顯升高；此外，在多種實體瘤中，包括甲狀腺癌、乳腺癌、結腸癌及宮頸癌等，miR-155 的表達顯著上升，并可能與患者的病理分級及預后有一定的相關性，但其對腫瘤細胞的生物學作用及分子調控機制仍須進一步明確[16-17]。

為了進一步揭示肝腫瘤微環(huán)境是否通過miR-155 發(fā)揮其對腫瘤細胞生物學行為的影響，我們通過pcDNA3.0-miR-155載體在SK-HEP-1及MHCC-97H 肝癌細胞中高表達miR-155，并研究miR-155對腫瘤細胞增殖及浸潤能力的影響。研究結果證實，miR-155 發(fā)揮了與腫瘤微環(huán)境中的間質細胞類似的生物學作用，可以促進腫瘤細胞的增殖與浸潤能力，提示miR-155參與了腫瘤微環(huán)境，有促進腫瘤的發(fā)生與發(fā)展的過程。這有助于我們進一步明確肝腫瘤微環(huán)境作用的病理機制，而miR-155 在肝癌細胞中的高表達并對腫瘤細胞生物學行為造成影響，為臨床上肝癌的分子診斷及治療提供了新思路與新靶點。

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