c-Jun在鼻咽癌組織中的表達(dá)以及對(duì)鼻咽癌復(fù)發(fā)的影響

方 敏 宋 濤 吳式琇 吳樹強(qiáng) 賈勇士

1.浙江省人民醫(yī)院放療科，浙江杭州 310014；2.杭州市腫瘤醫(yī)院放療科，浙江杭州 310002

c-Jun在鼻咽癌組織中的表達(dá)以及對(duì)鼻咽癌復(fù)發(fā)的影響

方 敏1宋 濤1吳式琇2吳樹強(qiáng)1賈勇士1

1.浙江省人民醫(yī)院放療科，浙江杭州 310014；2.杭州市腫瘤醫(yī)院放療科，浙江杭州 310002

目的分析c-Jun在鼻咽癌組織中的表達(dá)以及對(duì)鼻咽癌復(fù)發(fā)的影響。方法選擇2003年1月～2005年9月在溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院耳鼻喉科行放療的4例復(fù)發(fā)鼻咽癌（復(fù)發(fā)鼻咽癌組）和4例初發(fā)鼻咽癌患者（初發(fā)鼻咽癌組）的組織標(biāo)本，應(yīng)用磷酸化抗體蛋白質(zhì)芯片篩選初發(fā)鼻咽癌組與復(fù)發(fā)鼻咽癌組患者鼻咽癌組織中的差異磷酸化蛋白，并進(jìn)行聚類。并選取其中的差異磷酸化蛋白進(jìn)行免疫組化試驗(yàn)驗(yàn)證，用于免疫組化驗(yàn)證的初發(fā)及復(fù)發(fā)鼻咽癌組織40例取自2003年8月～2010年5月溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院病理科，將其分為初發(fā)鼻咽癌組（n= 20）和復(fù)發(fā)鼻咽癌組（n=20）。結(jié)果在復(fù)發(fā)鼻咽癌組和初發(fā)鼻咽癌組中篩選出包括c-Jun（P=0.030）、Histone H2A（P=0.044）、SEK1（P=0.048）、KIT（P=0.042）、ATP1A1（P=0.007）和Synapsin（P=0.023）共6個(gè)差異蛋白，復(fù)發(fā)鼻咽癌組中Histone H2A（上調(diào)比率為1.08）、SEK1（上調(diào)比率為1.14）、KIT（上調(diào)比率為1.22）、ATP1A1（上調(diào)比率為1.22）和Synapsin（上調(diào)比率為1.22）磷酸化水平較初發(fā)鼻咽癌組患者上調(diào)，復(fù)發(fā)鼻咽癌組中c-Jun磷酸化水平較初發(fā)鼻咽癌組患者下調(diào)（下調(diào)比率為0.87）。其中c-Jun、Histone H2AX、SEK1及KIT蛋白質(zhì)的磷酸化水平改變可能與鼻咽癌復(fù)發(fā)機(jī)制有關(guān)。通過(guò)免疫組化驗(yàn)證了c-Jun在復(fù)發(fā)鼻咽癌組低于初發(fā)鼻咽癌組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.048）。結(jié)論 磷酸化c-Jun在復(fù)發(fā)鼻咽癌組織中低表達(dá)，c-Jun磷酸化涉及調(diào)控基因、抑制細(xì)胞凋亡、促細(xì)胞增殖等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可能與腫瘤復(fù)發(fā)有關(guān)，還可提示預(yù)后及提供治療靶點(diǎn)。

鼻咽腫瘤；復(fù)發(fā)；c-Jun；磷酸化芯片

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是中國(guó)南方地區(qū)及亞洲東南部最常見的腫瘤，其發(fā)病率和死亡率在頭頸惡性腫瘤中居首位。發(fā)病率為30/100 000～80/100 000。低分化鱗癌是鼻咽癌最常見病理類型，鼻咽癌因其位于頭顱中央，且與顱底密切相連，周圍環(huán)繞重要器官，極易向周圍組織結(jié)構(gòu)侵犯，且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高，從而使手術(shù)較難徹底切除，因此放射治療是鼻咽癌最主要的治療手段。鼻咽癌首程放療后仍有8.2%～22.0%的復(fù)發(fā)率[1]。復(fù)發(fā)鼻咽癌預(yù)后較差，其再程放療的5年生存率為18.7%～36%[2]，有關(guān)鼻咽癌復(fù)發(fā)的特異性分子標(biāo)志物的研究成為目前腫瘤研究的熱點(diǎn)。

