螺旋涂布法評價聯(lián)合誘導制備大鼠肝S9的活性大小

單 純，張鳳蘭，崔生輝

(中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

沙門氏菌致突變(Ames)試驗現(xiàn)廣泛應用于檢測食品添加劑、化妝品等的致突變性，在其標準操作中，需將細菌測試菌株與受試物以及可選外源性代謝活化系統(tǒng)(S9)三者混合進行熔化瓊脂覆蓋培養(yǎng)。但實驗周期較長、需用儀器設(shè)備多、方法要求嚴格、操作步驟復雜、實驗成本高，在篩選、抽檢大量檢品時有一定難度。沙門氏菌螺旋涂布致突變檢測技術(shù)是新開發(fā)、低成本、自動化高、試驗周期短的一種微生物檢測技術(shù)，目前國內(nèi)外實驗室認知并使用該技術(shù)較少［1］。本實驗室建立該法目的主要是以期最終替代經(jīng)典回復突變試驗對大量未知樣品的快速篩檢和食品化妝品大量抽檢工作改善Ames試驗梯度稀釋的低效率問題。體外代謝活化劑(S9)常使用“多氯聯(lián)苯”(PCBs)作為誘導劑。PCBs已被國際上定為致癌劑、長久不宜消除的有機污染物，已禁止生產(chǎn)使用。目前常采用的如3－甲基膽蒽等單獨誘導制備誘導劑，存在活化程度不穩(wěn)定、敏感性低、無指標進行有效控制等缺陷，試驗結(jié)果出現(xiàn)幾十到上百倍的誤差［2］。故本實驗室采用苯巴比妥和β-苯黃酮(BF)聯(lián)合誘導大鼠肝S9以替代PCBs，并比較不同來源S9活性優(yōu)劣［3］。目前國內(nèi)外保存S9均保存于液氮或－80℃冰箱中，反復凍融造成酶活大大降低，故本實驗室在酶保護劑作用下將S9呈液態(tài)長期置－20℃冰箱中，替代傳統(tǒng)酶保存方法。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及飼養(yǎng)條件

SPF級 SD大鼠24只，雄性，體重180～200 g，由中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源中心提供【SCXK(京)2009-0017】，實驗在中國食品藥品檢定研究院三級實驗動物室進行【SYXK(京)2011-0008】，溫度22℃ ～24℃，相對濕度40% ～45%，日光燈12 h照明。大鼠繁殖顆粒飼料和去離子水，自由飲水。

1.2 主要試劑及儀器

β-苯黃酮，苯巴比妥鈉，2-氨基芴，冷凍離心機，比濁儀，CO2培養(yǎng)箱，螺旋涂步儀，市售S9(多氯聯(lián)苯誘導制得)。

1.3 分組和劑量設(shè)定

聯(lián)合誘導組為苯巴比妥鈉+萘黃酮80 mg+100 mg/kg，另設(shè)溶劑對照組(玉米油)每組大鼠12只。

1.4 動物處理及S9制備

聯(lián)合誘導:給藥組于處理1、2、3 d大鼠灌胃給予苯巴比妥鈉+萘黃酮，每天1次，劑量為80 mg+100 mg/kg，給藥體積為2 mL/kg。大鼠在首次注射后4 d處死，處死前12 h禁食不禁水;對照組給予玉米油2 mL/kg，余下步驟同一般肝S9制備方法。S9分裝于凍存管中，速凍后，部分保存于超低溫冰箱中用于實驗驗證活性［4－5］。