蛋白質(zhì)相關(guān)研究在識(shí)別與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的蛋白質(zhì)及發(fā)現(xiàn)腫瘤分子標(biāo)志物方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。篩選初發(fā)鼻咽癌和復(fù)發(fā)鼻咽癌組織的差異表達(dá)蛋白，將有助于探索鼻咽癌的復(fù)發(fā)機(jī)制。磷酸化是蛋白常見的翻譯后修飾方式，磷酸化在調(diào)節(jié)控制生物過(guò)程包括細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及凋亡的細(xì)胞信號(hào)通路中起著重要作用。蛋白激酶活性的改變引起蛋白磷酸化被認(rèn)為是腫瘤形成及進(jìn)展的起始。研究復(fù)發(fā)相關(guān)磷酸化蛋白能為腫瘤的發(fā)展提供新的見解。對(duì)初發(fā)鼻咽癌和復(fù)發(fā)鼻咽癌組織中磷酸化差異蛋白的研究，將有助于探索鼻咽癌的復(fù)發(fā)機(jī)制，并可為腫瘤的治療提供靶向蛋白。

蛋白質(zhì)印跡法等傳統(tǒng)的技術(shù)不能敏感、快速地同時(shí)檢測(cè)大量蛋白，而蛋白芯片因其具備高通量、小型化、高準(zhǔn)確性及高敏感性的優(yōu)點(diǎn)，目前應(yīng)用越來(lái)越廣。探索性蛋白芯片由磷酸化特異抗體組成，能在特定位點(diǎn)測(cè)量磷酸化蛋白狀態(tài)的改變，因此能用來(lái)檢測(cè)腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)磷酸化蛋白。本研究首次采用包含656種蛋白質(zhì)的Full Moon生物公司磷酸化抗體蛋白質(zhì)芯片分析初發(fā)鼻咽癌（primary nasopharyngeal carcinoma，pNPC）和復(fù)發(fā)鼻咽癌（recurrent nasopharyngeal carcinoma，rNPC）患者的鼻咽癌組織中差異蛋白質(zhì)的磷酸化水平，可能有助于探索鼻咽癌的復(fù)發(fā)機(jī)制，可能為鼻咽癌的治療提供新的治療策略。

1 材料與方法

1.1 蛋白芯片及免疫組化材料

選擇2003年1月～2005年9月溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院耳鼻喉科手術(shù)切除的8例鼻咽癌組織標(biāo)本用于蛋白芯片試驗(yàn)，本研究用于免疫組化的石蠟包埋的初發(fā)與復(fù)發(fā)鼻咽癌組織取自2003年8月～2010年5月溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院病理科，所有標(biāo)本均經(jīng)病理確斷均為鱗狀細(xì)胞癌，已簽署知情同意書。蛋白芯片標(biāo)本分兩組：初發(fā)鼻咽癌組（pNPC組，n=4，C1～C4），男3例，女1例，年齡28～52歲；復(fù)發(fā)鼻咽癌組（rNPC組，n=4，F(xiàn)1～F4）男3例，女1例，年齡36～53歲。免疫組化標(biāo)本（共40例）也分兩組：初發(fā)鼻咽癌組（pNPC組，n=20）男15例，女5例，年齡29～60歲；復(fù)發(fā)鼻咽癌組（rNPC組，n=20），男15例，女5例，年齡32～62歲。初發(fā)鼻咽癌組均是首次診斷為鼻咽癌，影像學(xué)檢查頸部淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處器官未見轉(zhuǎn)移（T1N0M0）。放療后定期門診隨訪5年仍未復(fù)發(fā)。復(fù)發(fā)鼻咽癌組均是初次放療后局部復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)的時(shí)間為24～70個(gè)月（中位時(shí)間為56個(gè)月），復(fù)發(fā)時(shí)影像學(xué)查頸部淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處器官未見轉(zhuǎn)移。放療應(yīng)用同步加速調(diào)強(qiáng)放療技術(shù)，腫瘤和腫大淋巴結(jié)（GTV）接受2.5 Gy/次，共28次，總量70 Gy。亞臨床灶和預(yù)防照射區(qū)（PTV）接受常規(guī)照射2.0 Gy/次，共28次，總量56 Gy。均照射1次/d，5次/周，總治療時(shí)間為38 d。

1.2 主要試劑和儀器

Full Moon蛋白磷酸化抗體芯片 （上海生物芯片有限公司）；脫色搖床（ZHWY-304，中國(guó)上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司）；4℃離心機(jī)（Eppendorf 5415R，Eppendorf，德國(guó)）；渦旋振蕩器 （Votex-Genie 2，Scien tic Industries，美國(guó)）；芯片掃描儀（GenePix 4000B，Axon Instruments，美國(guó)）；芯片小型離心機(jī)（ChipMate PMC-082，Tomy，日本）；NanoDrop 2000分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）；c-Jun（Ab-243）抗體及c-Jun（Phospho-Ser243）抗體（美國(guó)Assay Biotech公司）；正常山羊封閉血清、生物素化標(biāo)記二抗（羊抗兔IgG）及DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；BX生物顯微鏡（OLYMPUS，日本）。

1.3 蛋白芯片及免疫組化步驟

1.3.1 蛋白磷酸化抗體芯片的具體步驟

1.3.1.1 蛋白質(zhì)提取及標(biāo)記 使用預(yù)冷的PBS洗滌蛋白質(zhì)提取和標(biāo)記的組織樣本，徹底將雜質(zhì)清洗干凈，把一管裂解磁珠加到組織，加入緩沖液100 μL，渦旋振蕩器中劇烈混合30 s，放置冰上10 min，共重復(fù)5次。后在4℃離心機(jī)中14 000 r/min離心15 min。上清移入試管中。取50 μL的蛋白質(zhì)提取物加到離心柱頂部，1000 r/min離心2 min，收集管底純化蛋白。用NanoDrop測(cè)蛋白濃度。取20 μL（80 μg）蛋白質(zhì)樣品，加到10 μg/μL的Biotin/DMF，室溫下混合均勻，震蕩反應(yīng)2 h，加入35 μL中止液，室溫下震蕩反應(yīng)30 min。

1.3.1.2 阻斷 將蛋白質(zhì)芯片浸沒(méi)在30 mL封閉溶液中，搖床上室溫55 r/min封閉30 min。芯片放入50 mL離心管，加入45 mL Milli-Q，蓋緊后用手震搖10 s，倒掉Milli-Q。換入新的Milli-Q，震搖10 s，倒掉Milli-Q。重復(fù)5次。將芯片充分洗滌，從芯片表面移除封閉液。

1.3.1.3 芯片雜交 把6 mL生物素標(biāo)記蛋白加入放置蛋白質(zhì)芯片的培養(yǎng)皿中，芯片需完全浸沒(méi)，以35 r/min在搖床上反應(yīng)1～2 h，移到洗脫液中，以55 r/min在搖床上反應(yīng)10 min，倒掉洗液，重復(fù)2次。按前述方法用Milli-Q水洗滌，甩掉多余Milli-Q水。

1.3.1.4 熒光孵育 將芯片浸沒(méi)在Cy3-鏈親和素，室溫下避光，以35 r/min在搖床上反應(yīng)1～2 h。移到洗脫液中，55 r/min在搖床上反應(yīng)10 min，把洗液倒掉，重復(fù)2次。如前述方法用Milli-Q水洗滌，甩掉表面多余Milli-Q水，使用壓縮N2將芯片表面吹干。

1.3.1.5 芯片掃描和分析 采用Axon GenePix芯片掃描儀進(jìn)行芯片掃描。采用GenePix Pro 6.0軟件分析芯片圖像，將圖像信號(hào)轉(zhuǎn)化成數(shù)字信號(hào)，后將芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一。磷酸化比值=（復(fù)發(fā)鼻咽癌組磷酸化表達(dá)/復(fù)發(fā)鼻咽癌組非磷酸化表達(dá)）/（初發(fā)鼻咽癌組磷酸化表達(dá)/初發(fā)鼻咽癌組非磷酸化表達(dá)）。芯片結(jié)果用Cluster 3.0軟件進(jìn)行聚類分析，Treeview 1.6軟件用來(lái)將分析結(jié)果轉(zhuǎn)化為可視圖。