1.5 Ames試驗

增菌:將來自MH主板的單個菌落接種至TSB營養(yǎng)肉湯的20 mL無菌錐形瓶中。接種后的錐形瓶在37℃、125 r/min的旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)箱中孵育16 h。將培養(yǎng)物于5080 r/min，4℃，離心10 min，棄去上清，用0.15 mol/L PBS洗滌，連續(xù)離心3次。后將培養(yǎng)物用比濁儀測濁度值在0.8～1之間，即約每毫升1×109至2×109個細胞的密度，存放于冰箱直到需要進行生物檢驗［6］。采用平板摻入法，選陽性對照物為2-氨基芴(2-AF，100 μg/mL)，陽性組每皿加 2-AF溶液0.1 mL，每組3個平行平板，三種S9(聯(lián)合誘導、對照、市售)分別設(shè)加S9混合液(濃度10%)0.5 mL的陽性組，菌株TA98、TA100通過鑒定都符合試驗要求。經(jīng)其余同一般Ames試驗。試驗重復1 次［7－9］。

1.6 螺旋涂布評價S9活性方法的建立

TA100比濁濃度為109數(shù)量級后用于實驗(比濁值:0.8～1)。

螺旋涂布儀每皿勻速涂布TA100原菌液20 μL(Unif，20 μL)，待干后(＜1 min)均速涂布 20 μL 陽性劑 2-AF(100 μg/mL)，靜置 ＜1min，最后以對數(shù)遞減(log，50 μL)分別涂布 50 μL 三種肝 S9(市售、聯(lián)合誘導、對照)。實驗保證每次涂布平皿起點相同，依次覆蓋從而形成一個阿基米德螺旋。涂布完畢待干后倒扣于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，接種受試物的營養(yǎng)最低需求培養(yǎng)板上將選擇性地生長突變菌種。突變體菌落采用細菌菌落計數(shù)儀計數(shù)［1，10 －11］。

1.7 肝S9低溫保存法的建立

20 mmol/L Tris-HCl(pH=7.4)、1 mmol/L CaCl2、50%丙三醇、47%S9原液制備低溫儲存液。制備后的低溫儲存液將呈液態(tài)保存于－20℃冰箱中。用Ames實驗方法，選擇菌株 TA98、TA100，分別于配制后1周、1個月、3個月驗證該儲存液活性［12－13］。

2 結(jié)果

2.1 Ames試驗菌株回變數(shù)結(jié)果

TA98、TA100兩種菌株分別采用聯(lián)合誘導法制備和市售S9活化的陽性組回變數(shù)無較大差異，采用聯(lián)合誘導法制備、市售S9陽性組的回變數(shù)均超過相同條件下對照組大鼠制備S9回變數(shù)的2倍以上，出現(xiàn)陽性結(jié)果。兩種S9活性間無顯著性差異，且均高于對照組大鼠S9活性(P ＜0.05，表1)。

2.2 螺旋涂布實驗結(jié)果

涂布用S9濃度選擇較合理(38%)，能做出比較好的濃度梯度，線性關(guān)系明顯。涂布平皿阿基米德螺旋清晰可見，菌落回變數(shù)隨螺旋由內(nèi)向外依次遞減?；刈償?shù) S9涂布量在1.48～6.62 μL/μL菌液濃度下，有較好的致突變活性，檢測組菌落數(shù)均達到自發(fā)回變組及陽性對照組相應菌落數(shù)的2倍以上，可以判定結(jié)果陽性(P﹤0.05，表2，圖1)。