1.3.2 免疫組化的具體步驟

1.3.2.1 免疫組化操作步驟 將石蠟包埋的復(fù)發(fā)鼻咽癌組與初發(fā)鼻咽癌組鼻咽癌組織3 μm連續(xù)切片并晾干，二甲苯浸泡脫蠟及水化，高壓修復(fù)抗原，室溫下5%山羊血清封閉30 min，滴加50 μL 1∶80的c-Jun（Ab-243）抗體及c-Jun（Phospho-Ser243）抗體，4℃冰箱過(guò)夜，室溫復(fù)溫30 min，滴加生物素標(biāo)記二抗20 μL，室溫濕盒孵育30 min，DAB顯色，用蘇木精復(fù)染5 min，用梯度酒精使脫水，用二甲苯使透明，用中性樹脂封片，在室溫下將其晾干，顯微鏡下觀察。

1.3.2.2 免疫組化結(jié)果分析 c-Jun及p-c-Jun在復(fù)發(fā)鼻咽癌組與初發(fā)鼻咽癌組鼻咽癌組織中免疫組化染色陽(yáng)性結(jié)果為黃色或棕黃色。采用DMR+Q550型病理圖像分析系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，在每張切片的鼻咽癌組織帶中隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野（200×），用Image-Pro Plus圖像分析軟件對(duì)免疫組化的圖片進(jìn)行分析。蛋白磷酸化表達(dá)水平用p-c-Jun/c-Jun的值表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 蛋白功能分析

篩選出的差異磷酸化蛋白質(zhì)的磷酸化位點(diǎn)、相關(guān)功能及信號(hào)通路采用PhosphoSite Plu磷酸化蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.phosphosite.org/homeAction.do）分析。

2 結(jié)果

2.1 蛋白磷酸化抗體芯片的結(jié)果

2.1.1 蛋白質(zhì)磷酸化抗體的芯片反應(yīng)圖

所有蛋白芯片無(wú)異常信號(hào)，單張芯片重復(fù)點(diǎn)表達(dá)水平吻合良好。采用GenePix Pro 6.0軟件分析芯片圖像，其將熒光強(qiáng)弱轉(zhuǎn)化成芯片反應(yīng)圖。

2.1.2 復(fù)發(fā)鼻咽癌組和初發(fā)鼻咽癌組中差異磷酸化蛋白質(zhì)表達(dá)情況

初發(fā)鼻咽癌組與復(fù)發(fā)鼻咽癌組的蛋白質(zhì)磷酸化水平不同。共篩選出6個(gè)差異磷酸化蛋白質(zhì)，在復(fù)發(fā)鼻咽癌組中KIT、Histone H2A、SEK1、ATP1A1、Synapsin的磷酸化水平均上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。6個(gè)磷酸化蛋白質(zhì)的差異位點(diǎn)也被識(shí)別。見表1。

表1 兩組患者中差異磷酸化蛋白質(zhì)表達(dá)情況

2.1.3 差異磷酸化蛋白質(zhì)的聚類結(jié)果

本研究還對(duì)篩選出的差異磷酸化蛋白質(zhì)進(jìn)行聚類分析，6個(gè)差異磷酸化蛋白質(zhì)的聚類結(jié)果見圖1（封三）。

2.1.4 差異磷酸化蛋白質(zhì)的相關(guān)功能及通路分析

通過(guò)在線網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù) phosphosite（http：//www. phosphosite.org/homeAction.do）分析6個(gè)差異蛋白的磷酸化位點(diǎn)、相關(guān)功能及在信號(hào)通路中的作用，發(fā)現(xiàn)c-Jun、Histone H2AX、SEK1、KIT的蛋白酪氨酸（Tyr）或絲氨酸（Ser）磷酸化，通過(guò)不同的信號(hào)通路參與抑制細(xì)胞凋亡、基因調(diào)控、促細(xì)胞增殖等過(guò)程，可能與鼻咽癌復(fù)發(fā)有關(guān)，還可提示預(yù)后、評(píng)價(jià)療效及提供治療靶點(diǎn)。但ATP1A1、Synapsin的磷酸化水平改變?cè)谀[瘤復(fù)發(fā)中的具體作用還不清楚。目前尚未發(fā)現(xiàn)ATP1A1、Histone H2AX及KIT蛋白參與的相關(guān)信號(hào)通路。6個(gè)差異蛋白的功能、磷酸化位點(diǎn)及在信號(hào)通路中的作用詳見表2。

表2 差異磷酸化蛋白功能及相關(guān)信號(hào)通路

2.2 免疫組化結(jié)果

所有切片均顯色，可見c-Jun、p-c-Jun均表達(dá)于細(xì)胞核，陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果為呈黃色或棕黃色顆粒，見圖2。初發(fā)鼻咽癌組p-c-Jun/c-Jun的比值為（0.713± 0.096），復(fù)發(fā)鼻咽癌組p-c-Jun/c-Jun的比值為（0.621± 0.082），p-c-Jun/c-Jun的比值在兩組間比較有明顯差異（P=0.048）。采用免疫組化比較初發(fā)鼻咽癌和復(fù)發(fā)鼻咽癌組織中c-Jun的蛋白磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)在復(fù)發(fā)鼻咽癌組中，c-jun磷酸化水平更低，與蛋白芯片的結(jié)果相符。

圖2 初發(fā)鼻咽癌和復(fù)發(fā)鼻咽癌組織中c-Jun堯p-c-Jun的表達(dá)（DAB,200×）

3 討論

鼻咽癌是頭頸惡性腫瘤最常見的腫瘤，其發(fā)病率和死亡率均位居首位。鼻咽癌首選治療方法是放射治療。仍有約30%鼻咽癌常規(guī)放療后局部復(fù)發(fā)。鼻咽癌放療后復(fù)發(fā)的機(jī)制目前還不清楚，其可能與細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)、增殖及細(xì)胞凋亡等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路改變有關(guān)。

磷酸化和去磷酸化是蛋白功能修飾調(diào)節(jié)的重要方式，在整個(gè)生命活動(dòng)過(guò)程貫穿始終。當(dāng)?shù)鞍椎牧姿峄腿チ姿峄{(diào)控異常時(shí)，會(huì)導(dǎo)致正常細(xì)胞凋亡、分化及激活信號(hào)傳導(dǎo)通路，最終引發(fā)惡性腫瘤。研究鼻咽癌復(fù)發(fā)相關(guān)磷酸化蛋白質(zhì)水平的改變可能有助于揭示鼻咽癌復(fù)發(fā)的分子機(jī)制。

傳統(tǒng)研究磷酸化蛋白的技術(shù)因其非高效及高通量，不能同時(shí)滿足多重蛋白磷酸化的研究。Full Moon磷酸化蛋白芯片技術(shù)（PEX100）作為一種新型的高通量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)[3]，共包含656種蛋白質(zhì)，其能檢測(cè)蛋白特定位點(diǎn)的磷酸化水平的改變。所選抗體位點(diǎn)均選自文獻(xiàn)且經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，每個(gè)所含磷酸化蛋白位點(diǎn)都設(shè)有磷酸化和非磷酸化的配對(duì)特異抗體，能定量檢測(cè)蛋白的磷酸化水平。蛋白芯片內(nèi)所含抗體位點(diǎn)均設(shè)置多個(gè)重復(fù)（2～6個(gè)重復(fù)），同時(shí)含有陽(yáng)性參照和陰性參照，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確。此外，蛋白芯片還具有集成化、微型化和高通量化的特點(diǎn)，它不但能鑒別出特定蛋白激酶的亞型，還可揭示信號(hào)通路之間的相互聯(lián)系。故本研究采用磷酸化特異蛋白芯片來(lái)鑒別鼻咽癌復(fù)發(fā)相關(guān)的磷酸化蛋白，從而可為鼻咽癌復(fù)發(fā)提供分子機(jī)制和新的治療策略。

本研究首次采用Full Moon蛋白磷酸化芯片來(lái)檢測(cè)初發(fā)鼻咽癌組鼻咽癌和復(fù)發(fā)鼻咽癌組的差異蛋白磷酸化水平。結(jié)果共發(fā)現(xiàn)有6個(gè)差異磷酸化蛋白質(zhì)，其中Histone H2A、SEK1、KIT、ATP1A1及Synapsin 5個(gè)蛋白質(zhì)在復(fù)發(fā)鼻咽癌組鼻咽癌組織中的磷酸化水平顯著升高，c-Jun蛋白在復(fù)發(fā)鼻咽癌組鼻咽癌組織中的磷酸化水平顯著下降。本研究采用免疫組化對(duì)c-Jun蛋白進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果與芯片結(jié)果符合，說(shuō)明芯片結(jié)果真實(shí)可信。