2.3 Ames實驗驗證肝S9低溫保存法的可行性

Ames驗證活性結(jié)果表明:在3個月內(nèi)，S9儲存液活性與原液活性相當，加入的離子及甘油保護劑不會對其活性造成影響(P﹤0.05，表3，4)。

3 討論

在體外致突變試驗中體外代謝活化劑是實驗中必不可少的重要環(huán)節(jié)。目前國內(nèi)實驗室多使用市售S9上清液，一般300元/2mL/支，價格昂貴，使實驗成本大大增加;實驗結(jié)果表明，實驗室自制S9活性與市售S9活性相當，無顯著性差異。選擇聯(lián)合誘導制備大鼠肝勻漿S9，不僅試劑方便夠得，減少污染，且可以大大降低實驗成本，在某些條件下可以替代市售S9用于實驗。沙門氏菌螺旋涂布法的原理與Ames及其同事發(fā)明的標準平板插入法的原理一致;即，在存在或不存在外源性代謝活化系統(tǒng)的情況下，暴露于一定劑量范圍的受試物后突變細菌受試菌株出現(xiàn)選擇性生長。不同的是，在螺旋涂布法中，這些步驟是自動化的，使用特定機器依次將細菌、受試物和S9混合物加入到旋轉(zhuǎn)瓊脂培養(yǎng)板上，依次覆蓋從而形成一個阿基米德螺旋，最終密度均勻的細菌將暴露于一系列連續(xù)濃度梯度的受試物中。在37物加孵育48～72h后，接種受試物的營養(yǎng)最低需求培養(yǎng)板上將選擇性地生長突變菌種。突變體菌落采用細菌菌落計數(shù)儀計數(shù)，該計數(shù)儀可對螺旋路徑上的菌落進行計數(shù)。計數(shù)儀與裝有特別設(shè)計的用于螺旋涂布培養(yǎng)板分析程序的個體計算機相連。經(jīng)分析可得出突變體的數(shù)目、大小和位置，通過這些信息，可得出每塊螺旋涂布培養(yǎng)板的劑量-反應曲線［14－15］。

表1兩種誘導方法制備的S9陽性誘變劑Ames試驗回變數(shù)結(jié)果(±SD)Tab．1 Results of the Ames assay using S9 from 2 souces

表1兩種誘導方法制備的S9陽性誘變劑Ames試驗回變數(shù)結(jié)果(±SD)Tab．1 Results of the Ames assay using S9 from 2 souces

組別Group S9混合液(mL)S9 mixture(mL)菌落回復突變數(shù)The number of revertant colonies自發(fā)回變Spontaneous revertant colonies 0 62±11 144±7+S9(市售)+S9(Commercially available) 0.5 1199±211 1378±185+S9(聯(lián)合誘導)+S9(Induction combined with PB and BF) 0.5 1327±148 1662±124+S9(對照組)+S9(Control group)0.5 812±102 951±68

表2 螺旋涂布法驗證S9致突變活性Tab．2 Results of the activation of S9 using spiral coating technique

圖1 螺旋涂布法驗證S9致突變活性TA100菌回復突變數(shù)情況Fig．1 The reverse mutation number of Salmonellatyphimurium histidine strains TA100 using spiral coating technique

表3Ames法驗證S9低溫儲存液致突變活性(TA98、TA100，ˉx±SD)Tab．3 Results of the activation of S9 stored in －20℃ refrigerator using the Ames assay

螺旋涂布法可將一系列濃度梯度的受試物涂布在單個瓊脂板上，促進了其在致突變性研究領(lǐng)域的使用。沙門氏菌螺旋涂布致突變檢測技術(shù)自Houk［16］發(fā)明此法自今，已成為國外實驗室致突變檢測技術(shù)中多項研究的選擇。其被國際公職分析化學工作者協(xié)會(AOAC)批準，是APHA推薦的致突變檢測替代方法。國內(nèi)實驗室建立和應用該實驗方法十分罕見，查閱國內(nèi)、外文獻報導，各實驗室還沒有一整套規(guī)范的操作方法及結(jié)果評價體系。本實驗室已對涂布用培養(yǎng)基的配制、受試物的前處理及平皿涂布方式、細菌接種數(shù)量及操作順序、穩(wěn)定自發(fā)回變數(shù)范圍、確定細菌回復突變數(shù)等逐一成功建立。研究結(jié)果表明，在進行與標準法相同劑量范圍的檢測時，螺旋涂布法僅需要約1/10的純化合物樣本量以及1/40～1/80的復雜混合物樣本量，劑量-反應分析數(shù)據(jù)來源于單個瓊脂培養(yǎng)板而非一系列培養(yǎng)板。證實了其方法的的突出特點“敏感”、“廣譜”、“快速”、“低廉”。