Phospho Site Plus（http：//www.phosphosite.org/）是一個(gè)包含蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)的數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站，里面含有大量蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)信息，包括蛋白的相關(guān)信息如基本結(jié)構(gòu)，功能及相關(guān)信號(hào)通路等。本研究采用此網(wǎng)站分析篩選出的6個(gè)蛋白磷酸化位點(diǎn)變化及在信號(hào)通路中的作用。

在復(fù)發(fā)鼻咽癌組中磷酸化水平上調(diào)的蛋白質(zhì)中，KIT蛋白是Ⅲ型酪氨酸激酶家族的重要成員，KIT激活后，Grb2銜接其Tyr936及703，與SOS蛋白作用，激活Ras蛋白，后激活Mek1/2及ERK1/2，從而影響基因轉(zhuǎn)錄。KIT激活突變會(huì)引起腫瘤，超過(guò)90%的胃間質(zhì)瘤由KIT激活突變所致，鼻咽癌細(xì)胞株中KIT也存在過(guò)表達(dá)。KIT是酪氨酸激酶抑制劑（如伊馬替尼）的靶點(diǎn)之一，KIT的突變導(dǎo)致Tyr激活，致胃腸道間質(zhì)瘤中甲磺酸伊馬替尼耐藥，引起腫瘤復(fù)發(fā)[4]。H2AX屬于組蛋白的一種，其主要參與基因組穩(wěn)定的維持、DNA損傷修復(fù)和抑制腫瘤。DNA雙鏈斷裂引起位于絲氨酸139位C末端的H2AX磷酸化形成“γ-H2AX”，引起下游分子磷酸化，引起生物級(jí)聯(lián)反應(yīng)，觸發(fā)細(xì)胞凋亡。H2AX的翻譯后修飾（如ser139磷酸化）可能與放射抵抗有一定相關(guān)性[5]。放療前測(cè)量γH2AX含量，可預(yù)測(cè)患者的放療敏感性[6]，并對(duì)臨床放療劑量的選擇具有一定指導(dǎo)意義。MKK4/SEK1可磷酸化和激活JNK和p38MAPK。Akt可磷酸化SEK1的Ser78，抑制SEK1介導(dǎo)的凋亡[7]。近來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，MKK4蛋白在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[8]。MKK4蛋白表達(dá)上調(diào)可能在口腔鱗狀細(xì)胞癌與喉鱗癌的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮了促進(jìn)的作用[9]。

在復(fù)發(fā)鼻咽癌組中磷酸化水平下調(diào)的蛋白質(zhì)中，c-Jun屬于轉(zhuǎn)錄因子（activating protein-1，AP-1）家族。在外界信號(hào)如紫外線照射作用下，Jun激酶（JNK）與Jun的N段連接從而使Jun磷酸化。c-Jun的Ser-243磷酸化可促進(jìn)其與SP1結(jié)合，從而增強(qiáng)c-Jun調(diào)控基因的能力[10]。研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌中Ser-243磷酸化減少后，c-Jun蛋白的穩(wěn)定性增加，致瘤能力增強(qiáng)[11]。c-Jun/AP-1是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路末端的轉(zhuǎn)錄因子，與多種細(xì)胞行為如腫瘤細(xì)胞的侵襲、細(xì)胞癌變和轉(zhuǎn)移等有密切關(guān)系。Jun激酶的激活與細(xì)胞凋亡與細(xì)胞增殖有關(guān)。c-Jun通過(guò)抑制凋亡促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。更多的證據(jù)表明JNK在頭頸部腫瘤發(fā)生和進(jìn)展中有非常重要的作用，JNK影響蛋白1（JIP-1）是JNK的較強(qiáng)抑制劑，在鼻咽癌細(xì)胞的增殖中起著重要的陰性調(diào)節(jié)作用，并代表鼻咽癌新的治療靶點(diǎn)[12]。研究表明Jun通路在輻射誘發(fā)的凋亡中有著至關(guān)重要作用，其可為干擾SAPK通路提供新的策略，利于腫瘤的治療[13]。Gee等[14]研究發(fā)現(xiàn)活化的c-Jun可與MAPK信號(hào)通路成員相互作用。c-Jun可能對(duì)預(yù)后有一定的提示作用，但目前尚存在爭(zhēng)議[15-16]。c-Jun蛋白涉及多條相關(guān)通路如MAPK信號(hào)通路、SAPK/JNK信號(hào)通路及ErbB/HER信號(hào)通路等，提示鼻咽癌復(fù)發(fā)是多通路作用的結(jié)果。因此阻斷單一通路靶點(diǎn)可能無(wú)法成功阻斷腫瘤下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，提示多靶點(diǎn)藥物合并治療可能提高治療效果，有利于克服鼻咽癌復(fù)發(fā)。