國內(nèi)外實驗室S9肝勻漿系統(tǒng)多保存在液氮罐或－80℃冰箱中，每次使用前需室溫融化，大大降低酶的活性和利用率。本實驗室將制成品S9經(jīng)酶保護劑作用，在液態(tài)下長期于－20℃冰箱儲存。結(jié)果表明，通過3個月時間的驗證，加入甘油保護劑不會對S9活性造成影響，避免了反復凍融使酶活性降低。最終確定一套實驗室制備規(guī)范，達到誘導劑易購買、對環(huán)境、人類危害輕微、成本低廉、制得的代謝活化劑酶生物活性高且穩(wěn)定的目的。為本實驗室今后大量、快速、準確篩檢食品、保健食品和化妝品打下物質(zhì)基礎(chǔ)。

［1］ Claxton，L．D．，V．S．Houk，S．Warren．Methods for the spiral Salmonella mutagenicity assay including specialized applications［J］．Mutat Res，2001.488(3):241 －257．

［2］ 王亞其，肖凱，劉玉清，等．兩種誘導方法制備大鼠肝S9在兩種遺傳毒性試驗中活性比較．現(xiàn)代預防醫(yī)學［J］，2006.33(4):4．

［3］ Garcia Franco，S．，G．Dominguez，J．C．Pico．Alternatives in the induction and preparation of phenobarbital/naphthoflavoneinduced S9 and their activation profiles［M］．Mutagenesis，1999.14(3):323－326．

［4］ Woodall，G．M．，Jr．，W．C．Dauterman，D．M．DeMarini．Effect of dietary casein levels on activation of promutagens in the spiral Salmonella mutagenicity assay．II．Studies with induced rat liver S9［J］．Mutat Res，1996.360(2):127 －143．

［5］ Atsushi Hakura，S．S．，Shigeki Sawada，et al．An improvement of the Ames test using a modified human liver S9 preparation［J］．Journal of Pharmacological and Toxicological Methods，2002.169:4．

［6］ Maron，D．M．a(chǎn)nd B．N．Ames．Revised methods for the Salmonella mutagenicity test［J］．Mutat Res，1983.113(3 －4):173－215．

［7］ Aubrecht．Bioluminescent Salmonella reverse mutation assay:a screen for detecting mutagenicity with high throughput attributes［J］．Mutagenesis，2007.22(5):335 －342．

［8］ Jemnitz，K．Comparative study in the Ames test of benzo［a］pyrene and 2-aminoanthracene metabolic activation using rat hepatic S9 and hepatocytes following in vivo or in vitro induction［J］．Mutagenesis，2004.19(3):245 －250．

［9］ Claxton，L．D．，A．Umbuzeiro Gde，D．M．DeMarini．The Salmonellamutagenicity assay:the stethoscope ofgenetic toxicology for the 21st century［J］．Environ Health Perspect，2010.118(11):1515－1522．

［10］ Houk，V．S．，S．Schalkowsky，L．D．Claxton．Development and validation of the spiral Salmonella assay:an automated approach to bacterial mutagenicity testing［J］．Mutat Res，1989.223(1):p．49－64．

［11］ Claxton，L．D．Evaluating the relationship of metabolic activation system concentrations and chemical dose concentrations for the Salmonella spiral and plate assays［J］．Mutat Res，1991.253(2):127－136．

［12］ Yang，Z．Rapid purification of truncated Taq DNA polymerase Stoffel fragment by boiling lysis of bacterial expression cultures［J］．Biotechnol Appl Biochem，2008.50(Pt 2):71－75．

［13］ Youngblom，J．Extended stability of Taq DNA polymerase and T4 DNA ligase at various temperatures［J］．Biotechniques，2003.34(2):264－266，268．

［14］ B．N．Ames，J．M．，E．Yamasaki．Methods for detecting carcinogensand mutagenswith the Salmonella/mammalian microsome mutagenicity test［J］．Mutat 1975.31:17．

［15］ Ames， B．N． Identifyingenvironmentalchemicalscausing mutations and cancer［J］．Science，1979．:p．6．

［16］ Association of Official Analytical Chemists． General referee reports［S］．J Assoc Off Anal Chem，1989.72(1):62 －137．