綜上所述，本研究首次采用蛋白芯片篩選復(fù)發(fā)鼻咽癌組和初發(fā)鼻咽癌組的差異磷酸化水平蛋白，共選出6個(gè)差異蛋白，已通過(guò)免疫組化驗(yàn)證其中的c-Jun蛋白，其他的蛋白有待進(jìn)一步驗(yàn)證。c-Jun蛋白磷酸化蛋白涉及抑制細(xì)胞凋亡、參與基因調(diào)控及促細(xì)胞增殖等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等，可能與鼻咽癌復(fù)發(fā)有關(guān)，還可提示預(yù)后及提供治療靶點(diǎn)。本研究篩選出的差異磷酸化蛋白不僅能揭示鼻咽癌復(fù)發(fā)的分子機(jī)制，也可為臨床復(fù)發(fā)鼻咽癌治療提供新的策略，還可為鼻咽癌放療效果提供新的預(yù)測(cè)因子。

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ExPression of c-jun in nasoPharyngeal carcinoma and the effects on the recurrent nasoPharyngeal carcinoma

FANG Min1SONG Tao1WU Shixiu2WU Shuqiang1JIA Yongshi1

1.Department of Radiotherapy,Zhejiang Provincial People's Hospital,Zhejiang Province,Hangzhou 310014,China; 2.Department of Radiotherapy,Hangzhou Cancer Hospital,Zhejiang Province,Hangzhou 310002,China

Objective To analyze expression of c-jun in nasopharyngeal carcinoma and the effects on the recurrent nasopharyngeal carcinoma.Methods Four primary nasopharyngeal carcinoma tissues (pNPC group)and four relapsed nasopharyngeal carcinoma tissues(rNPC group)were obtained from the Department of Otolaryngology,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College.The differentially phosphorylation level of proteins in rNPC group and pNPC group were identified by Full Moon BioSystems'Phospho Explorer antibody array and this was followed by cluster analysis.Immunohistochemistry was performed on some of differentially phosphorylated protein 40 cases of primary and relapsed nasopharyngeal carcinoma tissues were selected for immunohistochemical validation,from August 2003 to May 2010 in Pathology Department of the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College,and they were divided into primary nasopharyngeal carcinoma group (n=20)and relapsed nasopharyngeal carcinoma group (n=20).Results The phosphorylation levels of proteins in two groups were different and six significantly differentially phosphorylated proteins were identified including c-Jun(P=0.030),Histone H2A(P=0.044),SEK1(P=0.048),KIT(P=0.042),ATP1A1(P= 0.007),and Synapsin (P=0.023).Among them,compared to pNPC group the phosphorylation levels of five proteins (ATP1A1,Histone H2A,KIT,SEK1 and Synapsin)in tissues of the rNPC group were increased,the up-regulated ratio was 1.08,1.14,1.22,1.22,1.22 respectively,and one protein was decreased(c-Jun),the down-regulated ratio of c-Jun was 0.87.Some of the diferentially phosphorylated proteins including c-Jun,Histone H2AX,SEK1 and KIT maybe play crucial roles in the recurrence of NPC.The phosphorylation levels of c-Jun was also decreased in rNPC group(P=0.048) by immunohistochemistry.Conclusion The phosphorylation levels of c-Jun is decrease in tissues of rNPC,which maybe play crucial roles in the recurrence of NPC.The phosphorylated c-Jun participates in the processes of DNA damage repair,apoptosis,cell migration,invasion,signal transduction and so on,and may indicates prognosis and provides theraputic targets.

Nasopharyngeal neoplasmas;Recurrence;c-Jun;Phosphorylation chip

R730.5

A

1673-7210（2015）11（a）-0035-06

2015-07-10本文編輯：任 念）